最全的G418筛选稳定表达细胞系总结4

G418原理及筛选方法

原理

分析转化得功能与表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内,根据细胞类型，至多80%得进入核内得外源DNA得到瞬时表达。极少数情况下，进入细胞得外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，最终整合进细胞染色体。细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一左意味着表达，只有整合到表达区得基因才会表达,而且整合到不同得染色体区段得外源基因得表达得量也就是不同得。由于摄取、整合、表达外源基因就是小概率事件，通常根据新表型筛选軽軽体。一般情况下这种新表型由共转染得编码抗生素抗性基因提供。细菌Tn5转座子序列（ne。抗性基因）携带得氨基糖昔磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。

G418就是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大靈素、卡那靈素相似，它通过影响80S 核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核与真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物与哺乳动物细胞，也包括原生动物与蠕虫。就是稳定转染最常用得选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适得地方后，则能启动neo基因编码得序列转录为niRNA,从而获得抗性产物氨基糖昔磷酸转移酶得高效表达,使细胞获得抗性而能在含有G418得选择性培养基中生长。G418得这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上0418有杀菌作用, 所以有人主张转染时不加英它抗生素。英实G418本身有很好得杀菌效果，在用G418进行筛选得过程中很少会发生污染。但有一点，其实我觉得问题也不就是很大，那就就是:在老外得一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。我想她得想法可能就是脂质体对细胞膜有影响,可能此时加抗生素对细胞损伤较大。因为庆大离素、链鑫素.0418 均就是氨基糖貳类药物，其药理作用完全一样。所以没有必要再用，而且由于另外抗生素得添加实际增加氨基糖貳类药物得浓度，剂量有误差，不利于各实验室之间得交流，在实际操作中，培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。

最全的G418筛选稳定表达细胞系总结1

最全的G418筛选稳定表达细胞系

简介

G418是一种广谱抗生素，可以选择性地杀死没有正确整合的质粒DNA转染的

细胞，从而筛选出具有稳定表达的细胞系。G418筛选是基因转染中常用的一种选

择方法，通过对G418敏感性的筛选来选择转化基因。本文将G418筛选步骤和优

化方案。

G418筛选步骤

细胞株选取

首先需要选取稳定转染所需的细胞株。需要保证选取的细胞株生长健康、分裂

正常、易于培养以及不易死亡。常用的细胞株有293T、CHO、HEK293。

转染

在开始筛选之前，需要将目的基因转染进入所选细胞株。目前常用的转染方法

有磷酸钙共沉淀法、电转染法和脂质体转染法等，需要根据实际情况选择转染方法。

初步筛选

完成转染后，需要在培养基中加入G418，通常的加药浓度不超过1mg/mL，

推荐浓度为400μg/mL。在转染后24-48小时内开始进行初步筛选，通过观察细胞的生长状态以及基因表达情况来判断筛选效果。

细分筛选

初步筛选后，需要将G418的浓度逐步增加，通常第二轮加药浓度是初步筛选

浓度的2倍，第三轮加药浓度是第二轮的2倍。逐渐递增药物浓度，可以让敏感

的细胞死亡，生存的细胞逐渐表达目的基因，从而得到稳定的细胞株。

稳定维持

筛选到稳定的细胞后，需要对细胞进行定期维护。通常可以在培养基中加入适

当的G418浓度，维持稳定表达的转染细胞。

优化方案

药物浓度

G418的加药浓度直接影响到细胞死亡率和筛选效果。在进行筛选前需要先进行剂量反应实验，通过不同浓度药物的处理，检测细胞生长状态和基因表达情况。

细胞密度

传统细胞密度在98%时，死亡率是最高的。因此，为了降低G418对细胞的毒性，可以将细胞密度控制在70-80%左右。同时，过稀的细胞密度也会影响到筛选效果，因此需要根据实际情况进行调整。

G418筛选TZMBL

建立细胞系所用G418 浓度的确定

将TZM-bl细胞以1×103

个细胞/孔的密度接种到96孔板中。24 h后，分别用含

有100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL……1 000 μg/mL G418的DMEM培养细胞。2~3天更换新鲜培养基，培养2周，选择细胞全部死亡的最低G418浓度作为细胞

筛选的浓度。最终确定筛选用G418浓度为800 μg/mL。

在做稳定克隆筛选之前，一定要做细胞的梯度敏感实验。

通常用100、200、300、400、500、800 ug/ml六种梯度

筛选之前确定G418浓度：

1，由于每种细胞对G418 的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2，G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3，汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%

4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h 后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。

G418筛选TZMBL

建立细胞系所用G418 浓度的确定

将TZM-bl细胞以1×103

个细胞/孔的密度接种到96孔板中。24 h后，分别用含

有100 μg/mL、200 μg/mL、300 μg/mL……1 000 μg/mL G418的DMEM培养细胞。2~3天更换新鲜培养基，培养2周，选择细胞全部死亡的最低G418浓度作为细胞

筛选的浓度。最终确定筛选用G418浓度为800 μg/mL。

在做稳定克隆筛选之前，一定要做细胞的梯度敏感实验。

通常用100、200、300、400、500、800 ug/ml六种梯度

筛选之前确定G418浓度：

1，由于每种细胞对G418 的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2，G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3，汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%

4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h 后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。

G418筛选稳定转染步骤剖析

1.G418的配制:

方案一:300mgG418加入3ml PBS溶液,浓度为100mg/ml,完全溶解后,0.22um

过滤,-20℃保存。

方案二:(1配制1M HEPES:23.8g HEPES(缓冲能力更强粉末溶于100ml

ddH2O,10N NaOH(加量较多调节pH至7.3,过滤除菌(较难过滤,4℃保存,终浓度为

1mol/L。

(25g G418溶于10ml 1M HEPES(pH7.3,终浓度为500mg/ml,-20℃保存。

注:实验中采用方案二时效果较好。

2.制备筛选培养基:用培养基将G418稀释为0 ug/ml 、200 ug/ml 、300 ug/ml 、400 ug/ml、500 ug/ml 、600 ug/ml 、700 ug/ml 、800 ug/ml、900ug/ml、

1000ug/ml、1100ug/ml、1200ug/ml 24孔板,每孔1ml培养基(含有G418的完全培养基,每个浓度4个重复,则每次换液需各个浓度培养基4ml,现用现配。

200 ug/ml 300 ug/ml 400 ug/ml 500 ug/ml 600 ug/ml 700 ug/ml 800 ug/ml 900

ug/ml 1000 ug/ml 1100 ug/ml 1200 ug/ml

3ml完全培养基998.4 997.6 996.8 996 995.2 994.4 993.6 992.8 992 991.2 990.4

G418(500mg/ml 1.6ul 2.4ul 3.2ul 4.0ul 4.8ul 5.6ul 6.4ul 7.2ul 8.0ul 8.8ul 9.6ul

G418筛选稳定表达细胞系

原理

分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80％的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，形成巨大的***结构最终整合进细胞染色体。细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。细菌Tn5转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。G418是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成,对原核和真核等细胞都有毒性,包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞,也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常用的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后,则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA,从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达,使细胞获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。Ｇ418的这一选择特性,已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。所以没有必要再用，而且由于另外抗生素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度，剂量有误差，不利于各实验室之间的交流，在实际操作中，培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。

G418原理及筛选方法

G418原理及筛选⽅法

原理

分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染⾄宿主细胞染⾊体。外源基因进⼊细胞后，部分能够通过细胞质进⼊细胞核内，根据细胞类型，⾄多80%的进⼊核内的外源DNA得到瞬时表达。极少数情况下，进⼊细胞的外源DNA通过系列⾮同源性分⼦间重组核连接，最终整合进细胞染⾊体。细胞基因组⾃由部分表达，所以整合并不⼀定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，⽽且整合到不同的染⾊体区段的外源基因的表达的量也是不同的。由于摄取、整合、表达外源基因是⼩概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。⼀般情况下这种新表型由共转染的编码抗⽣素抗性基因提供。细菌T n5 转座⼦序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成⽆毒形式。

G418是⼀种氨基糖类抗⽣素，其结构与新霉素、庆⼤霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能⽽阻断蛋⽩质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原⽣动物和蠕⾍。是稳定转染最常⽤的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地⽅后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从⽽获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的⾼效表达，使细胞获得抗性⽽能在含有G418的选择性培养基中⽣长。G418的这⼀选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等⽅⾯得以⼴泛应⽤。

在进⾏转染时细胞膜受到影响，抗⽣素可能对细胞产⽣较⼤影响，加上G418有杀菌作⽤，所以有⼈主张转染时不加其它抗⽣素。其实G418本⾝有很好的杀菌效果，在⽤G418进⾏筛选的过程中很少会发⽣污染。但有⼀点，其实我觉得问题也不是很⼤，那就是：在⽼外的⼀本实验⼿册中提到，在脂质体转染时所⽤培养基中最好不加任何抗⽣素。我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗⽣素对细胞损伤较⼤。因为庆⼤霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作⽤完全⼀样。所以没有必要再⽤，⽽且由于另外抗⽣素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度，剂量有误差，不利于各实验室之间的交流，在实际操作中，培养液中有抗⽣素对细胞培养与筛选影响不⼤。

G418原理及筛选方法

原理

分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80%的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，最终整合进细胞染色体。细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。细菌Tn5 转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。

G418 是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常用的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。G418的这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转染时不加其它抗生素。其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。所以没有必要再用，而且由于另外抗生素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度，剂量有误差，不利于各实验室之间的交流，在实际操作中，培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。

G418原理及筛选方法

原理

分析转化的功能和表达需要DNA稳定转染至宿主细胞染色体。外源基因进入细胞后，部分能够通过细胞质进入细胞核内，根据细胞类型，至多80%的进入核内的外源DNA得到瞬时表达。极少数情况下，进入细胞的外源DNA通过系列非同源性分子间重组核连接，最终整合进细胞染色体。细胞基因组自由部分表达，所以整合并不一定意味着表达，只有整合到表达区的基因才会表达，而且整合到不同的染色体区段的外源基因的表达的量也是不同的。由于摄取、整合、表达外源基因是小概率事件，通常根据新表型筛选稳定转染体。一般情况下这种新表型由共转染的编码抗生素抗性基因提供。细菌Tn5 转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。

G418 是一种氨基糖类抗生素，其结构与新霉素、庆大霉素、卡那霉素相似，它通过影响80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。是稳定转染最常用的选择试剂。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。G418的这一选择特性，已在基因转移、基因敲除、抗性筛选以及转基因动物等方面得以广泛应用。

在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转染时不加其它抗生素。其实G418本身有很好的杀菌效果，在用G418进行筛选的过程中很少会发生污染。但有一点，其实我觉得问题也不是很大，那就是：在老外的一本实验手册中提到，在脂质体转染时所用培养基中最好不加任何抗生素。我想他的想法可能是脂质体对细胞膜有影响，可能此时加抗生素对细胞损伤较大。因为庆大霉素、链霉素、G418均是氨基糖甙类药物，其药理作用完全一样。所以没有必要再用，而且由于另外抗生素的添加实际增加氨基糖甙类药物的浓度，剂量有误差，不利于各实验室之间的交流，在实际操作中，培养液中有抗生素对细胞培养与筛选影响不大。

稳定转染

G418筛选稳定表达细胞系经验总结

我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。

筛选之前确定G418浓度：

1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%

4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。

G筛选稳定表达细胞系经验总结

G筛选稳定表达细胞系

经验总结

Document number【980KGB-6898YT-769T8CB-246UT-18GG08】

G418筛选稳定表达细胞系经验总结

我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单化鉴定。有自己的体会也有其他战友遇到的情况,和大家分享.没有总结好的地方，大家补充。

筛选之前确定G418浓度：

1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%

4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个，按比例1/300孔内应该有几十个，事实上，它们几乎全死光了，只有几个。

G418筛选细胞(整合版)

G418筛选细胞

G418简介：

G418是一种氨基糖苷类抗生素 ,在分子遗传试验中,是稳定转染最常用的抗性筛选试剂。

白色粉末，融点138～144℃，溶于水、甲醇。 CAS No.：108321-42-2

分子式：C20H40N4O10?2H2SO4 分子量：692.71

[储运] 室温下运输, 干粉在室温下储存，溶液于-20℃储存。

G418工作原理：

它通过抑制转座子Tn601，Tn5 的基因,干扰80S核糖体功能而阻断蛋白质合成，对原核和真核等细胞都有毒性，包括细菌、酵母、植物和哺乳动物细胞，也包括原生动物和蠕虫。

细菌Tn5 转座子序列（neo抗性基因）携带的氨基糖苷磷酸转移酶可以将G418转变成无毒形式。当neo基因被整合进真核细胞基因组合适的地方后，则能启动neo基因编码的序列转录为mRNA，从而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞获得抗性而能在含有G418的选择性培养基中生长。

利用G418筛选细胞：

1、准备工作

在筛选之前，一定要确定你的细胞对这一批G418的最佳筛选浓度。每种细胞对G418 的敏感性不同，一般变动在100ug/ml~1000ug/ml范围。

《分子克隆》给出的几个常用细胞系所需G418 的最佳用量：

2、确定最佳筛选浓度

最适用量通过建立细胞死亡曲线获得。

①将细胞稀释至1000cell/ml，每孔100ul加入有培养基的24孔板。

②G418浓度稀释至0,100,200,300,400,500,600,700,800,900,1000,1100ug/ml 等12个级别, 培养10-14天，以细胞全部死亡最低浓度为基准，一般400-800左右。筛选时比该浓度再高一个级别，维持时使用筛选浓度的一半即可。

从G418浓度确定到单克隆化鉴定

从G418浓度确定到单克隆化鉴定（转载）

筛选之前确定G418浓度：

1，由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为。

2，G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3，汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%

4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在

10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。

加药时间和维持浓度

1，由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml。

G418筛选稳定表达细胞系经验总结

我做了稳定转染，从G418浓度确定到最后的单克隆化鉴定。有自己的体会也有其他战友遇到的情况, 和大家分享. 没有总结好的地方，大家补充。

筛选之前确定G418浓度：

1、由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2、G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3、汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%

4，G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。一个具体试验：3x106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。

G418筛选

从G418筛选，转染到单克隆化的总结

筛选之前确定G418浓度：

1.由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的G418有效成分的比重不同，一般1g的粉剂中有效的G418含量大约为0.722g。

2.G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转转染时不加其它抗生素。

3.汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50%

4.G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。具体如下：将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。一个具体试验：3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。

加药时间和维持浓度

1.由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早；但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下降，所以每3~5天都要更换一次含有G418的筛选液。这时药物浓度可以降至200ug/ml。

G418筛选

G418、新霉素与neo

G418是新霉素的类似物，两者都是通过抑制核糖体的功能和蛋白质的合成而杀死细胞的。但是新霉素对真核细胞无作用而G418对细菌和真核细胞都起作用。neo 就是编码3‘磷酸转移酶的基因，它表达的蛋白能够分解新霉素和

G418。在进行转染时细胞膜受到影响，抗生素可能对细胞产生较大影响，加上G418有杀菌作用，所以有人主张转让时不加其它抗生素。

筛选之前

由于每种细胞对G418的敏感性不同，而且不同的厂家生产的相同浓度的

G418的活性不尽相同，所以在筛选之前，一定要确定G418的最佳筛选浓度。

具体如下:将细胞稀释到1000个细胞/ml，在100ug/ml~1mg/ml的G418浓度范围内进行筛选，选择出在10~14天内使细胞全部死亡的最低G418浓度来进行下一步的筛选试验。

看下面的一个试验:3*106个细胞电转后，分别接种1/4000，1/1000，1/300

细胞到24孔板中，48h后加药筛选，此时1/300细胞孔内大约50%汇合度。理论上1/4000孔内应有4%的汇合度。筛选9天后，观察1/4000孔内有两三个克隆，按比例1/300孔内应该有几十个克隆，事实上，它们几乎全死光了，只有几个克隆。所以汇合度对G418筛选结果的影响很大，一般筛选时汇合度不宜超过50% ～加药时间

由于基因转染到细胞内之后要一段时间才能表达出蛋白质。所以筛选不能太早;但是也不能太晚，因为转染了外源基因的细胞代谢负荷较大，增值较慢，时间长了就会被没有外源基因转入的细胞所淹没，最终导致筛选不出阳性克隆，一般要在转染24小时之后才开始加G418筛选。随着细胞的代谢G418的浓度和活性都回下