最全的G418筛选稳定表达细胞系总结4
G418原理及筛选方法
G418原理及筛选方法原理分析转化得功能与表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。
外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内,根据细胞类型，至多80%得进入核内得外源DNA得到瞬时表达。
极少数情况下，进入细胞得外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，最终整合进细胞染色体。
细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一左意味着表达，只有整合到表达区得基因才会表达,而且整合到不同得染色体区段得外源基因得表达得量也就是不同得。
由于摄取、整合、表达外源基因就是小概率事件，通常根据新表型筛选軽軽体。
一般情况下这种新表型由共转染得编码抗生素抗性基因提供。
细菌Tn5转座子序列（ne。
抗性基因）携带得氨基糖昔磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
G418就是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大靈素、卡那靈素相似，它通过影响80S 核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核与真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物与哺乳动物细胞，也包括原生动物与蠕虫。
就是稳定转染最常用得选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适得地方后，则能启动neo基因编码得序列转录为niRNA,从而获得抗性产物氨基糖昔磷酸转移酶得高效表达,使细胞获得抗性而能在含有G418得选择性培养基中生长。
G418得这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上0418有杀菌作用, 所以有人主张转染时不加英它抗生素。
英实G418本身有很好得杀菌效果，在用G418进行筛选得过程中很少会发生污染。
但有一点，其实我觉得问题也不就是很大，那就就是:在老外得一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。
我想她得想法可能就是脂质体对细胞膜有影响,可能此时加抗生素对细胞损伤较大。
因为庆大离素、链鑫素.0418 均就是氨基糖貳类药物，其药理作用完全一样。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结1
最全的G418筛选稳定表达细胞系G418是一种广谱抗生素，可以选择性地杀死没有正确整合的质粒DNA转染的细胞，从而筛选出具有稳定表达的细胞系。
G418筛选是基因转染中常用的一种选择方法，通过对G418敏感性的筛选来选择转化基因。
本文将G418筛选步骤和优化方案。
G418筛选步骤细胞株选取首先需要选取稳定转染所需的细胞株。
需要保证选取的细胞株生长健康、分裂正常、易于培养以及不易死亡。
常用的细胞株有293T、CHO、HEK293。
转染在开始筛选之前，需要将目的基因转染进入所选细胞株。
目前常用的转染方法有磷酸钙共沉淀法、电转染法和脂质体转染法等，需要根据实际情况选择转染方法。
初步筛选完成转染后，需要在培养基中加入G418，通常的加药浓度不超过1mg/mL，推荐浓度为400μg/mL。
在转染后24-48小时内开始进行初步筛选，通过观察细胞的生长状态以及基因表达情况来判断筛选效果。
细分筛选初步筛选后，需要将G418的浓度逐步增加，通常第二轮加药浓度是初步筛选浓度的2倍，第三轮加药浓度是第二轮的2倍。
逐渐递增药物浓度，可以让敏感的细胞死亡，生存的细胞逐渐表达目的基因，从而得到稳定的细胞株。
稳定维持筛选到稳定的细胞后，需要对细胞进行定期维护。
通常可以在培养基中加入适当的G418浓度，维持稳定表达的转染细胞。
优化方案药物浓度G418的加药浓度直接影响到细胞死亡率和筛选效果。
在进行筛选前需要先进行剂量反应实验，通过不同浓度药物的处理，检测细胞生长状态和基因表达情况。
细胞密度传统细胞密度在98%时，死亡率是最高的。
因此，为了降低G418对细胞的毒性，可以将细胞密度控制在70-80%左右。
同时，过稀的细胞密度也会影响到筛选效果，因此需要根据实际情况进行调整。
培养时间筛选时间也直接影响到G418对细胞的毒性程度和筛选效果。
不同的细胞株和实验条件下，对筛选时间的选择有所不同。
通常初步筛选时间在24-48小时，细分筛选筛选时间需要根据实际情况进行判断。
G418筛选稳定表达细胞系PROTOCOL
1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。
2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。
3.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。
4.加G418筛选: 吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。
5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。
方法同4。
6.确定最佳筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。
在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的G418的量在10天前就看不到活细胞了。
假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度！心得：由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。
比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml。
这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三个浓度进行筛选。
通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。
a 转染：转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时；b 加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。
c 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。
G筛选稳定表达细胞系经验总结图文稿
G筛选稳定表达细胞系经验总结Company number【1089WT-1898YT-1W8CB-9UUT-92108】G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况,和大家分享.没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个，按比例1/300孔内应该有几十个，事实上，它们几乎全死光了，只有几个。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
G418原理及筛选方法
G418原理及筛选⽅法G418原理及筛选⽅法原理分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染⾄宿主细胞染⾊体。
外源基因进⼊细胞后，部分能够通过细胞质进⼊细胞核内，根据细胞类型，⾄多80%的进⼊核内的外源DNA得到瞬时表达。
极少数情况下，进⼊细胞的外源DNA通过系列⾮同源性分⼦间重组核连接，最终整合进细胞染⾊体。
细胞基因组⾃由部分表达，所以整合并不⼀定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，⽽且整合到不同的染⾊体区段的外源基因的表达的量也是不同的。
由于摄取、整合、表达外源基因是⼩概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。
⼀般情况下这种新表型由共转染的编码抗⽣素抗性基因提供。
细菌T n5 转座⼦序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成⽆毒形式。
G418是⼀种氨基糖类抗⽣素，其结构与新霉素、庆⼤霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能⽽阻断蛋⽩质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原⽣动物和蠕⾍。
是稳定转染最常⽤的选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地⽅后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从⽽获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的⾼效表达，使细胞获得抗性⽽能在含有G418的选择性培养基中⽣长。
G418的这⼀选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等⽅⾯得以⼴泛应⽤。
在进⾏转染时细胞膜受到影响，抗⽣素可能对细胞产⽣较⼤影响，加上G418有杀菌作⽤，所以有⼈主张转染时不加其它抗⽣素。
其实G418本⾝有很好的杀菌效果，在⽤G418进⾏筛选的过程中很少会发⽣污染。
但有⼀点，其实我觉得问题也不是很⼤，那就是：在⽼外的⼀本实验⼿册中提到，在脂质体转染时所⽤培养基中最好不加任何抗⽣素。
我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗⽣素对细胞损伤较⼤。
因为庆⼤霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作⽤完全⼀样。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结2
Protocal1.G418的配制：取1g G418溶于1ml 1M的HEPES液中，加蒸馏水至10ml，过滤消毒，4度保存。
2.细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6小时左右开始加药。
3.制备筛选培养基：在100ug/ml～1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100ug/ml、400ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基。
4.加G418筛选: 吸除培养孔中培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基。
5.换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每3~5天更换一次筛选培养基。
方法同4。
6.确定最佳筛选浓度：在筛选10～14天内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。
在第一轮就筛选出最佳G418浓度的可能性不大，最有可能的是出现这种情况：用某一浓度G418的量在筛选14天后还不能杀死细胞，而用下一个梯度的G418的量在10天前就看不到活细胞了。
假如是400ug/ml不能杀死细胞，而800ug/ml在第5天就把所有细胞都杀死了，则可以再用500ug/ml、600ug/ml、700ug/ml进一步筛选，以确定最佳筛选浓度！心得：由于特性明确的细胞系G418的最佳用量还是比较稳定的，所以有时候不需要在这么大范围内进行筛选。
比如说你要转染NIH3T3细胞，现在我告诉你我测试过NIH3T3细胞对G418的敏感性，我用的筛选浓度是200 ug/ml。
这时你就可以做150ug/ml、200ug/ml、300ug/ml三个浓度进行筛选。
通过预实验确定了最佳筛选浓度后，就可以做稳定转染了。
a 转染：转染后培养24小时或者更长，到细胞增长接近汇合时按1：4密度传代，继续培养，待细胞密度增至50％～70％汇合时；b 加G418:去掉培养液，PBS洗一次，加入按最佳筛选浓度配制好的G418筛选培养基。
G筛选稳定表达细胞系经验总结
G筛选稳定表达细胞系经验总结Document number【980KGB-6898YT-769T8CB-246UT-18GG08】G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况,和大家分享.没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个，按比例1/300孔内应该有几十个，事实上，它们几乎全死光了，只有几个。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
G418筛选
从G418筛选，转染到单克隆化的总结筛选之前确定G418浓度：1.由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2.G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3.汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4.G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1.由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
这时药物浓度可以降至200ug/ml。
2.加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。
转染、G418筛选、单克隆化的总结
转染、G418筛选、单克隆化的总结筛选之前确定G418浓度：1，由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2，G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3，汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
这时药物浓度可以降至200ug/ml。
2，加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。
G418原理及筛选方法
G418原理及筛选方法原理分析转化得功能与表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。
外源基因进入细胞后,部分能够通过细胞质进入细胞核内,根据细胞类型,至多80%得进入核内得外源DNA得到瞬时表达。
极少数情况下,进入细胞得外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接,最终整合进细胞染色体。
细胞基因组自由部分表达,所以整合并不一定意味着表达,只有整合到表达区得基因才会表达,而且整合到不同得染色体区段得外源基因得表达得量也就是不同得。
由于摄取、整合、表达外源基因就是小概率事件,通常根据新表型筛选稳定转染体。
一般情况下这种新表型由共转染得编码抗生素抗性基因提供。
细菌T n5 转座子序列(neo抗性基因)携带得氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
G418就是一种氨基糖类抗生素,其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似,它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核与真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、植物与哺乳动物细胞,也包括原生动物与蠕虫。
就是稳定转染最常用得选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适得地方后,则能启动neo基因编码得序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶得高效表达,使细胞获得抗性而能在含有G418得选择性培养基中生长。
G418得这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
在进行转染时细胞膜受到影响,抗生素可能对细胞产生较大影响,加上G418有杀菌作用,所以有人主张转染时不加其它抗生素。
其实G418本身有很好得杀菌效果,在用G418进行筛选得过程中很少会发生污染。
但有一点,其实我觉得问题也不就是很大,那就就是:在老外得一本实验手册中提到,在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。
我想她得想法可能就是脂质体对细胞膜有影响,可能此时加抗生素对细胞损伤较大。
因为庆大霉素、链霉素、G418均就是氨基糖甙类药物,其药理作用完全一样。
G418筛选稳定表达细胞系构建技术原理
G418筛选稳定表达细胞系构建技术原理原理分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。
外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。
极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。
细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。
由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。
一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。
细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。
是稳定转染最常用的选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
Ｇ418的这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。
其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。
但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。
我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。
因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。
转染、G418筛选、单克隆化的总结
1，由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
3，汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%加药时间和维持浓度2，加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。
一般是转染48小时后加入抗生素。
挑出单克隆后就可以用维持浓度，一般是筛选浓度的1/2。
筛选时的培养液1，死亡的细胞会裂解释放出有害物质，导致那些有neo表达的阳性细胞死亡，即非选择性死亡，因此要及时换液3，适当增加血清浓度。
1，问题1。
做hela细胞的筛选，现在已经筛选3周，在6孔板中已经长出一些细胞簇，想把它挑到96孔板中，就用2ul胰酶消化，在消化过程中，胰酶扩散，细胞已经四散开，和周围的其它细胞簇融合在一起（我的细胞簇离的很近），就是说几个细胞簇被胰酶融合在一起，那样根本没有办法做下去了，该怎么办？b、加入胰酶后，稍过几秒钟就可以吸走消化液了，不用吸干净，然后放到37度温箱中继续作用1MIN，这时，消化酶可以继续作用的，又可避免胰酶扩散；d、具体消化的时间，你注意摸索一下，如果在步骤2中显微镜下见细胞尚未完全松散开，可以再重复的，直到松散开，能够被吸走为止。
2，问题2。
筛选成功的概率：只要有抗性加压筛选，挑选到的机率还是比较大的。
一般能挑到稳定表达的概率我认为大概有70－80％，但是想挑到表达量高且能稳定表达的，不大容易。
这个可能是在染色体上，合适的整合位点太少的缘故。
想请教各位有经验的高手，你们做稳定转染时有此发现吗？我的也是，而且好象还有好几种不同类型的细胞。
不过，我转的是一种抑癌基因。
5，从单克隆化时开始，就要加大营养，血清清和生长因子。
方法1：单克隆细胞的培养就是这样的,我现在作了15个96孔板的单克隆,总共才得到大约50株单克隆在做时候应保证每个孔中的细胞是一个,因此,我一般在200毫升的培养液中加入小于96个的细胞,这样平均到每个孔中因该可以由满意的结果你所说的现象我也遇到过,我也百思不得其解,只好做多一点的96孔板来补充。
G418筛选
从G418筛选，转染到单克隆化的总结筛选之前确定G418浓度：1.由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2.G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3.汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4.G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1.由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
这时药物浓度可以降至200ug/ml。
2.加抗生素的时机，主要是考虑插入到细胞基因组的抗性基因是否已经得到表达。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结3
最全的G418筛选稳定表达细胞系G418是最常用的筛选剂之一，可用于筛选稳定表达的质粒载体含G418抗性基因的细胞系。
在这篇文档中，我们将介绍如何进行G418筛选，以及如何评估稳定表达的细胞系。
G418的使用G418是一种广谱抗生素，能够影响细胞内的核糖体功能。
在含有G418抗性基因的质粒载体中，这一基因将在细胞内表达，从而使细胞对G418具有抗性。
因此，通过加入G418到培养基中，可以筛选出含有G418抗性基因的细胞。
G418的浓度和作用时间很重要。
一般情况下，使用0.4 ~ 1 mg/mL的G418浓度，作用时间为72小时。
当G418加入到培养基中后，需要每两天换一次培养基，并检查细胞生长情况。
如何评估稳定表达的细胞系进行G418筛选后，需要评估哪些细胞系是确实稳定表达了目标基因。
以下是常用的评估方法：1. RT-PCRRT-PCR是常见的定量分析方法之一，可以用于测量目标基因在细胞中的表达水平。
通过提取RNA，用逆转录酶将RNA转录成cDNA，然后用PCR来放大目标区域。
在最后的荧光测量中，可以测量出目标基因的表达水平。
RT-PCR的优点是灵敏度高，且可以针对不同寡核苷酸的序列进行定量分析。
2. Western BlotWestern Blot是常见的蛋白质分析方法之一，可以用于测量目标蛋白在细胞中的表达水平。
通过提取蛋白质，将其分离成各种大小不同的片段，然后用抗体来特异地检测目标蛋白。
Western Blot的优点是能够定量分析特定蛋白，且具有较高的灵敏度。
3. 细胞功能实验在某些情况下，需要通过测量细胞的功能来评估细胞系的稳定表达水平。
例如，对于表达了RNA干扰分子的细胞系，可以通过测定下游基因的表达量或细胞增殖率来检验RNA干扰是否成功实现。
G418筛选稳定表达细胞系是一种常见的实验方法。
在筛选前，我们需要准备含有G418抗性基因的质粒载体，然后在适当的时间和浓度下进行G418筛选。
G418筛选稳定转染步骤
1.G418的配制：方案一：300mgG418加入3ml PBS溶液，浓度为100mg/ml，完全溶解后，0.22um过滤，-20℃保存。
方案二：（1）配制1M HEPES：23.8g HEPES（缓冲能力更强）粉末溶于100ml ddH2O，10NNaOH（加量较多）调节pH至7.3，过滤除菌（较难过滤），4℃保存，终浓度为1mol/L。
（2）5g G418溶于10ml 1M HEPES（pH7.3），终浓度为500mg/ml，-20℃保存。
注：实验中采用方案二时效果较好。
2.制备筛选培养基：用培养基将G418稀释为0 ug/ml、200 ug/ml、300 ug/ml、400 ug/ml、500 ug/ml、600 ug/ml、700 ug/ml、800 ug/ml、900ug/ml、1000ug/ml、1100ug/ml、1200ug/ml24孔板，每孔1ml培养基（含有G418的完全培养基），每个浓度4个重复，则每次换液需各个浓度培养基4ml，现用现配。
200ug/ml300ug/ml400ug/ml500ug/ml600ug/ml700ug/ml800ug/ml900ug/ml10 00ug/ml1100 ug/ml1200 ug/ml3ml完全培养基998.4997.6996..2994.4993.6992..2990.4G418(500mg/ml)1.6ul2.4ul3.2ul4.0ul4.8ul5.6ul6.4ul7.2ul8.0ul8.8ul9.6ul3.细胞培养：将冻存的细胞复苏培养，，传代3至4次使细胞达到良好的生长状态,铺24孔板（200/孔），12h换液，加筛选培养基培养。
4.确定G418最佳筛选浓度：将培养孔中培养基吸除，PBS洗涤一次，每孔加入不同浓度筛选培养基，隔天更换一次筛选培养基，培养10-14天，以最低细胞全部死亡浓度为基准。
注：实验中所确定的最佳筛选浓度为1200ug/ml。
G418筛选稳定表达细胞株精要总结
G418筛选稳定表达细胞系总结一分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。
外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。
极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。
细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。
由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。
一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。
细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。
G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性 ,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞 ,也包括原生动物和蠕虫。
是稳定转染最常用的选择试剂。
当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后 ,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达 ,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
Ｇ418的这一选择特性 ,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。
其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。
但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。
我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。
因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。
(完整版)G418筛选稳定表达细胞系经验总结
G418筛选稳定表达细胞系经验总结我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。
有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。
筛选之前确定G418浓度：1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。
2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。
但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。
neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。
在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。
3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。
具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。
一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。
理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。
筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。
加药时间和维持浓度1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。
所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。
随着细胞的代谢G418的浓度和活性都会下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。
最全的G418筛选稳定表达细胞系总结4
最全的G418筛选稳定表达细胞系G418，又称为geneticin，是一种广谱抗生素，常用于筛选稳定转染的哺乳动物细胞系。
G418能够靶向细胞内的Neo基因表达，使转染后含有Neo基因的细胞能够存活。
在此，我们将详细介绍如何使用G418筛选稳定表达细胞系，并常见问题以及解决方法。
G418筛选实验步骤转染表达向量在进行G418筛选实验之前，首先需要将目标基因克隆到表达向量中，并将表达向量转染到细胞系中。
转染方法常见的转染方法有磷酸钙共沉淀法、聚乙烯醇法、脂质体转染法等，具体方法可参考相应文献或实验室内部标准操作规程进行操作。
添加G418将转染过的细胞在培养基中培养至80%～90%的密度后，加入G418。
加入G418前需进行药物浓度优化实验，确定最适合本实验所用细胞系及所选转染质粒的G418浓度。
筛选G418作用于Neo基因表达的细胞会死亡，而未表达Neo的细胞能够幸存下来。
因此通过逐渐增加G418浓度，筛选出稳定表达目标基因的细胞。
扩增筛选出稳定表达细胞后，需要扩大细胞数量以供后续实验使用。
可使用限稀稀释法或其他适合本实验的细胞扩增方法进行扩增。
常见问题及解决方法细胞死亡太多可能原因： - G418浓度过高； - 转染效率低。
解决方法： - 降低G418浓度； - 提高转染效率。
细胞生长太慢可能原因： - G418浓度不足； - 细胞密度过高。
解决方法： - 增加G418浓度； - 控制细胞密度。
稳定表达效果不理想可能原因： - Neo基因位点修饰造成表达低下； - 转染质粒与细胞系不匹配。
解决方法： - 检查Neo基因位点修饰； - 更换适合细胞系的转染质粒。
通过对G418筛选稳定表达细胞系的介绍，我们可以看出，G418筛选是一种快速、有效的细胞系稳定性筛选方法。
通过对常见问题及解决方法的，可以及时解决可能出现的问题，保证实验顺利进行。
祝大家在细胞实验中取得好的结果。
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(一)筛选结果鉴定:
（1)基因组ＤＮＡ提取→PＣR鉴定外源基因
（２)SHG－44-重组pcDNA3阳性细胞、SHG-４4-vect裂解→聚丙烯酰胺凝胶电泳→免疫印迹鉴定Ｐ16蛋白表达(Westeｒn-blot)。
(3)测定外源性基因对ＳHＧ-４４细胞增殖的影响
①流式细胞仪分析：SHG-４4、ＳHＧ－44-vect、SＨG-44-重组ｐｃDＮA3→单细胞悬液→７0%酒精固定→裂解细胞→核糖核酸酶消化→碘化丙啶染色→上机分析G1期和G2/M、Ｓ期比例。
②细胞生长曲线测定：SHG-4４、SHＧ-4４-vect、SＨG-44-重组ｐcＤ
NA3→5×104/孔接种２4孔培养板→２４hr后各自用苔盼蓝染色计数细胞→计算细胞生长抑制百分率。
③软琼脂克隆形成率分析:SHG－44、SＨＧ-44－vect、ＳHG-44－重组pｃDNA3→1０4细胞→0.3％低熔点琼脂糖培养→１－２周后计数不可少于５0个细胞的克隆数→计算克隆形成率抑制率。
三、注意事项
1、优化转染条件(脂质体的用量、DNA密度、细胞密度、脂质体和ＤNA 混合孵育时间)每种细胞和质粒均须进行。
用于转染的核酸应高度纯化。
为避免微生物污染，所用溶液滤过灭菌，以及随后的使用应在无菌条件下,这是细胞惯常的做法。
但是，脂质体以及脂质体／DNA混合物无需滤过除菌。
２、预备脂质体/DNA混合物必须在无血清下进行。
但是在随后的脂质体／ＤＮＡ与被转染细胞共孵育的过程中,血清又是培养基的一部分。
3、在转染之前更换培养基,可提高转染效率，但所用培养基必须37℃预温。
４、脂质体／DNA混合物应当逐滴加入，尽可能保持一致，从培养皿一边到另一边,边加入边轻摇培养皿,以确保均匀分布和避免局部高浓度。
常见问题和解答：
Q：我觉得套环法操作不如９6孔办法效率高。
A：也不一定.依据实验目的与要求而定.如果克隆效率较低的细胞,套环可能更好.用９6孔板法,如果不是每孔单个细胞,就不能保证是单克隆．即使是增加到每
孔十几个细胞或上百个,一个96孔板也只能培养一万个细胞，十万个细胞就至少需要10个板,100万个细胞就需要100个板，对于转基因细胞筛选或基因打靶，工作量就太大了.且细胞在单独生长条件下，远远不如千万个细胞共同培养活力好. 因此还得看这位朋友使用的是什么细胞,有限细胞系还是无限细胞系,转基因还是非转基因,筛选还是不筛选，需要的单细胞克隆株数量多少？
Q:请问一种细胞如果转染了稳定表达的，含ｎｅｏ抗性基因的质粒后，如何用G41８筛选?我查看了国内、外50几篇文献后发现没有一个定论的说法。
即使对于同一种细胞其筛选剂量和筛选时间也不一样。
我自己认为,从理论上讲,如果稳定表达最好要一直筛选到细胞传代后。
不知这种观点对不对。
然而开始筛选的剂量、维持剂量以及筛选持续时间又该如何确定？维持剂量与开始筛选时的剂量是否有一定关系？
A：1. G418筛选要做预试验确定最佳浓度，将细胞稀释至1000cell／ml,每孔10０ul加入有培养基的24孔板，将每孔中的G41８浓度稀释至0,1０0，２0０，3０0,4０0,500, 600,７00, 8０0,9００, 10０0,110０ng／ml等１2个级别, 培养１０-１4天，以最低细胞全部死亡浓度为基准,一般400-８00左右,筛选时比该浓度再高一个级别,维持使用筛选浓度的一半。
ﻫ２。
我们掌握是传过10代以后用维持量，但不能不用,因为有时候抗性基因会丢失,如果没有G4１8，很快会形成优势的。
ﻫ３。
即是有G418抗性,也不一定有目的基因,单克隆化操作是很重要的。
Q：请问:能谈一谈单克隆化操作的步骤以及其与目的基因表达的关系吗？
Ａ:转染后,每个细胞内目的基因与宿主染色体的整合状况是不同的,目的蛋白表达有的多，有的少，外源蛋白表达少的细胞由于代谢负荷较小，所以生长较快,在生长若干代之后，表达少的细胞会形成优势，长期之后,表达最弱的细胞会由于竞争优势占主要,转绿色荧光蛋白基因后，表达越来越暗就是这个道理。
所以,要进行单克隆化操作，使得到的均来自于同一祖先细胞,遗传性状尽量一致，也是对高表达细胞的保护。
操作用96孔板法，每代细胞长满后,大多数冻存，留２
０0ｃeｌl左右就可以进行该操作了,该方法在很多关于单克隆抗体和细胞原代
培养书中均有讲述，我就不赘述了。
必须指出,单克隆化要做几遍，一遍是不够的，我前十代都是这样的,结果绿色荧光蛋白不但没减弱,反而增强了很多。
现在很多代了，很稳定。
Q：1。
我的质粒中含有SＶ4０与neo基因,好像就不存在外源蛋白表达少的细胞形成优势这个问题了吧。
2。
按您的讲法，筛选要进行１0代，那么维持剂量要进行多长时间?如果我使用对照组,在对照组细胞全部死亡后就用维持剂量进行培养行吗? ﻫ３。
在细胞用胰酶进行传代时，此时细胞膜受到一定影响,如果培养基中存在G418对细胞是否有影响？
４。
既然细胞表达neｏ，从理论上讲是否无论多大浓度的Ｇ４1８对之都无影响? A：1．可以肯定的是,外源基因与宿主染色体之间的整合是随机的而且不是单拷贝的,这点我们做过ＦISH验证过,表达量与整合数目,上游序列特性，特定部位DNA立体结构都是相关的，装入了ＳV40只是增加了表达了数目,但并不能掩盖其它因素对表达的影响。
按你的讲法，转染完GFＰ的细胞应该亮度一致，但实际上差别很大。
neo基因也是这样，而且，同一细胞中不同基因的拷贝数不会相同,不同细胞同一基因的数目也不会相同，这点可以用数学关于泊松分布的观点理解。
有时,neo表达了，但目的基因丢失了的情况也是有的。
ﻫ２。
那为什么还要筛选基因？是这样,用概率论的思维来理解,某一细胞内随机含有一定数目拷贝数外源基因基因，那么，一种基因拷贝数为0的可能性,及所有拷贝均为另一种基因的概率就很小，很大的概率为外源基因的不均质。
打个比方，一个大口袋，抓１00个红球,再抓１00个黄球，然后以从中抓若干个，这些球均为红球的概率有多大呢?应该是很小的。
红球就是neｏ，黄球就是你的目的基因。
我们用neo，实际上是筛选的外源基因整合的数目，怎么说呢?用刚才的例子来说，如果我们抓着5个红球,另一次抓着１０个红球,可以肯定,的二次抓的球比较多，那么第二次黄球数目比第一次多的概率就很大了。
因为二者出现的概率比是恒定的。
3。
维持就是只要养这种细胞，就要维持。
可以再低些,但不能没有。
或者隔一定时间从新使用筛选量压一下,我不知你是否干临床,想想抗生素的用药原则,反向思维一下,实际上我们在筛选耐药株呀。
４。
ｎeo的产物是酶，过高的G４１８浓度就要有更多的neo酶来支持,否则细胞也要被毒死的，而此时过多的酶要求会对细胞代谢造成太大负担，细胞可能因此无法完成分裂与增殖，我们曾试过,即使在同一转染阳性细胞,在不同浓度的Ｇ418液中生长速度也不同,严重形态也不同。
这就是酶与底物的比例关系嘛，这回不用数论的,用米氏方程理解吧。
5。
胰酶的作用不必理会,有的细胞受影响，还有的细胞不受影响，由几代之后，不受影响的细胞会占优势的。
仅是我从临床抗生素和化疗药的使用原则中悟出的道理，实在是个人经验,而且在基础科学领域顶多算票友，我还是想听听诸位专业人士的理解和经验。
Aｎother aｎswer：
1．外源基因整合后的基因表达量与整合的位置高度相关,如果整合发生在活性转录染色质区，则有利于表达。
通常用的载体是靠非同源重组随机整合的，所以为了获得高表达细胞株，需要对重组克隆进行筛选。
某些载体如pcDNA３包含ＳV4０的复制起始位点,可以是质粒在反式提供大T抗原的细胞系中复制，增强瞬时表达,有利于提高质粒的随机整合几率。
对普通的表达载体来说,即使抗性基因表达也无法保证外源基因的整合，表达载体随机整合的结果常常导致目的基因的损坏甚至丢失。
２。
关于概率论的思维,我认为红球和黄球的比喻很形象，但未必准确。
因为抗性基因和目的基因有一定的联锁,并不是完全相互独立的。