大肠杆菌高细胞密度发酵
大肠杆菌高密度发酵
课程设计说明书
课程名称：发酵工程
设计题目：大肠杆菌的高密度发酵
院系：生物与食品工程学院
学生姓名：******
学号：************
专业班级：10生物工程（2）班
指导教师：*****
课程设计任务书
大肠杆菌的高密度
摘要：在工业生产过程中，由于技术或是生产条件的限制，在大肠杆菌高密度发酵培养中很难实现其高密度发酵。针对这一问题，我组专门为此设计一实验来探索发酵过程中的限制性因素。我们从开始的发酵培养基的组分及其配比，到后来的灭菌方式，投料程序以及在发酵过程中温度的设定控制，PH值的设定控制及溶氧的设定控制都进行了严格的监测，再到最后的OD值，氨基氮以及还原糖的测定都进行严谨的完成。
关键词：大肠杆菌高密度发酵OD值
目录
1.设计背景 (1)
1.1大肠杆菌高密度发酵产品及其质量安全现状 (1)
1.2高密度发酵定义 (1)
1.3 规定标准 (1)
2.设计方案 (2)
3.方案实施 (3)
3.1 大肠杆菌简介 (3)
3.2 菌种选材 (3)
3.3 种子扩大培养 (3)
3.4 发酵培养基配比 (3)
3.5 发酵过程 (4)
4.结果与结论 (7)
5.收获与致谢 (9)
6.参考文献 (10)
1.设计背景
1.1大肠杆菌高密度发酵产品及其质量安全现状
目前，在发酵产业进入工业化，自动化的今天，产品的高密度发酵越来越受到国内外的重视。人们在根据实验与生产阶段总结的经验中，逐步掌握发酵生产所需要的最佳控制条件。在此过程中所得的产品密度更大，纯度更高，质量安全也得到了保障。
1.2高密度发酵定义
高密度发酵（high cell density cultivation，HCDC)是指在一定条件和培养体系下，获得最多的细胞量，由此更多地或更高效地获得目的产物。即利用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著提高，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)。通常认为菌体密度超过50 g(DCW)／L即为高密度发酵。根据硒计算，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400 g(DCW／L)，考虑到实际情况中的种种条件限制，Makel等认为最高的菌体密度为200 g(DCW／L)，此时发酵液的25％充满了长3 um，宽1um的大肠杆菌，发酵液粘度很高，几乎丧失流动性。
微生物的高密度培养
微生物的高密度培养
高密度培养的定义：
高密度培养：是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。
一般认为，细胞密度接近理论值的培养为高密度培养。但由于菌种、菌株及目标产物差异性较大，高密度培养的最终菌体生物量无法用一个确切的值或范围界定。Riesenbere经计算认为，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400g/L，考虑到实际情况的种种条件限制，Markel等认为最高菌体密度为200 g/L，此时，发酵液25%充满长3μm，宽1μm的菌体，发酵液粘度很高，几乎散失流动性。
而某些极端微生物细胞密度达到数克每升也可认为是高密度培养。高密度培养技术最早用于酵母细胞的培养提高生物量或生产单细胞蛋白及乙醇的生产。随着基因工程技术的发展和应用，构建基因工程菌已经成为提高目标蛋白表达水平的一项基本手段。基因工程菌过量表达目标产物还有助于简化后续的分离纯化操作，同时也便于基因工程改造。其中大肠杆菌、酵母是最常用的重组表达宿主菌
高密度培养的优势:
提高最终菌体生物量和目标产物的时空产率,缩小生物反应器体积，降低设备投资缩短发酵周期，减少水电使用，降低生产成本便于下游分离纯化工艺等
高密度培养主要限制因素:
固态或挥发性底物在液态培养基中,溶解限制底物对细胞生长可能存在限制或抑制作用。底物和产物的稳定性差或易挥发产物降解产物或代谢副产物的积累，对细胞生长产生限制。呼吸作用导致C02和热量的急剧积聚氧气需求量大，培养基黏度增加副产物的积累与毒害作用。
高密度培养的培养基：
高密度培养要求培养基含有细胞生长所需的所有营养成分，配比均衡，且浓度不会对细胞生长产生抑制作用。一般采用营养成分清晰的全合成培养基，便于发酵过程的调节控制和进一步的扩大培养。培养基必须包含细胞生长必需的碳源、氮源、无机盐及生长因子。高密度培养的初始发酵培养基营养成分必须低于抑制浓度，并结合恰当的流加补料策略提供营养物质，使细胞生长维持在最佳状态。
提高大肠杆菌高密度发酵可溶性表达量研究
提高大肠杆菌高密度发酵可溶性表达量研究
目的：提高外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达量。方法：采用大肠杆菌K12菌株，含有表达某种抗体类蛋白的表达质粒，通过在发酵过程中加入甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的方式，检测不同发酵时间表达量变化情况，评估每种物质对于目的蛋白在大肠杆菌中可溶性表达的影响。结果：同时加入甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的发酵批次可溶性蛋白表达量最高。结论：说明在大肠杆菌高密度发酵过程中加入甲硫氨酸、亮氨酸和异亮氨酸有助于提高目的蛋白的可溶性表达。
标签：大肠杆菌；高密度发酵；甲硫氨酸；亮氨酸；异亮氨酸；可溶性表达
大肠杆菌是目前常用的蛋白发酵菌体，采用高密度发酵技术（High cell density cultivation，HCDC）不仅可以减少培养体积、提高目的蛋白产量，还可以缩短生产周期，减少设备投资从而降低生产成本，能极大地提高在市场上的竞争力[1]。但外源蛋白在获得高水平表达的同时，容易形成包涵体，包涵体中的多肽链折叠错误，没有活性，必须通过复杂的复性过程才能获得功能正常的蛋白，但成功率低[2]，特别是含二硫键较多的包涵体蛋白，在复性过程中容易发生二硫键的错配，从而使蛋白质失去生物学活性。蛋白的可溶性表达则可避免变、复性过程，明显简化后续纯化工艺，保证功能蛋白的功能。因此，探索外源蛋白在大肠杆菌中的可溶性表达具有较高的学术价值和广泛的应用前景。
目前针对于高密度发酵过程中蛋白可溶性表达的研究主要停留在对大肠杆菌宿主细胞[3]、比生长速率、诱导时机[4]、诱导温度[5]、培养基成分[6]、碳源种类[7]、表达载体启动子[8]、融合标签[9]等。关于发酵过程中补入氨基酸对可溶性蛋白表达的影响，国内目前的相关研究报道偏少。国外研究表明，在大肠杆菌表达蛋白期间，正亮氨酸残基的引入会导致正常合成的蛋白结构或功能改变[10]，引起可溶性蛋白表达量的降低。在发酵过程中，补入甲硫氨酸，可以确保细胞获得过量的甲硫氨酸，从而减少了甲硫氨酰tRNA不正确的加载正亮氨酸的概率。甲硫氨酸的加入可以抑制正亮氨酸的作用[11]，从而维持菌体蛋白合成的正常结构和功能。亮氨酸可以抑制酶参与正缬氨酸和正亮氨酸的合成，但是，亮氨酸同样影响细胞功能造成发酵结束时的细胞密度偏低。额外加入的异亮氨酸，则可以极大得增加重组蛋白产量[12]。其他防止正亮氨酸错误渗入细胞蛋白的方式还有删除亮氨酸操纵子等[13]。
重组大肠杆菌高密度发酵工艺流程
重组大肠杆菌是一种重要的工业微生物，具有广泛的应用价值。在大
肠杆菌高密度发酵过程中，流程的设计和优化对产品的质量和产量具
有重要影响。本文将围绕重组大肠杆菌高密度发酵工艺流程展开讨论，探讨其流程设计、优化及相关技术。通过对该工艺流程的深入研究，
不仅可以提高重组蛋白的产量和纯度，还可以降低生产成本，为工业
生产提供可靠的技术支持。
一、高密度发酵工艺流程概述
1.1 菌种培养和预处理
重组大肠杆菌菌种的培养是整个发酵过程的基础。首先需要进行菌种
的接种培养，培养基的选择、发酵条件的控制对于菌种的生长和繁殖
至关重要。对菌种的预处理也至关重要，包括对菌种进行筛选和培养
基的调整等。
1.2 发酵过程控制
发酵过程控制是重组大肠杆菌高密度发酵的关键环节，包括培养基的
添加、通气量的控制、温度、pH值的调节等。合理的发酵过程控制可以保证菌体的生长和代谢活性，从而提高产物的产量和纯度。
1.3 产物的回收和纯化
重组大肠杆菌高密度发酵后，产物的回收和纯化也是至关重要的环节。通过合理的回收和纯化工艺，可以获得高纯度的重组蛋白产品，满足
不同应用领域的需求。
二、高密度发酵工艺流程优化
2.1 发酵条件的优化
在重组大肠杆菌高密度发酵过程中，发酵条件的优化对产品的产量和
质量具有重要影响。包括但不限于培养基配方的优化、发酵温度、通
气量、pH值等参数的优化，通过优化发酵条件可以提高菌体的生长速率和产物的表达水平。
2.2 发酵过程监测与控制
发酵过程的监测与控制是优化工艺流程的重要手段，包括对菌体生长
情况的实时监测、代谢产物浓度的检测以及对发酵过程参数的实时调
重组大肠杆菌 高密度发酵工艺流程
重组大肠杆菌高密度发酵工艺流程
重组大肠杆菌是一种常用的工具菌株，被广泛应用于生物工程领域。高密度发酵是指在发酵过程中，通过优化工艺条件，使菌体达到较高的生长速率和产物产量。本文将介绍重组大肠杆菌高密度发酵的工艺流程。
一、菌种培养
重组大肠杆菌菌种的培养是高密度发酵的第一步。首先，选择合适的菌种，通常是具有高表达能力的重组菌株。然后，将菌种接种到培养基中，并在适当的条件下培养。培养基的组成要根据菌株的特性进行优化，以促进菌体的生长和表达目标蛋白的产量。
二、发酵过程控制
高密度发酵的关键是精确控制发酵过程中的各个参数，以最大限度地提高菌体的生长速率和产物产量。常见的控制参数包括温度、pH 值、溶解氧浓度和搅拌速度等。
1.温度控制：重组大肠杆菌的适宜生长温度通常在37℃左右。在发酵过程中，保持恒定的温度可以促进菌体的生长和产物的积累。
2.pH值控制：重组大肠杆菌对pH值的敏感性较高，通常在发酵过程中需要控制pH值在6-7之间。可以通过添加缓冲剂来维持合适的pH值。
3.溶解氧浓度控制：溶解氧浓度是影响菌体生长的重要因素之一。
通过调节搅拌速度和通气量等参数，可以控制发酵过程中的溶解氧浓度，从而提高菌体的生长速率。
4.搅拌速度控制：适当的搅拌速度可以提供充分的氧气和营养物质，促进菌体的生长和产物的积累。但过高的搅拌速度可能会导致剪切力过大，对菌体造成伤害。
三、营养物质的供应
在高密度发酵过程中，菌体需要大量的营养物质来支持生长和产物的合成。常见的营养物质包括碳源、氮源、磷源和微量元素等。在发酵过程中，需要根据菌株的特性和产物的需求，合理调整营养物质的浓度和比例。
重组大肠杆菌高密度发酵过程中乙酸的控制
提 高 产 率 ， 可 降低 培养 体 积 ； 升 下 游 操 作效 还 提 率； 降低 废水 等 的排放 ； 生产 成本较 低 以及 没备 投
入成本 较 低等 ［ 。 目前 ， ２ ］ 大肠 杆 菌 高 密度 发 酵 生 产重 组蛋 白过程 最 大的 问题与难 题就 是 乙酸 的生 成ｎ 。乙酸浓度 高 于 １０到 １ ５ｇ １ ， 仅抑 ］ ． ． ／ 时 不
收 稿 日期 ： ０ １０ — ５ ２ １—５２
杆菌 消耗氧 的能力 有限 。该氧消 耗速 率 的极 值对
基 金 项 目 ： 家 自然 科 学基 金 （ ． １ ０ ０ ９ 。 国 Ｎｏ ３ ０ ０ １ ） 作 者 简 介 ： 文 娇 （ ９ ６） 女 ， 西 榆 林 人 。 士 ， 理 研 究 员 ． 究 方 向 ； 薛 １ ７一 ， 陕 博 助 研 微生 物 发 酵 技 术研 究 。
乙酸 的培 养基 的设 计和培 养条 件的优 化 。而 基 因 工程 的方 法是 通过 改变微 生物 自身 的基 因以减少 乙酸 的生 化合 成 。本文将 主要 介绍过 程控制 方 面
杆菌培养体系 中达到高细胞密度非 常重要 。
２ 重 组 大肠 杆 菌高 密度 发 酵过 程 乙 酸 的控 制
要： 大肠 杆 菌是 工业 生物 技 术 应 用 最 广 泛 的 生 产 菌 种 ． 当其 在 葡 萄糖 培 养 基 上 快 速 生长 时 ． 乙酸 作 为副 产
最新大肠杆菌发酵经验总结
大肠杆菌发酵经验总结
首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。
其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。
第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。
第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。
根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。
大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下几点，并作出相应解决措施。
大肠杆菌发酵经验总结
大肠杆菌发酵经验总结
大肠杆菌发酵经验总结
首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。
其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。
第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。
第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。
根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。
大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，现总结以下几点，并作出相应解决措施。
高密度发酵技术
高密度发酵技术：高密度发酵技术是一种在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上的生长状态或培养技术。这种技术的主要目的是提高菌体发酵密度，从而提高产物的比生产速率（单位体积单位时间内产物的产量）。通过提高菌体培养密度，可以减少培养容器的体积、培养基的消耗，并提高下游工程中分离、提取的效率。同时，高密度培养还可以缩短生产周期、减少设备投入和降低生产成本，因此具有重要的实践价值。
重组大肠杆菌产耐热α-L-鼠李糖苷酶高密度发酵条件的优化
α-L-鼠李糖苷酶（α-L-rhamnosidase ，EC 3.2.1.40）
广泛存在于自然界中，如哺乳动物组织、植物、真菌、细菌等[1-4]。该酶是一种应用广泛的糖苷水解酶，它能高效
水解多种末端含有非还原性鼠李糖残基的天然化合物，如水解芦丁为异槲皮苷[3]，水解淫羊藿苷C 为淫羊藿苷[5]，水解柚皮苷为普鲁宁等[4]。此外，少数α-L-鼠李糖苷酶还能以L-鼠李糖为供体，通过逆水解反应催化合成鼠李糖苷，如甘露醇鼠李糖基化、酚类化合物鼠李糖
基化等[6，7]
。迄今为止，根据CAZy 数据库，α-L-鼠李糖
苷酶分属于三大糖苷水解酶家族，即GH13家族、GH78家族和GH106家族[8]，其中大部分属于GH78家族。此外，α-L-鼠李糖苷酶是一种重要的酶，在食品和制药工业中有着广泛的应用。然而，目前报道的α-L-鼠李糖苷酶普遍产量不高，到目前为止，全球还没有商品化的α-L-鼠李糖苷酶产品，这极大限制了该酶在工业上的
应用。
大肠杆菌是遗传背景最清楚的菌株，其具有培养成本低、抗污染能力强、生长周期短、蛋白表达量高等优势，已经成为最常用的外源蛋白表达系统。采用高密度发酵技术，能显著提高所培养的菌体密度，最终增加单位体积单位时间内目的产物的比生产率，缩减生产周期，提升经济效益，已经在工业中有很广泛的应用[9]。在大肠杆菌高密度发酵中，大多采用补料分批发酵方式，以实现高密度的大肠杆菌和所需的蛋白质生产[10]。这
种补料方式一方面可以避免因某些营养成分初始浓度过高而出现底物抑制现象，另一方面又能够防止因限制性营养成分被耗尽而影响细胞的生长和产物的形成。重组大肠杆菌高密度发酵是一个复杂的过程，需要对其生长的发酵参数进行优化，如葡萄糖进料速率、诱导温度、诱导pH 等。葡萄糖是一种便宜且速效碳源，在大肠杆菌发酵生产中优于其他碳源。但是，在有氧条件下，过多的葡萄糖会导致大肠杆菌代谢副产物的产生。最常见的副产物是乙酸，它是由磷酸转乙酰酶（PTA ）/乙酸激酶（ACKA ）和丙酮酸氧化酶（POXB ）两种途径产生的[11]，主要原因是加入中央代谢系统的碳与细胞呼吸或三羧酸循环的有限能力之间不平衡[12]。乙酸的积累通常发生在大肠杆菌的快速生长期，尤其是在所需蛋白质合成的诱导阶段，会抑制生长和产物的形成[13]。因此，对于补料分批发酵生产重组耐热α-L-鼠李糖苷酶来说，构建一种避免补料不足或过量的补料策略是极其重要的。在确保溶解氧恒定的情况下，诱导温度和诱导pH 对高密度发酵过程诱导后代谢乙酸的积累量产生影响[14]。在高温条件下加速细胞的新陈代谢和生长，导致大量乙酸的形成[15]。诱导后的pH 值是通过添加氨水形成铵盐来降低乙酸浓度的关键因素。然而，高浓度的NH 4+对能源效率和大肠杆菌的生长有负面影响[15]。到目前为止，关于调控乙酸来提高耐热α-L-鼠李糖苷酶
大肠杆菌发酵经验总结
大肠杆菌发酵经验总结
大肠杆菌发酵经验总结
首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。
其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。
第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。
第四，补料过程中的碳氮比也很重要。若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。
根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。可以适当调整碳氮比。
大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，现总结以下几点，并作出相应解决措施。
发酵工艺：工程菌高密度发酵工艺开发策略8项(以大肠杆菌为例)
发酵工艺：工程菌高密度发酵工艺开发策略8项（以大肠杆菌为例）利用重组DNA技术获取的生物药物在人类文明史上具有划时代的意义。许多价值高产量低的功
能蛋白如干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、生长激素、胰岛素、人血白蛋白、蛋白酶等都
在工程菌中获得了高效率表达。由于工程菌高密度培养能够提高单位体积的产量，在工业生产
上可以提高效率降低成本。所以，高密度培养一直都是发酵工程师们所追捧的热点。本文就工
程大肠杆菌高密度发酵工艺开发中涉及的关键控制点加以探讨。
1
工程菌种
稳定可靠的菌种是工业化大生产的有力保障，直接关系到生产效率和成本高低。不同于传统诱
变育种模式，在对待工程菌菌种问题上，有人认为基因工程菌种构建完成后无需经过严格单克
隆筛选，既节约时间成本又大大减少了工作量，这其实是一个认识误区。这样做出来的菌种很
难连续稳定传代50次以上，给中试放大以及后续的长期稳定生产留下了隐患。业内一般以能否
稳定遗传50代作为判断工程菌种优劣的一个标准。
发酵所需的接种量不是越大越好，要适当。接种量过小导致适应期过长，菌种易提前老化，也
增加了杂菌污染的风险。接种量过大会过早引起溶氧不足，导致发酵失控。且营养物质消耗过
快也会影响后期正常生长。一般大肠杆菌接种量遵循逐级增大的原则，并将最后一级的放大倍
数控制在10倍左右。
种子培养一定要在最佳条件下进行，培养时间不宜过长，当种子生长至最佳状态时果断移种。
如果种子做的不好，其负面影响往往在发酵中后期会有所体现。工程菌种培养会加入抗生素，
不仅是为了抑制杂菌生长，更重要的是为了给菌种形成正向的抗性筛选压力，及时淘汰质粒丢
2、什么是高密度培养,举例论述如何利用高密度培养技术来
2、什么是高密度培养，举例论述如何利用高密度培养技术来某一产品的。
答：高密度培养有时也称高密度发酵，一般是指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术，现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌生产多肽类药物的实践中逐渐发展起来的。
重组大肠杆菌高密度培养技术
摘要：阐述了基因工程菌高密度发酵工艺的几个主要影响因素,包括重组菌构建、培养条
件、生长抑制因子以及它们的控制技术。通过高密度发酵可以提高细胞生长密度、目的蛋白的表达含量。在高密度发酵过程中,会产生一些有害抑制代谢副产物,但通过分批补料可以降低影响。
关键词:高密度发酵; 分批补料; 生长抑制因子。
重组ＤＮＡ技术和大规模培养技术的有机结合,使得原来无法大量获得的天然蛋白质能够规模生产。目前,已经在高密度培养中成功地提高了同源和异源蛋白的产量。分批补料培养通常被用于微生物发酵,这种方法通过在培养过程克服细胞的调节机制:苹果酸影响,催化阻遏,产生抑制,使细胞密度达到较高水平。
大肠杆菌高密度培养工艺广泛地应用于重组蛋白的生产,这主要是由于大肠杆菌的遗传学和生理学已基本被认清。产量的高低主要取决于细胞密度、目的蛋白的表达含量。但在培养过程也存在一些问题,如氧、基质的利用率、小分子物质、生长抑制物的积累等。因此,减少抑制物的形成,提供良好的生长条件是必要的。
1 重组大肠杆菌构建的几个影响因素
1.1宿主菌的选择
不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在很大差别。现在普遍应用的大肠杆菌ＢＬ21(ＤＥ3)ｐｌｙｓＳ因其带有编码Ｔ7溶菌酶的小质粒,而有效地降低杂蛋
大肠杆菌高密度发酵中乙酸代谢
文献介绍
• 发酵过程概述
•
在葡萄糖体和乙酸都消耗的时期，大约在6.5小时，异柠檬酸盐裂
解酶的特殊活性大约增加了4倍，可以观察到最初的乙醛酸旁路途径。
转换之后，这种酶活性的增加与乙酸的消耗直接相关。
• PH6.5、糖功率2.0 g/L发酵简述
•
最初 5 h发酵，初期的生长率是0.985 h-1,与0.5 g/L葡萄糖发酵的
文献介绍
• 发酵过程概述 发酵中维持可溶的葡萄糖浓度至3.5小时，此时出现了一个短暂的
下降 ，这种异常现象出现在每个发酵过程。 大约生长6小时后，培养基中干重细胞的密度大约是30g/L而乙酸
大约达到9.5g/L。葡萄糖和氧气的消耗率，二氧化碳的排泄率突然减 小（表2B,C），葡萄糖需求量的突然减小通常发生在高于运算反映的 某个点上，导致明显的葡萄糖溶液浓度的的瞬时增大，我门们已经命 名培养基的这个时期，此时的代谢将会出现大约40分钟的停滞，葡萄 糖浓度的短暂降低之后，培养基的PH开始升高由于培养基中乙酸的 消耗。停滞大约40mim之后，糖和氧 的消耗降低。糖和乙酸的消耗同 时重新开始直到达到乙酸最大浓度的一半时为止，此时，乙酸的消耗 降低。培养物回到了正常的需氧代谢生长期。此时，糖开始消耗、乙 酸开始产生。并且乙酸的产生率很低，此时培养基PH值下降到最初 的设定值。
B：乙酸：通过两图的对比可知，PH7.0、糖浓度0.5g/L时，乙酸产生量较 大。
大肠杆菌培养基的优化及发酵罐操作
发酵操作 ������
当发酵罐内温度达到并维持在所需温度后， 进行如下操作： 1、取样：松开弹簧夹J2，用无菌空气将取样管残 液压入发酵罐内，再夹紧J2，将出料管放入接料 瓶，松开取样管弹簧夹J3，发酵液被压入接料瓶， 开J2、J3排出取样管内残料，夹紧J2、J3 2、接种：将酒精棉置于接种口槽中，旋松接种口， 点燃酒精棉，在火焰保护下，打开接种口，倒入 二级种子，然后旋紧接种盖，移去火焰圈。接种 后立即进行第一次取样，用于测定细菌OD值。
溶氧控制的分批补料培养
控制的几个关键参数如下： 1、温度：培养温度为37 ℃。 2、pH：自动流加30%的氨水，使PH保持 在7.0左右。 3、葡萄糖的流加：根据发酵的实际经验，流 加补料分三个阶段进行，发酵过程中0~4h 不加补料，4~10h补加含50g葡萄糖的补料， 10~20h加入含190g葡萄糖的补料，诱导前 0.5h追加100ml补料。
大肠杆菌高密度培养最关键的问题是代谢副产物 乙酸积累所引起的抑制和毒害作用。 预防措施： 1、通过控制比生长速率来减少乙酸的产生：比生长 速率越高，乙酸产生越多，当比生长速率超过某个值 时，乙酸开始产生。可以通过降低温度，调节酸碱度， 控制补料等方法来降低比生长速率。 2、透析培养：在大肠杆菌的培养过程中可以用透析 技术除去发酵液中的有害物质，降低乙酸含量从而实 现重组菌的高密度发酵和产物的表达。 3、控制葡萄糖的浓度：葡萄糖是大肠杆菌发酵过程 中重要的碳源之一，用其作碳源是要将其控制在一个 较低的水平上，以减少乙酸的产生。
大肠杆菌高度发酵控制关键误区
大肠杆菌高度发酵控制关键误区
大肠杆菌高密度发酵过程溶氧与氧分压和传质速度有关这众所周知，除此之外影响溶氧的最大因素是发酵过程中的耗氧，这一点很容易忽略。耗氧不仅影响菌体密度还影响蛋白表达。发酵过程中需要监测的是耗氧，但是耗氧通常是通过溶氧去监测。
溶氧为零时并非成了厌氧发酵。厌氧发酵是不通入氧，而溶氧为零是通入的氧等于或小于耗氧。在大肠杆菌高密度发酵的中后期，经常会出现溶氧为零的情况，此时若选择降低补料速度等方式使溶氧恢复到一定数值，这种做法并非是提高了溶氧而是降低了耗氧，这样严重影响菌体繁殖和蛋白表达。
大肠杆菌高密度发酵中后期，随菌体密度增大，菌体代谢旺盛，耗氧急速上升，发酵过程需氧量增大，在供氧不足时很容易出现溶氧为零的现象，此时若通过降低补料速度等方式使溶氧呈现出一定的数值，使蛋白过程降低，菌体代谢过程减缓就大错特错，这种做法并没有提高发酵过程的供氧。此时需要加大供氧而非干预耗氧。
增大供养，保持一定溶氧的策略
1.提高通气量
2.提高罐压，增大氧分压
3.提高转速，增大传质速度
4.改变通入气体中的氧的比例，如空气和纯氧以一定的比例混合在通入
概述
重组大肠杆菌的高密度培养的目的在于获得更高的目标蛋白单位体积产量。但是在重组大肠杆菌的高密度培养过程中，常常遇见的是高密度低表达现象，表达效率只有摇瓶的三分之一。实现外源蛋白在菌体高密度培养过程中高效率表达仍是工程重组菌发酵的研究热点。
添加复合氮源
菌体生长至高密度时，营养成分逐步耗尽。营养的缺乏也是限制高密度培养下实现高表达的因素。Shimizu等发现在表达阶段，限制蛋白胨和酵母抽提物的浓度，对外源基因表达不利，补料液中加大酵母抽提物比例可以提高外源蛋白的表达量。认为有机氮源提供丰富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素以及一些生物活性物质，减轻了细胞代谢负担，促进了外源蛋白的表达。
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课程设计说明书
课程名称：发酵工程
设计题目：大肠杆菌的高细胞密度发酵
院系：生物与食品工程学院
学生姓名：郑帅超
学号：201106040030
专业班级：11 生物技术
指导教师：李安华
2014年5月26日
课程设计任务书
设计题目枯草芽孢杆菌产淀粉酶发酵工艺的优化
学生姓名郑帅超所在院系生物与食品工
程学院
专业、年级、班11生物技术
设计要求：
1、树立正确的设计指导思想，严谨负责、实事求是、刻苦钻研、勇于探索的作风和学风。
2、根据所给资料，按照任务书中提出的范围和要求按时独立完成，不得延误，不得抄袭他人成果。
3、说明书应字迹清楚文字通顺，并附有各项设计成果表，摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。
4、设计标准要求规范、实用、切合实际。
5、设计应严格按有关设计规范进行。
6、设计结束后，以个人为单位提交设计说明书一份（后附流程图）。
学生应完成的工作：
1、在老师的帮助下完成题目设计。
2、学生查阅相关文献、资料制定实验路线，并有指导老师检查实验路线的合理性和可行性。
3、学生在实验室完成实验方案。
4、完成课程设计说明书的初稿，由指导老师帮助修改，最后定稿。
参考文献阅读：
[1]李寅等著，高细胞密度发酵技术，化学工业出版社，2006-10-01，177~288.
[2]陈坚,李寅,毛英鹰,等. 生物工程学报,1998 ,14(4) :452～455.
[3]李民,陈常庆,朴勤,等. 生物工程学报,1998 ,14(3) :270～275.
[4]杨汝燕,李民,陈常庆. 工业微生物,1998 ,28(3) :30～33.
[5 ]李民,陈常庆,朴勤等,生物工程学报,1998 ,14 (3) :270~275.
[6]杨汝燕,李民,陈常庆,工业微生物,1999 ,29(1) :25～28.
[7]徐皓,李民,阮长庚,等. 工业微生物,1998 ,28(2) :20～25.
[8]刘社际,葛永红,杨立明. 中国生物制品学杂志,1999 ,12 (1) :29 ～31.
工作计划：
2013.5.11分组并确认指导老师，在老师指导下查阅文献，确定题目。
2013.5.12----2013.5.13 进行理论试讲阶段，确定实验路线，然后确定实验方案。
2013.5.14----2013.5.17 进行实验操作和书写设计说明书。
2013.5.18----2013.5.22 修改说明书，和指导老师沟通。
2013.5.23—2013.5.26 上交课程设计说明书，并由指导老师填写评语和成绩。
任务下达日期：2014年5月13日
任务完成日期：2014年5月26日
指导教师（签名）：学生（签名）：
枯草芽孢杆菌产淀粉酶发酵工艺的优化
摘要：大肠杆菌被广泛地用于基因工程菌的构建，以获得大量的外源基因产物,利用基因重组技术构建的基因工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺。生物工程菌发酵的目的是希望能获得大量的外源基因产物,尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。外源基因的高水平表达不仅涉及宿主,载体和目的基因三者之间的相互关系,而且与其所处环境条件息息相关。因此仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远不够的,需要对影响外源基因表达的因素进行分析,探索出适于外源基因高效表达的发酵工艺。高密度、高产率和高浓度培养是近几年发酵工业的目标和方向。近几年,人们对高密度发酵(high cell density fermentation)进行了大量的研究,并取得了可喜的成果。对于大肠杆菌,尤其是重组大肠杆菌的发酵来讲,实现高密度发酵,可相应地缩小生物反应器的体积和降低生物量的分离费用,从而降低生产成本,达到提高生产效率的目的。本文就大肠杆菌高密度发酵的影响因素包括培养基、培养条件、补料方法、发酵工艺以及高密度发酵过程中存在的问题和对策加以讨论,并探讨了如何提高大肠杆菌高密度发酵工艺技术水平。
关键词：大肠杆菌高密度发酵培养基溶氧值菌体密度
目录
1.设计背景 (1)
1.1 大肠杆菌简介 (1)
1.2 高细胞密度发酵技术概述 (1)
1.3 影响大肠杆菌高细胞密度发酵的因素 (2)
2.设计方案 (3)
2.1实验材料与条件 (3)
2.2培养基 (3)
2.3总工艺流程 (4)
3.方案实施 (5)
3.1 种子的扩大培养 (5)
3.3发酵罐的灭菌——实消 (5)
3.4接种 (5)
3.5取样检测分析 (5)
3.6补料 (6)
3.7倒罐 (6)
4.收获与致谢 (7)
5.参考文献 (8)
6.附件 (9)
1.设计背景
1.1 大肠杆菌简介
大肠埃希氏菌(Escherichia coli)通常称为大肠杆菌，1885年由Theodor Escherich 发现，分布在自然界，大多数是不致病的，主要附生在人或动物的肠道里,为正常菌群，少数的大肠杆菌具有毒性,可引起疾病。大肠杆菌是细菌，属于原核生物，具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核，细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。其代谢类型是异养兼性厌氧型。
大肠杆菌在生物技术中的应用：大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。
在培养基选体系培养时无需添加生长因子，向培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌，菌落呈深紫色，并有金属光泽，可鉴别大肠杆菌是否存在。
1.2 高细胞密度发酵技术概述
基因工程技术和大规模培养技术的有机结合，使得原来无法获得的许多天然蛋白能够大量生产：由于大肠杆菌(EscheHchia colo结构简单、遗传学背景清晰、生长周期短、生长条件清楚，成为最为常用的宿主菌,已被广泛应用于重组蛋白,以及非蛋白的生物分子，如氨基酸等的生产。高细胞密度发酵(high cell density cultivation，HCDC)是指在一定条件和培养体系下，获得最多的细胞量，由此更多地或更高效地获得目的产物。即利用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著提高，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)。实现高密度发酵不仅可以减少培养体积，强化下游分离提取，还可以缩短生产周期、减少设备投资，从而降低生产成本。
通常认为菌体密度超过50 g(DCW)／L即为高密度发酵。根据Riesenbere计算，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400 g(DCW／L)，考虑到实际情况中的种种条件限制，Markel认为最高的菌体密度为200 g(DCW／L)，此时发酵液的25％充满了长3 µm，宽1µm的大肠杆菌，发酵液粘度很高，几乎丧失流动性。迄今为止，大肠杆菌发酵菌体密度最高的两例为：非重组E coli W3110达174 g(DCW／L)，生产聚．3．羟基丁酸的重组菌达1 75．4 g(DCW／L)。