基因打靶技术的研究进展
基因打靶技术的研究进展
技术与方法生物技术通报BI OTEC HNOLOG Y BULLETI N 2010年第9期基因打靶技术的研究进展张丽娜刘国安杨红(西北师范大学生命科学学院,兰州730070)摘 要: 基因打靶技术是20世纪80年代发展起来的新技术,是一种利用DNA 同源重组原理和胚胎干细胞(ES 细胞)技术按定向组合的方式改变生物活体遗传信息的试验手段,具有广阔的应用前景。
对基因打靶技术原理、步骤、条件性基因打靶以及应用进行综述。
关键词: 基因打靶DNA 同源重组胚胎干细胞The Research Progress ofGene Targeti ngZha ng L i naL i u Guoa nY ang Hong(College of Li fe Scie nce ,N or t h w estN or mal Uni versit y,Lanzhou 730070)Abstrac:t G ene targeti ng is a ne w techn i que e m erged fro m the 1980s ,as an experi m enta lm ethod based on DNA hom og enous recomb i nati on theo ry and embryon i c ste m cell(ES cell)system t o mod if y specific genes and m ake them express i n an o rganis m.It has been app lied i n som e aspec ts and w ill be used w i dely i n t he future .In th i s paper ,t he theo ry ,step ,appli cation of gene targeti ng and con d iti ona l genet targ eti ng w ere rev i ewed .K ey words : G ene targeti ngDNA ho m ogenous recomb i nation Embryon ic ste m cell收稿日期:2010 03 26基金项目:省教育厅研究生导师项目(0901 05)作者简介:张丽娜,女,讲师,硕士研究生,研究方向:生化与分子生物学;E m ai:l li na791001@163.co m基因打靶(gene tar geti n g )技术是20世纪80年代发展起来的一项重要的分子生物学技术,是利用基因转移方法,将外源DNA 序列导入靶细胞后,通过外源DNA 序列与靶细胞内染色体上的同源DNA 序列间的重组,将外源DNA 定点整合入靶细胞基因组上某一确定的位点,或对某一预先确定的靶位点进行定点突变,从而改变细胞遗传特性的方法[1]。
基因打靶技术及其研究进展
上 ；２ 打靶 载 体 的 导入 ： 电穿 孔 和 显 微 注射 （１ 用
等 方法 将 打靶 载体 导 入 受体 细 胞 内 ； ３ 同 源重 （１ 组子 的 筛 选 ： 选 择性 培 养 基 筛选 打 靶 重 组 阳 用
性 细 胞 ；４ 将 重 组 阳性 细 胞转 入 动 物 胚 胎 ， （１ 产 生 转 基 因动 物 ， 进 行性 状 观 察和 分 子 生 物 学 并小 鼠 技术 的成 熟 ， 次 使 体 外 精 细 的 基 因 首 操 作与 动 物的 整 个生 长发 育 和生命 过 程 得 到 了 直 接 的 结 合 ， 探讨 高 等 生 物基 因组 结 构 和 功 为 能 提供 了有效 的方 法 ， 家 畜遗 传改 良 、 类疾 为 人 病 动物 模 型 的建 立和 基 因治疗 等奠 定 了坚 实 的
一
２ 基 因打 靶 的 靶 细 胞
基 因 打 靶 最 常 用 的 靶 细 胞 是 小 鼠 Ｅ 细 Ｓ
１ ２６ 一
维普资讯
胞 。 Ｓ细 胞 一 般 是 指 从 附 植 前 胚 胎 内 细 胞 团 Ｅ （Ｃ 或 原 始 生 殖 细 胞 （ ＧＣ ） 体 外 分 化 抑 Ｉ Ｍ） Ｐ ｓ经 制 培 养 分 离 出来 的 具有 全 能 性 （ｏｉｏｅ ｃ ） ｔｔ ｔｎ ｙ 和 ｐ
胞能 在体 内分 化发 育成 生 殖系 嵌 合体 并可 获得 小 鼠纯 合 体 子 代 。 ９ ７ ， 们利 用 Ｅ １ ８年 人 Ｓ细 胞 技
术建 立 了 次黄 嘌 呤磷 酸 核糖 转 移 酶 （ ｐｔ 基 因 ｈ ｒ１ 敲 除 的动 物模 型 ］此后 ， 项 技 术得 到 了普 遍 。 这
中图分 类号 ： ８ 文 献标 识 码 ： Ｑ７ Ａ
基因打靶技术研究进展及其应用
基因打靶技术研究进展及其应用王建刚西北农林科技大学动物科技学院陕西杨凌 712100摘要：基因打靶技术是2O世纪8O年代发展起来的新技术，是一种利用DNA同源重组原理和胚胎干细胞（ES细胞）技术按定向组合的方式改变生物活体遗传信息的实验手段，具有定位性强、打靶后新的基因有随染色体DNA稳定遗传的特点，其方法包括基因敲除、基因敲入、点突变、缺失突变、染色体组大片段删除等，相关的基因工程技术包括转基因、基因沉默和基因捕获技术等。
为生命科学、基因组学和疾病治疗等领域的研究提供了强大的工具。
文章将主要介绍基因打靶技术的发展简史、近期进展以及在模式动物中的应用。
关键词：基因打靶同源重组 ES细胞转基因动物基因治疗瑞典皇家卡罗琳外科医学研究院诺贝尔生理学或医学奖评审委员会2007年l0月8日宣布，美国科学家卡佩基（Mario R Capecchi）、史密斯（Oliver Smithies）和英国科学家埃文斯（Martin J Evans）因在“涉及使用胚胎干细胞进行小鼠特定基因修饰方面的一系列突破性发现”而获得2007年度诺贝尔生理学或医学奖。
这三位科学家的研究工作为“基因打靶”（gene targeting）技术奠定了基础。
1 基因打靶技术1.1 基因打靶的概念基因打靶就是利用细胞染色体DNA可与外源性DNA同源序列发生同源重组的性质，通过同源重组将外源基因定点整合入靶细胞基因组上某一确定位点，以达到定点修饰和改造染色体上某一基因为目的的一项技术。
通过基因打靶技术可以对生物体（尤其是哺乳动物）基因组进行基因灭活、点突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体大片段删除等修饰和改造，并使修饰后的遗传信息通过生殖系遗传，使遗传修饰生物个体表达突变性状成为可能。
1.2 基因打靶技术建立的意义“基因打靶”技术是分子生物学技术上继转基因技术之后的又一革命。
它“开创了全新的研究领域”，克服了基因随机整合的盲目性和危险性，是一种理想的修饰、改造生物遗传物质的方法，尤其是条件性、可诱导性基因打靶系统的建立，使得对基因靶位点在时间和空间上的调控更加精确，它的发展为发育生物学、分子遗传学、免疫学及医学等学科提供一个全新的研究手段；它的应用涉及基因功能的研究、生产具有商业价值的转基因动物和植物、异体动物器官移植和人类疾病的基因治疗对攻克人类疾病等诸多方面起到了重大作用，该技术一经公布，就广泛应用于基因功能研究、生物制药等方面。
分子生物学综述论文(基因敲除技术)
现代分子生物学课程论文题目基因敲除技术班别生物技术10-2学号 *********** 姓名陈嘉杰成绩基因敲除技术的研究进展要摘基因敲除是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术，是通过一定的途径使机体特定的基因失活或缺失的技术。
此后经历了近20年的推广和应用，直到2007年10月8日，美国科学家马里奥•卡佩奇（Mario Capecchi）和奥利弗•史密西斯（Oliver Smithies）、英国科学家马丁•埃文斯（Martin Evans）因为在利用胚胎干细胞对小鼠基因金星定向修饰原理方面的系列发现分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。
基因敲除技术从此得到关注和肯定，并对医学生物学研究做出了重大贡献。
本文就基因敲除的研究进展作一个简单的综述。
关键词基因敲除、RNAi、生物模型、同源重组前言基因敲除又称基因打靶，该技术通过外源DNA与染色体DNA之间的同源重组，进行精确的定点修饰和基因改制，具有转移性强、染色体DNA可与目的片段共同稳定遗传等特点。
应用DNA同源重组技术将灭活的基因导入小鼠胚胎干细胞（embryonic stem cells，ES cells）以取代目的基因，再筛选出已靶向灭活的细胞，微注射入小鼠囊胚。
该细胞参与胚胎发育形成嵌合型小鼠，再进一步传代培育可得到纯合基因敲除小鼠。
基因敲除小鼠模型的建立使许多与人类疾病相关的新基因的功能得到阐明，使现代生物学及医学研究领域取得了突破性进展。
上述起源于80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。
关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。
Tsien等[1]于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。
该技术以Cre/LoxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。
2000年Shimizu等[2]于《Science》报道了以时间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术，其同样以Cre/LoxP系统为基础，利用四环素等诱导Cre的表达。
分子植物卓越中心水稻基因打靶技术研究获进展
他主粮作物而言尚无明显突破，大豆生产亟需“绿色革命”。
本次泛基因组研究所选用的大豆种质材料不仅在遗传多样性上具有代表性，且具有重要的育种和生产价值。
其中满仓金、十胜长叶、紫花4号等种质材料作为骨干核心亲本已各自培育出了上百个优良新品种：黑河43、齐黄34、豫豆22、皖豆28、晋豆23、徐豆1号等品种是各个大豆主产区推广面积最大的主栽品种。
该基因组和相关的2898份种质材料遗传变异的发布为大豆研究提供了重要的资源和平台，将推进大豆分子设计育种，助力实现大豆“绿色革命”。
相关研究结果以Pan-genome of wild and cul⁃tivated soybeans为题在线发表于《细胞》杂志上。
田志喜研究组博士生刘羽诚、梁承志研究组博士生杜会龙为该论文的第一作者，田志喜为论文通讯作者，梁承志为共同通讯作者。
该研究得到国家自然科学基金委和中科院的资助。
（来源：遗传与发育生物学研究所）分子植物卓越中心水稻基因打靶技术研究获进展中国科学院分子植物科学卓越创新中心研究员朱健康领衔的研究团队，在植物基因组编辑领域再次取得重要进展。
研究人员采用修饰后的DNA片段作为供体，在水稻上建立了一种高效的片段靶向敲入和替换技术，高至50%的靶向敲入效率将极大地方便植物的研究和育种。
7月6日，相关研究成果在线发表在Nature Biotechnolo⁃gy上。
近年来，CRISPR/Cas介导的植物基因组定点编辑技术在农作物基因功能研究和精准育种中发挥了重要作用，展现了广阔的发展潜力和应用前景。
然而，CRISPR/Cas介导的植物基因组定点敲除技术只能在基因组特定位点产生随机插入和删除，精准的片段插入和替换的效率一直很低，限制了其在植物研究和育种上的应用。
因此，迫切需要建立更高效的植物基因组片段插入和替换技术体系。
植物基因组编辑是朱健康研究组的重点研究领域，近年来获得了一系列的进展。
作为该领域的难题，片段的靶向敲入和替换是科研人员的重要研究目标，并围绕这一目标努力。
植物基因打靶研究进展
元 件（ 内切 酶 识 别 序 列 或 转 座 元 件 ） 造 出潜 在 的 ＂Ｓ ， 创 ＤＢ 位 点 ， 将 该 座 位 作 为 靶 点 来 研 究 ， 而 无 法 改 造 基 再 因 因组 内 的特 定 基 因 ， 具 备 实 用 价 值 。 不 引 入 Ｄ Ｂ提 高 基 因打 靶 效 率 的 途 径 遇 到 了 困难 ， Ｓ 直 到锌 指 核 酸酶 （ｉｃ ｆ ｇｒ ｕ ｌ ｓ， Ｆ 在这 一 领域 ｚ —ｉ ｅ ｃｅ ｅ Ｚ Ｎ） ｎ ｎ ｎ ａ
细 胞 内 Ｄ Ａ 的重组 主要 有 ２种 方 式 ： 重 组 位 点特 Ｎ １ ） 定 的同 源重 组 （ｏ ｏｏｏ ｓｒｃ ｍ ｉａｉｎＨ ；） ｈ ｍ ｌｇｕ ｅｏ ｂｎ ｔ ， Ｒ） 重组 位 ｏ ２
转 座 系 统 制 造 Ｄ Ｂ， 染 色 体 内 同源 重 组 的频 率 提 高 Ｓ 使 了 １０ ０多 倍 。遗 憾 的是 ， ０ 这些 手 段 都 本末 倒 置 ， 即先
应用 后 ， 前景 才 落到 实处 。 Ｆ 其 Ｚ Ｎ是人 工 酶 ， 早期 常 用于 基 因转 录调 控研 究 。顾名 思 义 ，Ｆ Ｚ Ｎ是 锌 指 与核 酸 酶 的 融合 蛋 白， 中锌 指可 识 别 特定 的 Ｄ Ａ序 列 ， 酸 酶可 其 Ｎ 核 以将 双链 Ｄ Ａ 断开 。单个 锌 指 由 ２条 Ｂ链 和 １个 螺 Ｎ
２组 锌指 阵 列， 与一 无 活 性 的双 链 Ｄ Ａ核 酸酶 单 体相 各 Ｎ 连 。 当左 右 阵列 均 进入 正 确位 置， 合靶 点 Ｄ Ａ时 ， 仅 结 Ｎ 核 酸酶 单 体才 能形 成 二 聚体 ，转 变 为活 性形 式 ，产 生 Ｄ Ｂ Ｓ
胞 的 转化 率 （ 常 １ ５ ） 借 助 同源 重 组 的成 功 打靶 通 ％～ ％ ， 只得 依赖 极 大 量 细 胞 的使 用 ，这 导 致 前 期转 化 和后 期
Cas9基因打靶技术的研究进展
CRISPR/Cas9基因打靶技术的研究进展姓名：曾惜班级：2011级生物技术学号：2011222702摘要:近来在众多原核生物的基因组的分析中，发现一类成簇的、有规律间隔的短回文重复序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats，CRISPR）结构家族。
CRISPR/Cas9 系统是细菌在噬菌体长期选择压力下进化出来的一种有效抵御外源 DNA 入侵的免疫机制之一。
这种免疫功能的发挥是由CRISPR 间隔序列的动态性变化，即通过增加或删除间隔序列（spacer）来实现的。
CRISPR/Cas9 系统中，细菌和古细菌能够利用小crRNA分子（CRISPR-derived RNA），结合CRISPR和相关内切酶Cas蛋白（CRISPR-associated protein），crRNA 通过碱基配对与tracrRNA（trans-activating RNA）结合，形成双链RNA。
这种tracrRNA:crRNA二元复合体改造为单链RNA嵌合体，也能同样指导Cas9蛋白在特定位点剪切双链DNA。
tracrRNA:crRNA复合体结合Cas9蛋白，并通过crRNA 与目标DNA碱基配对引导Cas9蛋白到特定DNA序列，微生物通过这一机制剪切并破坏病毒和质粒，而这一系统也可以用于对基因组中目标DNA进行改造。
基于此种原理，CRISPR/Cas9 系统被开发成一种新型的基因打靶系统。
相对于稍早的RNAi、Cre/LoxP、ZFN 和TALEN 系统，此新型打靶系统具有操作简单、效率高、成本低、可同时沉默任意数量的基因等优点。
本文着重对CRISPR/Cas9 打靶系统的结构、工作原理及目前的应用进行综述，并对该系统在未来生命科学研究以及临床中的应用进行了展望。
关键词：CRISPR/Cas9; 基因打靶; crRNA; tracrRNAResearch progress of gene targeting technology of CRISPR/Cas9 systemNAME:Xi ZengCLASS：2011 Bio-technologyID:2011222702Abstract:Recently, a Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats (CRISPR) has been found in the analysis of many prokaryotic genome。
基因敲除技术
基因敲除技术研究进展综述摘要：基因敲除在20世纪80年代发展起来后已经应用到许多领域, 如建立人类疾病的转基因动物模型(糖尿病转基因小鼠、神经缺损疾病模型等)。
这些疾病模型的建立使研究者可以在动物体内进行疾病的研究: 研究发育过程中各个基因的功能, 研究治疗人类遗传性疾病的途径。
关键字：基因敲除；Cre/LoxP系统；基因载体；生物模型1．概述：基因敲除又称为基因打靶, 是指从分子水平上将一个基因去除或替代, 然后从整体观察实验动物,推测相应基因功能的实验方法，是功能基因组学研究的重要研究工具。
是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。
基因敲除已成为当前医学和生物学研究的最热点与最前沿, 并已对生物学和医学的许多研究领域产生深刻的影响, 成为革命性的研究工具, 具有极其重要的理论意义和实践意义。
基于基因敲除技术对医学生物学研究做出的重大贡献，在该领域取得重大进展的三位科学家，70岁的美国人马里奥•卡佩奇（Mario Capecchi）、82岁的美国人奥利弗•史密西斯（Oliver Smithies）和66岁的英国人马丁•埃文斯（Martin Evans）分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。
2.基因敲出技术发展历史80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。
关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。
Tsien等于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。
该技术以Cre/LoxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。
基因敲除技术
基因敲除技术研究进展综述摘要：基因敲除在20世纪80年代发展起来后已经应用到许多领域, 如建立人类疾病的转基因动物模型(糖尿病转基因小鼠、神经缺损疾病模型等)。
这些疾病模型的建立使研究者可以在动物体内进行疾病的研究: 研究发育过程中各个基因的功能, 研究治疗人类遗传性疾病的途径。
关键字：基因敲除；Cre/LoxP系统；基因载体；生物模型1．概述：基因敲除又称为基因打靶, 是指从分子水平上将一个基因去除或替代, 然后从整体观察实验动物,推测相应基因功能的实验方法，是功能基因组学研究的重要研究工具。
是自80年代末以来发展起来的一种新型分子生物学技术。
通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的目的。
随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA，它们同样可以达到基因敲除的目的。
基因敲除已成为当前医学和生物学研究的最热点与最前沿, 并已对生物学和医学的许多研究领域产生深刻的影响, 成为革命性的研究工具, 具有极其重要的理论意义和实践意义。
基于基因敲除技术对医学生物学研究做出的重大贡献，在该领域取得重大进展的三位科学家，70岁的美国人马里奥•卡佩奇（Mario Capecchi）、82岁的美国人奥利弗•史密西斯（Oliver Smithies）和66岁的英国人马丁•埃文斯（Martin Evans）分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。
2.基因敲出技术发展历史80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。
关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。
Tsien等于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特异性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。
该技术以Cre/LoxP系统为基础，Cre在哪种组织细胞中表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞中。
基因敲除
二、基因敲除的方法
利用随机插入突变进行基因敲除。 特点：依赖于细胞内自然发生的同源染色体 的随机交换，但在体细胞内，基因同源重组 利用同源 大规模的随机插入突变理论上可实现在基因 的效率特别低( 低于 10－ 6) 。增加了实际操 重组 作的工作量，限制了该项技术的应用 组范围内敲除任一基因目。 传统基因 敲除方法 该基因敲除( gene knock －out) 技术，是在转染 细胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因 之间的 DNA 同源重组，能够使外源基因定点 地整合到核基因组的特定位置上，从而达到改 应用随机 特点：可以分为 T-DNA 插入突变和转座子插 变细胞遗传特性的目的。 插入突变 入突变，两者是在植物中使用广泛的基因敲 除手段
二、基因敲除的方法
CRISPER/Cas系统的由来：
CRISPR（clustered regularly interspaced shortpalindromic repeats） 广泛存在于细菌和古细菌的基因组中，是细菌和古细菌的一种适应性免疫系统， 该系统可以介导外源 DNA 的降解，从而抵御病毒等外来入侵者。 1987年日本学者首次在大肠杆菌中发现该间隔重复序列。 2002年，Jansen 等将其正式命名为 CRISPR，基因编码的蛋白质统称为 CRISPR 附属蛋白（CRISPR-association proteins，Cas）。
CRISPR/Cas系统的分类：
TypeⅠ TypeⅡ TypeⅢ三种不同类型 TypeⅡ系统的主要特征是包含一个标志性的Cas9蛋白(分子质 量很大的多功能蛋白)参与crRNA的成熟以及降解入侵的噬菌 体DNA或是外源质粒。
CRISPR/Cas的基因座结构
5'端为tracrRNA基因
基因打靶技术研究进展
基因打靶技术研究进展(综述）建立在胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）与同源重组技术基础之上的基因打靶技术(Gene targeting)是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段[1-3]。
通过对生物遗传信息的定向修饰，并使修饰后的遗传信息在生物活体内遗传，表达突变的性状，从而研究基因的功能，阐明生物体的遗传进化，疾病发生的分子机制，提供相关的疾病治疗药物、评价模型及新型预防、治疗疫苗等，是后基因组时代基因功能研究的重要技术手段。
本文概述基因打靶的背景、原理、策略、生物学应用及问题与展望。
一、基因打靶研究的背景目前的基因转移技术，如显微注射、电穿孔、磷酸钙沉淀及逆转录病毒载体感染等方法，已能有效地将外源基因导入靶细胞内。
但这些导入的外源基因在靶细胞基因组中整合的位点一般是随机的，可能导致下面几种情况出现：①导入的外源基因整合入某一正常基因的中部，导致该正常基因表达的缺如；②导入的外源基因整合入细胞内正常基因的侧翼序列，影响了其周围正常基因的活性；③外源基因的导入有可能激活细胞内的原癌基因；④导入的外源基因由于其整合位点的不适，而在细胞内不表达或表达难以控制。
为避免上述情况的出现，最好的途径就是将外源基因导入预先确定的位点。
即对细胞内靶位点进行定点修饰——基因打靶，而研究该基因的功能或在生物发育中的作用。
随着人类及四十多种微生物基因组测序的完成，发现了大量未知功能的基因，应用基因打靶技术对这些新基因进行靶向修饰，是研究其功能最直接最有效的手段。
因此，基因打靶就日益成为继基因转移技术后亟待发展的新技术。
二、基因打靶原理生物界同源重组现象的发现，为基因打靶奠定了坚实的理论基础，而胚胎干细胞技术的发展，促进了基因打靶的广泛应用。
同源重组(Homologous recombination)又称一般性重组或非特异性重组(General recombination)，是指相似的DNA交换遗传信息的过程, 外源DNA片段可与宿主基因组的相应片段发生交换（即重组）。
基因打靶技术的研究进展
01 引言
目录
02 研究现状
03 传统基因打靶技术
04 新兴DNA纳米技术
05 应用领域
06 基因功能研究
07 疾病治疗
目录
08 研究方法
09 基因打靶效率的评估
010 挑战与展望
011 结论
引言
基因打靶技术是一种通过定向改造生物体基因组来实现基因功能研究与疾病 治疗的新兴技术。自20世纪80年代初以来，基因打靶技术不断发展，为科学研究 与医学实践提供了强有力的工具。本次演示将综述基因打靶技术的研究现状、应 用领域、研究方法以及挑战与展望，以期为相关领域的研究人员提供参考。
新兴DNA纳米技术
近年来，随着DNA纳米技术的不断发展，出现了一种基于DNA纳米结构的新型 基因打靶技术。该技术利用DNA自组装纳米结构，将基因打靶与纳米药物输送相 结合，具有更高的靶向性和细胞内活性。此外，DNA纳米技术还可用于基因编辑、 疫苗研发等领域，为基因打靶技术的发展开辟了新途径。
应用领域
挑战与展望
尽管基因打靶技术具有广泛的应用前景，但仍面临许多挑战和问题需要解决。 其中，靶向序列的设计和制备是关键的挑战之一。目前，靶向序列的设计主要依 赖于计算机辅助软件，但这些软件的准确性和可靠性仍有待提高。此外，制备高 质量、大规模的靶向序列仍是一个挑战。未来，研究人员需要开发更加高效和准 确的软件和方法，以提高靶向序列的设计和制备水平。
2、DNA疫苗
DNA疫苗是一种将外源抗原编码基因导入机体，通过机体细胞表达抗原蛋白， 诱导机体产生免疫应答的疫苗。基因打靶技术可应用于DNA疫苗的研发，将抗原 编码基因导入机体细胞，提高疫苗的免疫原性和保护效果。
3、基因治疗
基因打靶技术可用于基因治疗，通过将外源正常基因导入患者体内，补偿缺 陷基因的功能，达到治疗疾病的目的。例如，利用基因打靶技术将正常β-珠蛋 白基因导入贫血患者的造血干细胞，可有效治疗地中海贫血。
基因靶向治疗技术的研究进展
基因靶向治疗技术的研究进展近年来，基因靶向治疗技术备受瞩目，成为医学领域的热门研究方向之一。
基因靶向治疗技术是指通过对人体内特定基因进行干预，调控和修复相关蛋白的合成和调控过程，进而治疗相关疾病的一种先进治疗方法。
它具有治疗效果明显、疗效持久等优点，已经开始在一些临床上得到应用。
本文将从基因治疗的原理、目标和应用等几个方面介绍该领域的研究进展。
一、基因治疗的原理1、基因表达调节基因治疗的核心是通过干预基因表达来达到调节相应蛋白质的合成水平从而达到治疗目的，主要包括以下几种方法：(1) 聚合酶链反应(PCR)：利用PCR技术可以扩增目标基因，然后采用逆转录和蛋白表达等技术来刺激因基因突变而造成的缺陷。
(2) RNA干扰技术：是利用RNA干扰技术使其与目标mRNA结合去除其活性从而，抑制基因的表达，达到治疗目的。
(3) 基因编辑技术：CRISPR/Cas9是一种新型的基因编辑技术，它可以使靶向的基因出现裂变，进而实现基因编辑。
同时，它可以利用监测断裂端功能调节基因表达水平。
2、基因突变等遗传因素的影响基因突变是导致许多疾病的主要遗传因素之一。
基于这一特性，基因治疗的另一个重要的应用就是通过修复基因突变以消除相关疾病的影响。
一些最常见的方法包括：(1) 基因替换或增强：针对因某种基因突变引起的一些疾病，可以通过进行基因替换或增强来消除突变带来的负面影响。
最常见的方式是通过动物基因工程技术构建转基因动物。
(2) 基因剪切技术：针对因脱屑或杂合突变引起的一些疾病，可以使用剪接技术使其出现错位或功能性突变。
二、基因治疗的应用基因治疗技术在临床上有许多应用，主要集中在以下几个方面：1、常见遗传性疾病的治疗遗传性疾病是人体基因水平出现异常导致的疾病，如小儿肌张力障碍症、家族性高胆固醇血症等。
遗传性疾病的治疗方法是通过干预基因表达，对遗传缺陷进行纠正，其核心是在基因水平上恢复身体机能。
目前，基因治疗在这些疾病上已经取得了一些积极的进展。
基因打靶技术在基因治疗中的应用研究
基因打靶技术在基因治疗中的应用研究随着科技的不断进步和人类对基因的认知不断加深，基因治疗已经成为目前生物医学领域的一个热点研究方向。
而基因打靶技术作为基因治疗中的关键技术之一，具有极大的潜力和前景。
一、基因治疗的定义和技术路线基因治疗是利用基因工程等技术手段，修复或替换人体细胞或组织中缺乏或异常的基因，治疗基因疾病的一种新型治疗方法。
基因治疗技术的基本路线为：构建治疗基因载体，将治疗基因载体导入患者体内，使其达到治疗目的。
二、基因打靶技术的定义和研究进展基因打靶技术是指通过分子遗传学技术寻找特定基因，选定治疗目标基因，研发相应的基因治疗药物，增强治疗效果，减少不良反应和副作用的技术手段。
随着生命科学的发展，基因打靶技术也逐渐成熟。
例如，目前已经有基于基因打靶技术开发的CAR-T细胞疗法、CRISPR/Cas9基因编辑技术等。
这些技术的成功应用使得基于基因打靶技术的基因治疗开始进入实际应用阶段。
三、基因打靶技术的优势和不足相比于传统的治疗方法，基于基因打靶技术的基因治疗在很多方面具有明显的优势。
例如，它能够精确定位治疗目标，防止将治疗药物引入错误的细胞或组织中。
同时，基因打靶技术能够减少不良反应和副作用，提高治疗效果。
但是，基因打靶技术也存在一些不足之处。
其中一个主要问题是基因打靶技术难以获得指定的治疗效果，因为基因在人体内的调控非常复杂。
此外，基因治疗在实际应用中的安全性和有效性也需要得到进一步的验证。
四、基因打靶技术在基因治疗中的应用基因打靶技术在基因治疗中有多种应用方式。
例如，可以利用基因打靶技术研发出针对特定疾病的基因药物，帮助患者达到治疗目的。
同时，基于基因打靶技术的CRISPR/Cas9基因编辑技术也可以在基因治疗中发挥重要作用，例如在癌症治疗中使用。
此外，基因打靶技术还可以用于：研究基因表达调控网络，发现新的治疗靶点；研究基因遗传变异，寻找遗传性疾病的发生机制以及治疗方法等。
五、结语基因治疗作为一种新型的治疗方式，正得到越来越多的关注和研究。
基因打靶实验报告
一、实验背景基因打靶技术是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内研究基因及基因组的功能。
近年来，基因打靶技术在生物学和医学研究领域取得了显著成果。
本实验旨在通过基因打靶技术，研究特定基因在细胞增殖、凋亡和信号传导等方面的功能。
二、实验目的1. 利用基因打靶技术构建基因敲除细胞系。
2. 研究敲除特定基因后，细胞在增殖、凋亡和信号传导等方面的变化。
3. 分析敲除特定基因后，细胞生物学特性的变化。
三、实验材料1. 细胞：人乳腺癌细胞系MCF-7。
2. 基因打靶载体：pT7-TET-OFF载体。
3. 试剂：质粒提取试剂盒、限制性内切酶、DNA连接酶、PCR试剂、转染试剂等。
四、实验方法1. 构建基因打靶载体：将目的基因插入pT7-TET-OFF载体中，并使用限制性内切酶进行酶切，连接成重组质粒。
2. 细胞转染：将重组质粒转染MCF-7细胞，采用脂质体介导的转染方法。
3. 基因敲除细胞筛选：通过G418筛选阳性克隆，并进行PCR检测。
4. 细胞增殖实验：采用CCK-8法检测细胞增殖情况。
5. 细胞凋亡实验：采用Annexin V-FITC/PI双染法检测细胞凋亡情况。
6. 信号传导实验：采用Western blot法检测信号传导相关蛋白的表达。
五、实验结果1. 成功构建基因敲除细胞系：通过PCR检测，确认目的基因在细胞中成功敲除。
2. 基因敲除细胞增殖能力下降：CCK-8实验结果显示，基因敲除细胞增殖能力明显低于野生型细胞。
3. 基因敲除细胞凋亡率升高：Annexin V-FITC/PI双染法检测结果显示，基因敲除细胞凋亡率显著高于野生型细胞。
4. 信号传导实验结果显示，基因敲除细胞中信号传导相关蛋白表达降低。
六、实验讨论1. 本实验成功构建了基因敲除细胞系，为研究特定基因的功能提供了实验基础。
2. 基因敲除细胞增殖能力下降、凋亡率升高，提示该基因可能参与细胞增殖和凋亡调控。
《ZFNs介导的牛MSTN位点的基因打靶研究》范文
《ZFNs介导的牛MSTN位点的基因打靶研究》篇一一、引言基因编辑技术近年来在生物医学领域取得了显著的进展，特别是以锌指核酸酶（ZFNs）为代表的基因打靶技术，为研究特定基因的功能和开发新型治疗方法提供了强有力的工具。
本篇研究报告将重点介绍我们利用ZFNs介导的基因打靶技术，对牛肌肉生长抑制素（MSTN）位点进行编辑的研究过程和结果。
二、材料与方法1. 材料本实验所使用的材料包括牛胚胎干细胞、ZFNs系统、各种分子生物学试剂等。
2. 方法（1）构建ZFNs系统：根据牛MSTN基因序列设计并构建ZFNs系统。
（2）基因打靶：将构建好的ZFNs系统与牛胚胎干细胞共培养，通过ZFNs介导的DNA双链断裂和同源重组，实现对MSTN 位点的基因打靶。
（3）检测与分析：通过PCR、测序等方法检测基因打靶效率及效果，分析MSTN基因的变化对牛生长发育的影响。
三、实验结果1. ZFNs系统构建成功我们成功设计了针对牛MSTN基因的ZFNs系统，并通过PCR和测序验证了其准确性。
2. 基因打靶效率高将ZFNs系统与牛胚胎干细胞共培养后，我们观察到较高的基因打靶效率。
通过PCR和测序分析，证实了MSTN位点的成功编辑。
3. MSTN基因变化对牛生长发育的影响显著我们对编辑后的牛胚胎干细胞进行了生长发育相关指标的检测，发现MSTN基因的变化对牛的生长发育具有显著影响。
具体表现为编辑后牛胚胎干细胞的肌肉生长速度和肌肉量均有所提高。
四、讨论本项研究利用ZFNs介导的基因打靶技术，成功地对牛MSTN位点进行了编辑。
通过实验结果的分析，我们发现MSTN 基因的变化对牛的生长发育具有显著影响。
这一发现为进一步研究MSTN基因的功能以及开发新型牛育种技术提供了重要的理论依据。
在实验过程中，我们注意到ZFNs系统的设计及构建是成功的关键。
此外，共培养条件和共培养时间等因素也会影响基因打靶的效率。
因此，在未来的研究中，我们需要进一步优化ZFNs 系统的设计和共培养条件，以提高基因打靶的效率和准确性。
《2024年利用CRISPR-Cas9系统与体细胞核移植技术制备EDAR基因打靶绒山羊的研究》范文
《利用CRISPR-Cas9系统与体细胞核移植技术制备EDAR基因打靶绒山羊的研究》篇一一、引言近年来，随着生物科技和遗传工程的快速发展，利用基因编辑技术进行特定物种的改良与培育成为了研究的热点。
特别是在农业动物育种领域，利用CRISPR-Cas9系统与体细胞核移植技术（SCNT）进行基因打靶，对于改良动物性状、提高生产效率具有重要意义。
本文旨在探讨利用CRISPR-Cas9系统与体细胞核移植技术制备EDAR基因打靶绒山羊的研究进展。
二、研究背景及意义EDAR（Ectodysplasin receptor）基因在山羊的毛发发育和形态特征形成中起着关键作用。
通过基因编辑技术对EDAR基因进行打靶，有望实现山羊毛绒品质的改良。
CRISPR-Cas9系统作为一种高效的基因编辑工具，在动物模型构建、疾病模型研究以及农业生物育种等领域具有广泛应用。
而体细胞核移植技术则能够快速复制基因编辑后的动物个体。
本研究旨在通过结合这两种技术，为绒山羊的遗传改良提供新的途径。
三、研究方法1. 基因编辑技术：利用CRISPR-Cas9系统设计针对EDAR基因的特异性引导RNA（gRNA），在体外对绒山羊的体细胞进行基因编辑。
2. 核移植技术：将编辑后的细胞核植入去核的卵母细胞中，经过激活与培养后获得克隆胚胎。
3. 动物培育与筛选：将克隆胚胎植入代孕母羊体内，通过生长发育观察及分子生物学检测，筛选出成功打靶EDAR基因的绒山羊。
四、实验过程1. 实验材料准备：收集绒山羊的体细胞样本及成熟卵母细胞。
2. CRISPR-Cas9编辑：合成特异性gRNA与Cas9蛋白共转染至体细胞中，进行基因编辑。
3. 核移植操作：将编辑后的细胞核进行显微操作，植入去核卵母细胞中，激活并培养至囊胚阶段。
4. 胚胎移植：将成功构建的克隆胚胎移植到代孕母羊体内。
5. 观察与检测：监测代孕母羊的妊娠情况，待胎儿出生后进行分子生物学检测，确认EDAR基因的打靶效果。
《2024年ZFNs介导的牛MSTN位点的基因打靶研究》范文
《ZFNs介导的牛MSTN位点的基因打靶研究》篇一一、引言随着现代生物技术的发展，基因编辑技术为畜牧业带来了巨大的潜力。
基因打靶技术作为基因编辑的重要手段，为改良动物品种、提高生产性能提供了新的途径。
其中，锌指核酸酶（ZFNs）作为一种高效的基因编辑工具，在牛的基因打靶中尤其显示出其优势。
本文以牛为研究对象，以肌肉生长抑制素基因（MSTN）位点为靶点，通过ZFNs介导的基因打靶技术进行深入研究。
二、材料与方法1. 材料准备选取健康的牛胚胎作为实验材料，并准备ZFNs相关试剂、培养基及其他实验耗材。
2. 方法（1）设计并构建ZFNs表达载体：根据MSTN位点的序列信息，设计并构建特异性针对该位点的ZFNs表达载体。
（2）细胞培养与转染：将牛胚胎细胞进行培养，并将构建好的ZFNs表达载体转入细胞中。
（3）基因打靶：利用ZFNs对MSTN位点进行切割，引发同源重组，从而实现基因的精确打靶。
（4）检测与分析：通过PCR、测序等方法检测打靶效率及准确性，并对实验结果进行统计分析。
三、实验结果1. ZFNs表达载体的构建与验证成功构建了针对牛MSTN位点的ZFNs表达载体，并经测序验证其准确性。
2. 基因打靶效率及准确性分析经过ZFNs介导的基因打靶，MSTN位点的打靶效率达到XX%，且打靶准确性高，未出现非特异性切割现象。
3. 打靶后细胞生长及肌肉性能分析与未打靶的细胞相比，打靶后的细胞在生长速度、肌肉重量等方面均表现出显著优势。
经过测定，打靶后牛的肌肉生长速度提高了XX%，肌肉重量增加了XX%。
四、讨论本研究利用ZFNs介导的基因打靶技术，成功对牛的MSTN 位点进行了打靶。
通过对实验结果的分析，我们发现打靶后的牛在生长速度和肌肉重量方面均表现出显著优势。
这表明通过基因打靶技术可以有效地改良牛的品种，提高其生产性能。
此外，ZFNs作为一种高效的基因编辑工具，在牛的基因打靶中具有较高的准确性和效率，为其他动物品种的改良提供了新的途径。
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文章编号:1008—9632(2002)01—0007—03基因打靶技术的研究进展薛 猛(扬州大学比较医学中心,江苏扬州 225009) Ξ摘 要:基因打靶在人类遗传病动物模型的构建、基因治疗和基因功能研究等方面都有重要的作用。
本文综述了一些常用的基因打靶策略,并对这些技术的研究进展作一介绍。
关键词:基因打靶;基因敲除;同源重组;胚胎干细胞中图分类号:Q812,Q78 文献标识码:A 基因打靶通常是把用含已知序列的DNA片段与受体细胞基因组中序列相同或非常相近的基因发生重源重组,整合至受体细胞基因组中并得以表达的一种外源DNA导入技术。
哺乳动物细胞中同源重组的实验为基因打靶奠定了理论基础。
1987年,人们首次利用胚胎干细胞技术建立了次黄嘌呤磷酸核糖转移酶(hrpt)基因敲除的动物模型[1]。
此后,这项技术得到了普遍的应用和长足的发展。
目前,通过基因打靶获得的突变小鼠已近千种,人们不仅可以对小鼠进行基因敲除,还能进行点突变,大至几个分摩的染色体组片段的缺失,以及特定的染色体易位,甚至能对基因打靶进行时空上的调控。
基因打靶技术使现代生物学研究的许多领域得到了突破性的进展。
1 基因打靶的靶细胞和载体目前,基因打靶最常用的靶细胞是小鼠胚胎干细胞。
胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ES细胞)是从附置前早期胚胎内细胞团(ICM)或附置后胚胎原始生殖细胞(P GC2)分离克隆出来的一种具无限增殖能力和全向分化能力的干细胞。
ES细胞提供了一个研究处理整体细胞群的实验体系,利用ES细胞作为载体,体外走向改造ES细胞,可使得基因的整合数目、位点、表达程度和插入基因的稳定性及筛选工作等都在细胞水平上进行。
ES细胞只有在严格的条件下维持于不分化状态才具有发育的全能性,在ES细胞培养基中饲养层细胞可作为ES细胞的附着支持物,还可产生分化抑制因子,从而使ES细胞处于不分化状态,直接加入白血病抑制因子(L IF)也能维持ES细胞处于不分化状态。
ES细胞系最常用的遗传背景是129Sv,从免疫学角度来说,129Sv尚未充分定义,因此为避免靶点小鼠种系多方面的回交,基他遗传背景的ES细胞系逐渐被应用,如近交系C57BL/6和BALB/c来源的ES细胞都可以进行基因打靶的实验操作。
目前,人们只能从小鼠体内分离ES细胞并建系,这制约了对大型哺乳动物进行基因打靶。
因此,最近利用体细胞作为载体进行基因打靶的技术得到了较大发展,例如Mateyak利用体细胞基因打靶成功地获得了c-myc基因缺失导致的细胞表型[2]。
基因打靶的载体可分为置换型和插入型两种,插入型载体中与靶基因同源的区段含有特异的内切酶酶切位点,线性化后,同源重组导致基因组序列的重复,从而干扰目标基因的功能。
置换型载体进行线性化的内切酶位点在引导序列和筛选基因外侧,线性化后,同源重组染色体DNA序列为打靶载体序列替换。
大多数基因敲除突变都采用置换型载体进行基因打靶。
2 基因敲除(G ene Knockout)为获得基因敲除小鼠,首先应在体外构建一个打靶载体。
这个载体上含有一段与欲灭活的基因具有高度同源性的外源基因,其中插入一带有启动子的选择标记基因,如新霉素抗性基因(neo),次黄嘌呤磷酸核糖转移酶基因(hprt)等。
将外源基因通过各种方法导入ES细胞中,如磷酸钙—DNA共沉淀法、电穿孔法、逆转录病毒感染法等。
由于真核细胞中发生同源重组的机率非常低,把发生定点整合的细胞从大量随机整合的细胞中筛选出来,就成了基因打靶技术要解决的关键问题。
目前常用的鉴定同源重组子的方法有Southern杂交法、PCR法等。
图1 运用PNS法进行基因敲除的示意图 基因打靶最常用的筛选策略是正—负双向选择法(Positive-negative selection,PNS法)[3]。
在打靶载体的同源区内的一个外显子中部插入一个正选择基因(如neo基因),它既可使靶基因失活,又可作为选择标记;在同源序列与非同源序列之间插入负选择基因(如HSV胸腺激酶基因,HSV-tk)。
运用G418正向选择时,发生重组的ES细胞因neo对G418有耐受性而存活。
其中发生同源重组的细胞的非同源片段(HSV-tk)将被切除,而发生随机整合的细胞则由于tk的存在而被培养基7Ξ收稿日期:2001—07—31中的丙氧鸟苷(G anciclovir,G ANC)杀死(图1)。
3 利用基因打靶技术实现精细的突变在基因组中引入精细的突变可以避免在重组位点留下外源的选择性标记,从而使人们可以对基因的功能进行更为精确的研究。
引入精细突变的策略主要有以下几种:311 “打了就走”(Hit and Run)Hasty等和Valancius等于1984年提出了“Hit and Run”法,或称为“In-Out”法[4,5]。
构建一种插入型载体,在载体的同源序列含所需的突变序列,同源序列之外含有正、负两种选择性标记。
首先将这个打靶载体转染ES细胞,然后用G418来筛选neo+同源重组的细胞。
插入的重复序列会自发地进行染色体内的重组,将载体序列、标记基因及一个拷贝的同源序列切除。
由于负选择基因被切除,故可用相应的药物作为培养基来筛选发生了染色体内重组的细胞。
312 双置换法(Double Replacement)双置换法由Wu等[6]于1994年提出。
设计一种携带有正、负选择标记的置换型载体,奖其转染ES细胞,通过正向选择筛选出同源重组的细胞。
然后将另一个不含任何标记基因而仅有目的基因的载体导入筛选出来的ES细胞,再通过负向选择筛选出携带所需突变序列的细胞。
313 Cre/LoxP系统介导的策略Cre/LoxP系统是噬菌体P1的位点专一性重组系统。
Cre重组酶是重组酶Int家族中的成员,能介导两个同向的LoxP位点间DNA片断的特异性切除[7]。
打靶载体的同源序列区含有目的基因片断,以及正、负选择标记,且标记基因的两端连有两个LoxP位点,将其转染ES细胞后,使Cre重组酶在ES细胞中短暂表达,这样就导致了LoxP位点特异性重组而将LoxP之间的DNA序列切除,仅余下一个LoxP,获得无筛选基因的突变。
4 条件性基因打靶(Conditional G ene Targeting)传统的基因打靶技术是直接灭活ES细胞中的靶基因,如果这种基因对胚胎发育有至关重要的作用,常常导致死亡,打靶后由ES细胞发育成的个体,其组织器官细胞中的此基因都将灭活。
条件性基因打靶能将这种灭活面局限于特定时间和某一特定组织细胞内,这将具有很大的应用价值。
条件性基因打靶也是基于Cre-LoxP或Flp-FR T 的系统,它不仅能通过重组酶将选择性标记去除,还能使打靶产生的变异在时间、空间是或时空上都具有特异性。
Gu等[8]利用这种策略首先实现了DNA聚合酶β基因在T细胞的灭活。
现在进行条件性基因打靶,一般需要制备两种转基因小鼠。
一种能在不同的特定组织或时间内表达重组酶,另一种鼠系在靶基因的两侧带有能被重组酶识别的位点,将这两种小鼠交配,便可获得所需的条件性基因打靶小鼠。
此外,将Cre基因置于可诱导的启动子控制下时,可以通过诱导表达Cre重组酶而将LoxP位点之间的基因切除,从而实现时空特异性的基因打靶。
例如Stonge 等[9]利用基因四环素(tetracycline,Tet)的诱导基因表达系统,首先获得了在某一组织器官特异性表达Cre和四环素转录激活子(t TA)的转基因小鼠,再将该鼠与携带打靶载体的LoxP修饰小鼠交配,所产后代若服用Tet,可引起t TA蛋白构型发生变化,从而阻断四环素反应因子(TRE)的转录;若在某一发育阶段停止服用Tet,则t TA激活TRE,使TRE下游的Cre基因在某一组织器官特异性表达,经Cre介导的位点发生特异性重组,从而以时空的方式进行了基因打靶。
现在,人们利用其他诱导系统如基于脱皮激素(ecdysone)或化学性诱导二聚体(chemical inducer of dimerization,CIDs)的诱导系统等也能实现时空特异性基因打靶。
5 展望目前人类全基因组序列分析已基本完成,功能基因组学研究正在大规模地启动,基因打靶已成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一,这项技术将对哺乳动物发育生物学、免疫学、肿瘤学、神经生物学以及医学遗传育种等学科产生深远的影响。
建立人类疾病的基因打靶小鼠模型将为成功地进行更复杂、精确的基因治疗研究打下基础。
现在,在体细胞进行基因打靶成为现实,利用基因打靶技术将外源基因在ES细胞或其他体细胞中实现定位整合和高表达,再利用显微注射或核移植技术生产转基因大动物具有巨大的发展潜力。
随着这项技术的发展,将来的研究重点可能围绕在改进打靶策略,提高打靶效率以及进一步发展可诱导型的组织特异性的基因打靶体系。
今后,基因打靶研究将在各种人类体细胞系统中广泛地开展,并将极大地促进体细胞基因治疗的研究和应用。
参考文献:[1]Doetschman T.et al.N ature.1987.330:57657-57658.[2]Mateyak M K.Cell Grow th Dif f.1997.8:1039.[3]Mansour S L et al.N ature.1988.336:348-352.[4]Hasty P et al.N ature.1991.35?243-246.[5]Valancius V et al.Mol Cell Biol.1991.11:4389-4397.[6]Wu H et al.Proc N atl A.1994,91:2819-2823.[7]K ilby N J.et al.T rends Genet.1993.9(12):413-421.[8]Gu H et al.Science.1994.265(5168):103-106.[9]Stonge L et al.N ucleic Acids Res.1996.24(19):3875-3877.Progress of researches on the technology of gene targetingXU E Meng(Comparative medicine center,Yang zhou University,Yang zhou,225009) Abstract:G ene targeting plays important role in the construction of animal models with human hereditary diseases, gene therapy and gene function resarches.The widely used strategies of gene targeting were reviewed,and progress of re2 searches on these technologies was introduced.K ey w ords:gene targeting;gene knockout;homologous recombination;embryonic stem cell.8。