大肠杆菌高细胞密度发酵
微生物的高密度培养
微生物的高密度培养高密度培养的定义：高密度培养：是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。
一般认为，细胞密度接近理论值的培养为高密度培养。
但由于菌种、菌株及目标产物差异性较大，高密度培养的最终菌体生物量无法用一个确切的值或范围界定。
Riesenbere经计算认为，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400g/L，考虑到实际情况的种种条件限制，Markel等认为最高菌体密度为200 g/L，此时，发酵液25%充满长3μm，宽1μm的菌体，发酵液粘度很高，几乎散失流动性。
而某些极端微生物细胞密度达到数克每升也可认为是高密度培养。
高密度培养技术最早用于酵母细胞的培养提高生物量或生产单细胞蛋白及乙醇的生产。
随着基因工程技术的发展和应用，构建基因工程菌已经成为提高目标蛋白表达水平的一项基本手段。
基因工程菌过量表达目标产物还有助于简化后续的分离纯化操作，同时也便于基因工程改造。
其中大肠杆菌、酵母是最常用的重组表达宿主菌高密度培养的优势:提高最终菌体生物量和目标产物的时空产率,缩小生物反应器体积，降低设备投资缩短发酵周期，减少水电使用，降低生产成本便于下游分离纯化工艺等高密度培养主要限制因素:固态或挥发性底物在液态培养基中,溶解限制底物对细胞生长可能存在限制或抑制作用。
底物和产物的稳定性差或易挥发产物降解产物或代谢副产物的积累，对细胞生长产生限制。
呼吸作用导致C02和热量的急剧积聚氧气需求量大，培养基黏度增加副产物的积累与毒害作用。
高密度培养的培养基：高密度培养要求培养基含有细胞生长所需的所有营养成分，配比均衡，且浓度不会对细胞生长产生抑制作用。
一般采用营养成分清晰的全合成培养基，便于发酵过程的调节控制和进一步的扩大培养。
培养基必须包含细胞生长必需的碳源、氮源、无机盐及生长因子。
高密度培养的初始发酵培养基营养成分必须低于抑制浓度，并结合恰当的流加补料策略提供营养物质，使细胞生长维持在最佳状态。
大肠杆菌表达系统
大肠杆菌表达系统总结随着分子生物学和蛋白组学的迅猛发展，外源基因表达的遗传操作技术日趋成熟。
表达系统是外源基因表达的核心，常用表达系统一般为模式生物，包括真核表达系统和原核表达系统，其中真核系统包括了哺乳动物细胞表达系统、植物体表达系统、昆虫杆状病毒表达载体系统以及酵母表达系统，原核表达系统则主要为大肠杆菌表达系统。
大肠杆菌是目前应用最广泛的原核表达系统，也是最早进行研究的外源基因表达系统，其遗传学背景清晰、生长快、较易实现高密度培养、成本低、产量高，相较于其它表达系统具有难以比拟的优越性，是商业生产中应用最广泛的表达系统，取得了巨大的科研价值和经济效益。
大肠杆菌表达系统目前广泛应用于表达生产多种蛋白质/多肽类药物和生物化学产品，包括：重组人胰岛素、a2b型干扰素、兰尼单抗、紫色杆菌素和牡丹皮葡萄糖苷等。
据统计，1986-2018年由美国FDA和欧洲EMA批准上市的重组蛋白类药物中有26%来自于大肠杆菌。
与此同时，目前通过大肠杆菌表达的基因工程疫苗也进入市场或处于临床实验阶段，如戊型肝炎疫苗、人乳头瘤病毒疫苗、流感A型疫苗等。
常见的大肠杆菌表达系统有BL21系列、JM109系列、 W3110系列和K802系列等，其中大肠杆菌 BL21（ DE3）菌株是目前应用于重组蛋白表达研究最广泛的菌株之一，BL21（DE3）是由大肠杆菌B系列与K-12系列的衍生菌株通过 P1 转导等遗传突变获得的。
该类菌株通常为宿主蛋白酶缺失型，以保证外源蛋白在表达过程中不被降解，维持表达的稳定性。
大肠杆菌表达系统在商业生产中具有巨大的优越性和价值，但建立高效匹配的表达系统是实现商业价值的关键，包括宿主菌、外源基因、载体的选择与匹配。
宿主菌的选择是第一步，对表达活性和表达量影响很大，理想的宿主菌株是蛋白酶缺陷型，避免蛋白酶过多引起的产物不稳定，常见的蛋白酶缺陷型菌株为BL21系列菌株。
其次是外源基因，外源基因决定了是否可获得目的产物，原核基因可在大肠杆菌中直接表达，而真核基因不能再大肠杆菌中直接表达。
重组大肠杆菌高密度发酵工艺流程
重组大肠杆菌是一种重要的工业微生物，具有广泛的应用价值。
在大肠杆菌高密度发酵过程中，流程的设计和优化对产品的质量和产量具有重要影响。
本文将围绕重组大肠杆菌高密度发酵工艺流程展开讨论，探讨其流程设计、优化及相关技术。
通过对该工艺流程的深入研究，不仅可以提高重组蛋白的产量和纯度，还可以降低生产成本，为工业生产提供可靠的技术支持。
一、高密度发酵工艺流程概述1.1 菌种培养和预处理重组大肠杆菌菌种的培养是整个发酵过程的基础。
首先需要进行菌种的接种培养，培养基的选择、发酵条件的控制对于菌种的生长和繁殖至关重要。
对菌种的预处理也至关重要，包括对菌种进行筛选和培养基的调整等。
1.2 发酵过程控制发酵过程控制是重组大肠杆菌高密度发酵的关键环节，包括培养基的添加、通气量的控制、温度、pH值的调节等。
合理的发酵过程控制可以保证菌体的生长和代谢活性，从而提高产物的产量和纯度。
1.3 产物的回收和纯化重组大肠杆菌高密度发酵后，产物的回收和纯化也是至关重要的环节。
通过合理的回收和纯化工艺，可以获得高纯度的重组蛋白产品，满足不同应用领域的需求。
二、高密度发酵工艺流程优化2.1 发酵条件的优化在重组大肠杆菌高密度发酵过程中，发酵条件的优化对产品的产量和质量具有重要影响。
包括但不限于培养基配方的优化、发酵温度、通气量、pH值等参数的优化，通过优化发酵条件可以提高菌体的生长速率和产物的表达水平。
2.2 发酵过程监测与控制发酵过程的监测与控制是优化工艺流程的重要手段，包括对菌体生长情况的实时监测、代谢产物浓度的检测以及对发酵过程参数的实时调节等。
通过发酵过程的精准监测和控制，可以最大程度地发挥菌体的生长和代谢潜力。
2.3 产物回收与纯化工艺的改进产物的回收与纯化是影响产品质量的关键因素，通过改进产物回收与纯化工艺，可以提高产品的纯度和收率，降低生产成本，提高经济效益。
三、高密度发酵工艺流程相关技术3.1 培养基配方优化技术合理的培养基配方对于重组大肠杆菌的生长和表达具有重要影响，通过优化培养基配方，可以提高菌体的生长速率和产物的表达水平。
重组大肠杆菌 高密度发酵工艺流程
重组大肠杆菌高密度发酵工艺流程重组大肠杆菌是一种常用的工具菌株，被广泛应用于生物工程领域。
高密度发酵是指在发酵过程中，通过优化工艺条件，使菌体达到较高的生长速率和产物产量。
本文将介绍重组大肠杆菌高密度发酵的工艺流程。
一、菌种培养重组大肠杆菌菌种的培养是高密度发酵的第一步。
首先，选择合适的菌种，通常是具有高表达能力的重组菌株。
然后，将菌种接种到培养基中，并在适当的条件下培养。
培养基的组成要根据菌株的特性进行优化，以促进菌体的生长和表达目标蛋白的产量。
二、发酵过程控制高密度发酵的关键是精确控制发酵过程中的各个参数，以最大限度地提高菌体的生长速率和产物产量。
常见的控制参数包括温度、pH 值、溶解氧浓度和搅拌速度等。
1.温度控制：重组大肠杆菌的适宜生长温度通常在37℃左右。
在发酵过程中，保持恒定的温度可以促进菌体的生长和产物的积累。
2.pH值控制：重组大肠杆菌对pH值的敏感性较高，通常在发酵过程中需要控制pH值在6-7之间。
可以通过添加缓冲剂来维持合适的pH值。
3.溶解氧浓度控制：溶解氧浓度是影响菌体生长的重要因素之一。
通过调节搅拌速度和通气量等参数，可以控制发酵过程中的溶解氧浓度，从而提高菌体的生长速率。
4.搅拌速度控制：适当的搅拌速度可以提供充分的氧气和营养物质，促进菌体的生长和产物的积累。
但过高的搅拌速度可能会导致剪切力过大，对菌体造成伤害。
三、营养物质的供应在高密度发酵过程中，菌体需要大量的营养物质来支持生长和产物的合成。
常见的营养物质包括碳源、氮源、磷源和微量元素等。
在发酵过程中，需要根据菌株的特性和产物的需求，合理调整营养物质的浓度和比例。
四、产物的回收和纯化高密度发酵得到的产物通常以细胞外分泌形式存在，因此需要对发酵液进行回收和纯化。
常用的方法包括离心、过滤、超滤和层析等技术。
通过这些步骤，可以将目标产物从发酵液中分离出来，并得到较高纯度的产物。
总结起来，重组大肠杆菌高密度发酵的工艺流程包括菌种培养、发酵过程控制、营养物质的供应和产物的回收和纯化等步骤。
最新大肠杆菌发酵经验总结
大肠杆菌发酵经验总结首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。
其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。
第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。
第四，补料过程中的碳氮比也很重要。
若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。
另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。
根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。
可以适当调整碳氮比。
大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下几点，并作出相应解决措施。
一、代谢副产物-乙酸乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。
当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。
重组大肠杆菌高密度发酵过程中乙酸的控制
别是那些涉及大肠杆 菌转 录及翻 译机 制 、 一般应 激
反应和调节 的蛋 白和基 因 。而且 ， ］ 乙酸对产 重组 蛋 白的细胞抑 制作 用 ｌ ｘ 野生 型 的细胞 抑 制作 刚 ： ， ｇ－ ｊ
度 以及 比产率 （ 即单 位 时 间单 位 细胞 质 量 形成 的 产 物的 量） 正 比 ， 此 ， 成 因 重组 大 肠 杆菌 的培 养 多 采用 高 密度培 养技 术［ 。高密度 培养技 术不 仅可 ２ ］
并 干扰 甲硫 氨 酸 的合 成Ｌ 。应 该注意 到 ， 养 时 ６ ］ 培
ｐ Ｈ越 低 ， 乙酸 未解 离形式含量越高 ， 乙酸抑 制作用 就越强［８。 ＿ ｌ 此外 ， 究表明 ， 研 乙酸 影响数种蛋 白和基 ， 特
・ ６・ ４
陕
西
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重 组 大 肠 杆 菌 高 密 度发 酵 过 程 中 乙酸 的控 制
薛 文 娇 侯 文 洁 。
（ ． 西省微 生物研 究所 ， 西 西安 １陕 陕
摘
７ ０ ４ ；． １０ ３ ２ 西北农 林科技 大学 ， 西 杨 凌 陕
７２ ０ ） １ １ ０
乙酸 的培 养基 的设 计和培 养条 件的优 化 。而 基 因 工程 的方 法是 通过 改变微 生物 自身 的基 因以减少 乙酸 的生 化合 成 。本文将 主要 介绍过 程控制 方 面
杆菌培养体系 中达到高细胞密度非 常重要 。
２ 重 组 大肠 杆 菌高 密度 发 酵过 程 乙 酸 的控 制
基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术
生物工程下游技术实验模块实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术创建人：时间：2013-04-17 【点击数：482】实验一：基因工程菌的大规模培养及高密度发酵技术1．实验目的（1）掌握工程菌大规模培养及高密度发酵技术的原理。
（2）学习工程菌高密度发酵的技术方法。
2．实验原理重组大肠杆菌的高密度培养是增加重组蛋白产率的最有效的方法，高密度发酵在增加菌密度的同时提高蛋白的表达量，从而有利于简化下游的纯化操作。
重组大肠杆菌高密度培养受表达系统、培养基、培养方式、发酵条件控制等多种因素的影响，在实际操作中需要对各种因素进行优化，建立最佳的发酵工艺。
发酵工艺优化的研究可通过每次改变一个因素或同时改变几个参数来进行，然后运用统计学分析寻找它们之间的相互作用。
工程菌提高分裂速度的基本条件是必须满足其生长所需的营养物质，因此，培养基成分和浓度的选择就成为首要解决的问题，在成分选择上，要尽量选取容易被工程菌利用的营养物质，例如，普通培养基中一般是以葡萄糖为碳源，而葡萄糖需经过氧化和磷酸化作用，生成1，3-二磷酸甘油醛，才能被微生物利用，即用甘油作为培养基的碳源可缩短工程菌的利用时间，增加分裂增殖的速度。
目前，普遍采用6g/L的甘油作为高密度发酵培养基的碳源。
另外，高密度发酵培养基中各组分的浓度也要比普通培养基高2～3倍，才能满足高密度发酵中工程菌对营养物质的需求。
当然，培养基浓度也不可过高，因为过高会使渗透压增高，反而不利于工程菌的生长。
补料的流加方式直接影响着发酵的效果。
分批补料培养的特点是，在培养过程中不断补充培养基，使菌体在较长时间里保持稳定的生长速率，从而达到高密度生长。
但是在补料流加过程中既不能加入得过快，也不能加入得过慢。
过慢则无法满足逐渐增加的菌体生长需要，同时也使培养过程中产生的抑制性副产物大量积累；而过快则使携带目的蛋白的质粒没有充裕的时间复制，降低目的蛋白的表达量；而且快速的细菌生长还易引发质粒的不稳定性。
大肠杆菌高细胞密度发酵
课程设计说明书课程名称：发酵工程设计题目：大肠杆菌的高细胞密度发酵院系：生物与食品工程学院学生姓名：郑帅超学号：201106040030专业班级：11 生物技术指导教师：李安华2014年5月26日课程设计任务书设计题目枯草芽孢杆菌产淀粉酶发酵工艺的优化学生姓名郑帅超所在院系生物与食品工程学院专业、年级、班11生物技术设计要求：1、树立正确的设计指导思想，严谨负责、实事求是、刻苦钻研、勇于探索的作风和学风。
2、根据所给资料，按照任务书中提出的范围和要求按时独立完成，不得延误，不得抄袭他人成果。
3、说明书应字迹清楚文字通顺，并附有各项设计成果表，摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。
4、设计标准要求规范、实用、切合实际。
5、设计应严格按有关设计规范进行。
6、设计结束后，以个人为单位提交设计说明书一份（后附流程图）。
学生应完成的工作：1、在老师的帮助下完成题目设计。
2、学生查阅相关文献、资料制定实验路线，并有指导老师检查实验路线的合理性和可行性。
3、学生在实验室完成实验方案。
4、完成课程设计说明书的初稿，由指导老师帮助修改，最后定稿。
参考文献阅读：[1]李寅等著，高细胞密度发酵技术，化学工业出版社，2006-10-01，177~288.[2]陈坚,李寅,毛英鹰,等. 生物工程学报,1998 ,14(4) :452～455.[3]李民,陈常庆,朴勤,等. 生物工程学报,1998 ,14(3) :270～275.[4]杨汝燕,李民,陈常庆. 工业微生物,1998 ,28(3) :30～33.[5 ]李民,陈常庆,朴勤等,生物工程学报,1998 ,14 (3) :270~275.[6]杨汝燕,李民,陈常庆,工业微生物,1999 ,29(1) :25～28.[7]徐皓,李民,阮长庚,等. 工业微生物,1998 ,28(2) :20～25.[8]刘社际,葛永红,杨立明. 中国生物制品学杂志,1999 ,12 (1) :29 ～31.工作计划：2013.5.11分组并确认指导老师，在老师指导下查阅文献，确定题目。
重组大肠杆菌高密度发酵工艺进展及研究
237BIOTECHWORLD 生物技术世界在对各类细菌进行研究的过程中可以看出,大肠杆菌本身的结构和基因组成都相对简单,并且具有生长周期短、培养条件要求较低等优势,因此在对重组蛋白进行表达的过程中,经常会选择大肠杆菌作为发酵菌种。
而这也就为人类提供了很多的基因产物,使得人类的各类技术得到了相应的提高。
1 高密度发酵技术的概述高密度发酵技术就是指在特定的培养体系之下,利用改变培养方式或培养条件的方法,提升所培养的菌群的发酵密度,进而提升相应产物的生产量。
这种培养方式是基于目前先进的发酵技术,利用多种方式提升产物的产量,将其应用在大肠杆菌重组蛋白的发酵培养过程中,能够有效提升相关重组蛋白的合成量,减少培养体积,同时还可以提高分离提取的纯度,较大程度的缩短了生产的周期。
这样,从侧面降低了相关企业的生产成本,并提升了生产的效率。
2 重组大肠杆菌高密度发酵工艺的进展研究2.1 宿主菌类型不同种类的大肠杆菌其对于生长条件的要求、代谢副产物种类以及对外源基因的表达能力都存在着一定的差异,因此,在工业发酵的过程中,对于宿主菌类型的选择是非常重要的。
现代相关生物学家对于宿主菌的改良投入了大量的经历,其发现在发酵过程中,乙酸是主要抑制重组蛋白合成的主要代谢副产物,其对于相关发酵过程中产品的生产量有着直接的影响。
因此,相关研究者就利用Co 对宿主菌进行诱变,使其成为对乙酸具有高耐受性的耐乙酸型大肠杆菌。
经过试验检验表明,这种细菌在高密度发酵中能够将发酵浓度提高5%以上,菌落的生长比率可以提高27%,其对于重组蛋白的表达能力提升了50%以上,而大肠杆菌本身产生的乙酸浓度降低了60%以上。
2.2 培养基组成培养基是培养大肠杆菌的主要场所,根据其功能的不同分为3类,主要包括合成、半合成以及复合型培养基。
在目前我国的重组大肠杆菌高密度发酵过程中所使用的均是半合成培养基,这种培养基是在合成型培养基的基础上衍变而来的,其主要是添加了各类促进大肠杆菌细胞生长、代谢合成等的物质,主要包括碳、氮、无机盐、氨基酸以及维生素等。
大肠杆菌高密度发酵中乙酸代谢
个期间，PH和异柠檬酸盐裂解酶都没有增长，可以看得出没有乙酸
消耗的现象出现，在没有发生改变的情况下。
文献总结
• 内容总结 • 在大肠杆菌发酵培养过程中，有氧和糖的消耗
以及二氧化碳的排放量暂时下降50%-80%的现象 发生，并伴有排泄物被利用的现象发生。 • 相对于营养物确定的培养基，在营养物富集的 培养基中，大肠杆菌会缓慢生长，并且会产生乙 酸。乙酸在培养基中的存在多方面影响细胞的生 理特性，浓度升高的乙酸溶液限制培养物的生长 速率，其对复杂培养基的影响比确定培养基大多 了，在分批补料培养中，乙酸的产生明显高于批 发酵所产生的，这是因为在延伸生长阶段大肠杆 菌使得乙酸达到最高浓度。
文献介绍
• 发酵过程概述
•
在葡萄糖体和乙酸都消耗的时期，大约在6.5小时，异柠檬酸盐裂
解酶的特殊活性大约增加了4倍，可以观察到最初的乙醛酸旁路途径。
转换之后，这种酶活性的增加与乙酸的消耗直接相关。
• PH6.5、糖功率2.0 g/L发酵简述
•
最初 5 h发酵，初期的生长率是0.985 h-1,与0.5 g/L葡萄糖发酵的
E：两者的大概生长曲线基本相似
PH6.5，糖浓度2.0g/L的培养曲线
三条培养曲线的对比分析
• 发酵过程中控制PH在 6.5，葡萄糖 的浓度被控制在 2.0 g/L时。最初 5 h发酵，初期的生长率是0.985 h-1,与0.5 g/L葡萄糖发酵的非常相似（图5）.在发酵6 h 前不久，当 乙酸浓度达到 7.2g/L时，葡萄糖消耗急剧的减少（ 10 分 钟减少40% ）与上面描述的0.5 g/L观察到的内容相似。 在发酵过程中控制葡萄糖浓度为2.0 g/L，当葡萄糖消耗下 降时，培养物并不消耗乙酸。在 40 分钟之后，培养基浓 度恢复，葡萄糖消耗的持续增加，乙酸产生的增加。在葡 萄糖消耗量减少的整个期间，PH和异柠檬酸盐裂解酶都 没有增长，可以看得出没有乙酸消耗的现象出现 。此时， 乙酸没有消耗与PH7.0、PH6.5，补糖量0.5 g/L不同。
微生物的高密度培养
微生物的高密度培养高密度培养的定义：高密度培养：是应用一定的培养技术和设备来提高菌体生物量和目标产物时空产率的发酵技术。
一般认为，细胞密度接近理论值的培养为高密度培养。
但由于菌种、菌株及目标产物差异性较大，高密度培养的最终菌体生物量无法用一个确切的值或范围界定。
Riesenbere经计算认为，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400g/L，考虑到实际情况的种种条件限制，Markel等认为最高菌体密度为200 g/L，此时，发酵液25%充满长3μm，宽1μm的菌体，发酵液粘度很高，几乎散失流动性。
而某些极端微生物细胞密度达到数克每升也可认为是高密度培养。
高密度培养技术最早用于酵母细胞的培养提高生物量或生产单细胞蛋白及乙醇的生产。
随着基因工程技术的发展和应用，构建基因工程菌已经成为提高目标蛋白表达水平的一项基本手段。
基因工程菌过量表达目标产物还有助于简化后续的分离纯化操作，同时也便于基因工程改造。
其中大肠杆菌、酵母是最常用的重组表达宿主菌高密度培养的优势:提高最终菌体生物量和目标产物的时空产率,缩小生物反应器体积，降低设备投资缩短发酵周期，减少水电使用，降低生产成本便于下游分离纯化工艺等高密度培养主要限制因素:固态或挥发性底物在液态培养基中,溶解限制底物对细胞生长可能存在限制或抑制作用。
底物和产物的稳定性差或易挥发产物降解产物或代谢副产物的积累，对细胞生长产生限制。
呼吸作用导致C02和热量的急剧积聚氧气需求量大，培养基黏度增加副产物的积累与毒害作用。
高密度培养的培养基：高密度培养要求培养基含有细胞生长所需的所有营养成分，配比均衡，且浓度不会对细胞生长产生抑制作用。
一般采用营养成分清晰的全合成培养基，便于发酵过程的调节控制和进一步的扩大培养。
培养基必须包含细胞生长必需的碳源、氮源、无机盐及生长因子。
高密度培养的初始发酵培养基营养成分必须低于抑制浓度，并结合恰当的流加补料策略提供营养物质，使细胞生长维持在最佳状态。
2、什么是高密度培养,举例论述如何利用高密度培养技术来
2、什么是高密度培养，举例论述如何利用高密度培养技术来某一产品的。
答：高密度培养有时也称高密度发酵，一般是指微生物在液体培养中细胞群体密度超过常规培养10倍以上时的生长状态或培养技术，现代高密度培养技术主要是在用基因工程菌生产多肽类药物的实践中逐渐发展起来的。
重组大肠杆菌高密度培养技术摘要：阐述了基因工程菌高密度发酵工艺的几个主要影响因素,包括重组菌构建、培养条件、生长抑制因子以及它们的控制技术。
通过高密度发酵可以提高细胞生长密度、目的蛋白的表达含量。
在高密度发酵过程中,会产生一些有害抑制代谢副产物,但通过分批补料可以降低影响。
关键词:高密度发酵; 分批补料; 生长抑制因子。
重组ＤＮＡ技术和大规模培养技术的有机结合,使得原来无法大量获得的天然蛋白质能够规模生产。
目前,已经在高密度培养中成功地提高了同源和异源蛋白的产量。
分批补料培养通常被用于微生物发酵,这种方法通过在培养过程克服细胞的调节机制:苹果酸影响,催化阻遏,产生抑制,使细胞密度达到较高水平。
大肠杆菌高密度培养工艺广泛地应用于重组蛋白的生产,这主要是由于大肠杆菌的遗传学和生理学已基本被认清。
产量的高低主要取决于细胞密度、目的蛋白的表达含量。
但在培养过程也存在一些问题,如氧、基质的利用率、小分子物质、生长抑制物的积累等。
因此,减少抑制物的形成,提供良好的生长条件是必要的。
1 重组大肠杆菌构建的几个影响因素1.1宿主菌的选择不同的大肠杆菌菌株在培养条件和外源基因表达能力上存在很大差别。
现在普遍应用的大肠杆菌ＢＬ21(ＤＥ3)ｐｌｙｓＳ因其带有编码Ｔ7溶菌酶的小质粒,而有效地降低杂蛋白的表达,但不影响ＩＰＴＧ诱导目的蛋白的表达水平,从而成为近年来最为常用的宿主菌。
表达产物的形成在大肠杆菌体内有三条路径:第一,形成稳定的天然构象,可溶且有活性,不易被降解;第二,蛋白质是可溶性的,但构象为非天然状态,易被胞内的各种蛋白酶识别降解;第三,多肽链间彼此聚集形成不可溶的包涵体,并且有蛋白酶抗性。
发酵工艺：工程菌高密度发酵工艺开发策略8项(以大肠杆菌为例)
发酵工艺：工程菌高密度发酵工艺开发策略8项（以大肠杆菌为例）利用重组DNA技术获取的生物药物在人类文明史上具有划时代的意义。
许多价值高产量低的功能蛋白如干扰素、白细胞介素、集落刺激因子、生长激素、胰岛素、人血白蛋白、蛋白酶等都在工程菌中获得了高效率表达。
由于工程菌高密度培养能够提高单位体积的产量，在工业生产上可以提高效率降低成本。
所以，高密度培养一直都是发酵工程师们所追捧的热点。
本文就工程大肠杆菌高密度发酵工艺开发中涉及的关键控制点加以探讨。
1工程菌种稳定可靠的菌种是工业化大生产的有力保障，直接关系到生产效率和成本高低。
不同于传统诱变育种模式，在对待工程菌菌种问题上，有人认为基因工程菌种构建完成后无需经过严格单克隆筛选，既节约时间成本又大大减少了工作量，这其实是一个认识误区。
这样做出来的菌种很难连续稳定传代50次以上，给中试放大以及后续的长期稳定生产留下了隐患。
业内一般以能否稳定遗传50代作为判断工程菌种优劣的一个标准。
发酵所需的接种量不是越大越好，要适当。
接种量过小导致适应期过长，菌种易提前老化，也增加了杂菌污染的风险。
接种量过大会过早引起溶氧不足，导致发酵失控。
且营养物质消耗过快也会影响后期正常生长。
一般大肠杆菌接种量遵循逐级增大的原则，并将最后一级的放大倍数控制在10倍左右。
种子培养一定要在最佳条件下进行，培养时间不宜过长，当种子生长至最佳状态时果断移种。
如果种子做的不好，其负面影响往往在发酵中后期会有所体现。
工程菌种培养会加入抗生素，不仅是为了抑制杂菌生长，更重要的是为了给菌种形成正向的抗性筛选压力，及时淘汰质粒丢失的菌株或者衰老的菌体，保证质粒携带菌群的正常生长与表达。
2高密度发酵培养基除了必须的碳源以外，有机复合氮源在蛋白表达阶段不可或缺。
有机复合氮源可提供丰富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素以及一些生物活性物质，能减轻细胞代谢负担，促进外源蛋白表达。
如果酵母膏和蛋白胨是以流加的方式添加时，存在一种非常有趣的代谢机制：当流加培养基中只有酵母膏时，重组蛋白不稳定；而当流加培养基中只有蛋白胨时，大肠杆菌难以再利用其所产生的乙酸。
大肠杆菌高度发酵控制关键误区
大肠杆菌高度发酵控制关键误区大肠杆菌高密度发酵过程溶氧与氧分压和传质速度有关这众所周知，除此之外影响溶氧的最大因素是发酵过程中的耗氧，这一点很容易忽略。
耗氧不仅影响菌体密度还影响蛋白表达。
发酵过程中需要监测的是耗氧，但是耗氧通常是通过溶氧去监测。
溶氧为零时并非成了厌氧发酵。
厌氧发酵是不通入氧，而溶氧为零是通入的氧等于或小于耗氧。
在大肠杆菌高密度发酵的中后期，经常会出现溶氧为零的情况，此时若选择降低补料速度等方式使溶氧恢复到一定数值，这种做法并非是提高了溶氧而是降低了耗氧，这样严重影响菌体繁殖和蛋白表达。
大肠杆菌高密度发酵中后期，随菌体密度增大，菌体代谢旺盛，耗氧急速上升，发酵过程需氧量增大，在供氧不足时很容易出现溶氧为零的现象，此时若通过降低补料速度等方式使溶氧呈现出一定的数值，使蛋白过程降低，菌体代谢过程减缓就大错特错，这种做法并没有提高发酵过程的供氧。
此时需要加大供氧而非干预耗氧。
增大供养，保持一定溶氧的策略1.提高通气量2.提高罐压，增大氧分压3.提高转速，增大传质速度4.改变通入气体中的氧的比例，如空气和纯氧以一定的比例混合在通入概述重组大肠杆菌的高密度培养的目的在于获得更高的目标蛋白单位体积产量。
但是在重组大肠杆菌的高密度培养过程中，常常遇见的是高密度低表达现象，表达效率只有摇瓶的三分之一。
实现外源蛋白在菌体高密度培养过程中高效率表达仍是工程重组菌发酵的研究热点。
添加复合氮源菌体生长至高密度时，营养成分逐步耗尽。
营养的缺乏也是限制高密度培养下实现高表达的因素。
Shimizu等发现在表达阶段，限制蛋白胨和酵母抽提物的浓度，对外源基因表达不利，补料液中加大酵母抽提物比例可以提高外源蛋白的表达量。
认为有机氮源提供丰富的氨基酸、小肽、嘌呤、嘧啶、维生素、生物素以及一些生物活性物质，减轻了细胞代谢负担，促进了外源蛋白的表达。
利用代谢工程作用消除乙酸的抑制作用乙酸对菌体生长和外源蛋白表达抑制的机理通常认为是乙酸破坏了跨膜质子梯度，而跨膜质子梯度是氧化磷酸化和其它需能跨膜运输所必需。
大肠杆菌高密度发酵
课程设计说明书课程名称：发酵工程设计题目：大肠杆菌的高密度发酵院系：生物与食品工程学院学生姓名：******学号：************专业班级：10生物工程（2）班指导教师：*****课程设计任务书大肠杆菌的高密度摘要：在工业生产过程中，由于技术或是生产条件的限制，在大肠杆菌高密度发酵培养中很难实现其高密度发酵。
针对这一问题，我组专门为此设计一实验来探索发酵过程中的限制性因素。
我们从开始的发酵培养基的组分及其配比，到后来的灭菌方式，投料程序以及在发酵过程中温度的设定控制，PH值的设定控制及溶氧的设定控制都进行了严格的监测，再到最后的OD值，氨基氮以及还原糖的测定都进行严谨的完成。
关键词：大肠杆菌高密度发酵OD值目录1.设计背景 (1)1.1大肠杆菌高密度发酵产品及其质量安全现状 (1)1.2高密度发酵定义 (1)1.3 规定标准 (1)2.设计方案 (2)3.方案实施 (3)3.1 大肠杆菌简介 (3)3.2 菌种选材 (3)3.3 种子扩大培养 (3)3.4 发酵培养基配比 (3)3.5 发酵过程 (4)4.结果与结论 (7)5.收获与致谢 (9)6.参考文献 (10)1.设计背景1.1大肠杆菌高密度发酵产品及其质量安全现状目前，在发酵产业进入工业化，自动化的今天，产品的高密度发酵越来越受到国内外的重视。
人们在根据实验与生产阶段总结的经验中，逐步掌握发酵生产所需要的最佳控制条件。
在此过程中所得的产品密度更大，纯度更高，质量安全也得到了保障。
1.2高密度发酵定义高密度发酵（high cell density cultivation，HCDC)是指在一定条件和培养体系下，获得最多的细胞量，由此更多地或更高效地获得目的产物。
即利用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著提高，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)。
通常认为菌体密度超过50 g(DCW)／L即为高密度发酵。
大肠杆菌高密度经验总结
大肠杆菌发酵经验总结首先，补料速率与比生长速率直接影响着乙酸的生成速率和积累量（主要是补料速率与比生长速率影响发酵液中的残糖量，进而影响），所以适当的控制补料速率和比生长速率，对于控制乙酸的量有很好的效果。
其次，必须要保证充足的溶氧，并严格控制pH值，而且补酸碱的速率尽量缓和，不能太快；温度对于蛋白的表达也有很重要的影响，较低的发酵温度下所生产出的蛋白大多是有活性的，而较高的发酵温度下产生的蛋白大多一包涵体形式存在。
第三，选取合理的诱导时间非常重要，一般的诱导时间选在指数生长后期，而且诱导时的比生长速率最好能控制在0.2之内，选在此时诱导，1.将菌体的快速生长期与蛋白合成期分开，使这两个阶段互不影响，有利于蛋白的高表达；2.已经得到了大量的菌体，而且菌体的生物量基本接近稳定，不论是从动力学角度，还是能耗，物料成本方面，都比较合理。
第四，补料过程中的碳氮比也很重要。
若氮源过高，会使菌体生长过于旺盛，pH偏高，不利于代谢产物的积累，氮源不足，则菌体繁殖量少从而影响产量；碳源过多，则容易刑场较低的pH，抑制菌体生长，碳源不足，则容易引起菌体的衰老和自溶。
另外，碳氮比不当还会引起菌体按比例的吸收营养物质，从而直接影响菌体的生长和产物的合成。
根据自己的经验，一般情况下，对于一个稳定的发酵工艺下，如果总是在固定的发酵时间段出现溶菌现象，而且能排除噬菌体和染菌的可能性后，那就可能是因为碳氮比不合理造成的。
可以适当调整碳氮比。
大家讨论得较多的是关于代谢副产物乙酸对大肠杆菌发酵的影响，针对我们论坛所发的帖，我先总结以下几点，并作出相应解决措施。
一、代谢副产物-乙酸乙酸是大肠杆菌发酵过程中的代谢副产物，在多大的浓度下产生抑制作用各种说法不一，一般认为在好气性条件下，5～10g/L 的乙酸浓度就能对滞后期、最大比生长速率、菌体浓度以及最后蛋白收率等都产生可观测到的抑制作用。
当乙酸浓度大于10或20g/L 时，细胞将会停止生长，当培养液中乙酸浓度大于12g/L 后外源蛋白的表达完全被抑制。
大肠杆菌发酵培养基及发酵培养方法
大肠杆菌发酵培养基及发酵培养方法大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的革兰氏阴性菌，广泛存在于人体和动物的肠道中。
大肠杆菌是一种非致病性菌株，也是一种重要的实验室模式细菌，广泛用于生物学、分子生物学和生物工程等领域的研究。
在研究中，为了培养大肠杆菌并使其生长繁殖，需要提供适宜的发酵培养基。
下面将介绍一种常用的大肠杆菌发酵培养基及发酵培养方法。
1. 碱性消化酪蛋白（Peptone）：提供菌体生长所需的氨基酸和碳氮源。
2. 天然酪蛋白（Tryptone）：提供菌体生长所需的氨基酸和碳氮源。
3.单质氯化钠（NaCl）：维持适宜的渗透压。
4.复合钠磷酸盐缓冲液：维持培养基的pH值。
5.复合钠酸盐或磷酸二钠：提供磷酸和其他离子。
6.葡萄糖：作为碳源供能。
7. 瓜尔豆胨（Yeast Extract）：提供维生素和微量元素。
8.氯化镁（MgCl2）：提供镁离子，促进细菌生长。
9. 镓氰酸（Glycerol）：提供细菌生长所需的能源。
10.硫酸镁（MgSO4）：提供硫酸和镁离子。
大肠杆菌的发酵培养方法如下：1.准备培养基：根据具体实验目的配制相应的发酵培养基，常用的是LB培养基。
首先称取适量的碱性消化酪蛋白、天然酪蛋白和葡萄糖，溶解于适量的水中，调整pH值为7.0。
然后加入其他成分，如NaCl、复合钠磷酸盐缓冲液等，再加入足够的水使总体积达到所需量。
最后将培养基加热至沸腾，搅拌溶解，然后用自动过滤器过滤除菌。
2.酸碱调节：将培养基分装到培养瓶中，每瓶约装200-250mL。
使用滤液灭菌器或高温高压灭菌，将培养基灭菌。
3.原液接种：取一天前培养好的大肠杆菌菌种，用直线均匀接种于含有发酵培养基的培养瓶中，可根据需要调整接种量。
4.接种培养：将培养瓶置于恒温摇床上适当温度的恒温箱中，保持适宜的温度（通常为37℃）和摇动速度。
等待一定的时间，观察细菌生长情况。
5.静置培养：可以将菌液经过适当的培养时间后进行离心，去掉上清液，留下细菌沉淀。
大肠杆菌高密度发酵研究
Ｋ．“ｍ Ｈ ｃ，Ｈｏ吨Ｊ，瑾ｏｔ∞ｈ呻ｌⅨ０ｅ“ｇ，１９９ｚ・３９：６６３～６７１
８陈坚，李寅，毛英鹰等．培养模式对１组大■杆■鼻密度培养生产 答就甘肚曲髟赡Ｄ］．生蕾工程革撮，】９９ａ。１４（４）：４５２～１５５ ９陆庆采．蔫黧囊性大精杆蕾膏密度发Ｉ条件优化的研究［ｃ］．山东 农韭大学９７皱焉士研究生论文
中■分粪号ｌＴｑ９２０．１
文■标识码ｚＢ
立章■号；ｌ００８—９３８１（２００１）０１～００２７一０３
致病性大肠杆菌是畜禽最常见的病原菌之一。可 引起膏禽的严重腹泻、家禽的败血症及卵黄性腹膜炎 等一系列疾病，是影响膏膏业的一个重要因素。对该 病多以疫苗预防为主，效果也较好。但目前大肠杆菌 的生产多用普通琼脂或营养内汤进行培养，抗原产量 低且生产成本高，难以大批量生产。而用一般发酵工 艺生产，发酵液中的菌体浓度仍较低。难以获得理想 效果。近几年，人们又对高密度发酵进行了研究并取 得了较大进展。实现高密度、高产率和高浓度培养是
量比不补糖提高了５倍血］。在培养基中加１年１月第１８卷第１期（总第７３期）
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和目的产物表达的不利影响。
１．７其它因素
菌生长的稳定期，曲线趋于平稳ｆ到达衰老期后，细菌 生长基本停止，氧气消耗量又下阵，表现为溶氧曲线 略有上升趋于平稳，这时可终止发酵［１“。 ３．２异常发酵处理 ３．２．１发酵渍转稀发酵尚未进入放罐阶段发酵液 异常地变稀。其产生原因，除了噬茵体侵袭以外，往往 还由其它一些未知因素造成。首先表现在粘度降低， 继而泡沫上升，消洙油的效果减弱。通常在刚开始变 稀时，及时补充适当的氯源可促使新菌体繁殖，使发 酵恢复正常。有些品种，补人碳源也可以防止变稀。由 于氮源或碳潦可改变发酵液的表面张力，泡沫上升的 情况也有所改善。 ３．２．２发酵液过浓发酵液过浓是发酵液中氮源过 多，造成菌体浓度大大增加，降低了发酵液中的溶氧 浓度，影响发酵的正常进行。对此，可朴人大量的水， 除了使菌体浓度稍加稀释外，还可降低发酵液粘度， 从而改善发酵条件。补水量不少于发酵液体积的 ５％，才能显示效果，一般控制在１０％左右。 ３．２．３糖耗缓慢糖耗缓慢的原因很多．如种子质 量不好、培养基中磷酸盐浓度下降等。对此，可以补充 适量合适氯源或部分磷酸盐。一般发酵液的培养龄愈 长，对礴酸盐愈不敏感。此外，还可用提高发酵温度的 办法来促进糖耗加快。
重组大肠杆菌 高密度发酵工艺流程
重组大肠杆菌是一种重要的微生物工程技术，它在生物医药领域具有广泛的应用前景。
高密度发酵是重组大肠杆菌工程中的关键技术之一，它能够提高生产效率，降低成本，是生物制药工业发展的重要推动力。
本文将围绕重组大肠杆菌高密度发酵工艺流程展开讨论，旨在全面梳理该流程的节点、原理和优化策略，为相关领域的研究人员和工程师提供参考和借鉴。
一、高密度发酵工艺流程概述高密度发酵是指通过对发酵过程中的微生物、培养基、营养物质、发酵条件等方面进行优化，使得发酵反应体系中微生物细胞数量达到较高水平的一种发酵技术。
重组大肠杆菌是一种常见的表达宿主，其高密度发酵工艺流程主要包括菌种预处理、大规模发酵、收获和纯化等环节。
1. 菌种预处理菌种的筛选和预处理对于高密度发酵的成功至关重要。
首先要选择生长迅速、表达目的蛋白质能力强的重组大肠杆菌菌株，确保其具有较高的生产潜力。
随后进行菌种的预培养和激发，通过连续传代、逐渐提高菌种浓度等手段，使菌种达到理想的生长状态，为大规模发酵做好准备。
2. 大规模发酵大规模发酵是高密度发酵的核心环节，其主要包括发酵罐设计、发酵培养基配方、发酵条件控制等内容。
在发酵罐设计方面，需要考虑罐体结构、通气方式、搅拌方式等因素，以保证发酵过程中的氧气和营养物质充分混合，为微生物生长提供良好的环境。
培养基的配方需要根据菌株特性进行调整，保证细胞生长所需的碳源、氮源、无机盐等养分充足。
发酵过程中温度、pH、溶氧量、搅拌速率等参数的控制也至关重要，可通过在线监测和智能控制系统进行实时调节，以确保发酵反应的顺利进行。
3. 收获和纯化发酵结束后，需对发酵液进行收获和纯化，以获取所需的重组蛋白质产品。
收获过程包括发酵液的分离、离心、过滤等操作，目的是将微生物细胞和培养基分离，获取含有目的产物的上清液。
随后进行一系列的纯化步骤，如固定化金属亲和层析、离子交换层析、尺寸排阻层析等，最终得到纯度较高的重组蛋白质产品。
二、高密度发酵工艺流程优化策略为了提高重组大肠杆菌的生产效率和产品质量，研究人员和工程师们一直在不断探索和优化高密度发酵工艺流程。
两次诱导实现重组大肠杆菌高密度_高表达研究
两次诱导实现重组大肠杆菌高密度、高表达研究3马文峰 庄英萍33 郭美锦 丁满生 储 炬 张嗣良(华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室国家生化工程技术研究中心 上海 200237)摘要:通过不同温度诱导模式对大肠杆菌高密度,高表达的研究,确定两次升温诱导模式实现大肠杆菌高密度、高表达重组人载脂蛋白的目的。
实验证实两次诱导成功的避免了乙酸对高密度、高表达的影响,最终发酵的细胞密度OD 600达150,蛋白表达量418g ・L 21,证明两次升温诱导的发酵方法在高密度、高表达外源蛋白上是成功的,从而为基因工程菌规模化生产奠定了基础。
关键词:重组大肠杆菌,ApoA 2I M ilano ,高密度,高表达,两次诱导中图分类号:T Q92016 文献标识码:A 文章编号:025322654(2005)022******* 3国家高技术研究发展计划(“863”计划)(No 12002AA217021)国家重大科技专项资助(No 12002AA2Z3451)33通讯作者 Tel:086221264252234,Fax:086221264253702,E 2mail:YPZ@nc 2bi o 1com收稿日期:2004207205,修回日期:2004209201Study on the Recom b i nan t Human ApoA 2I M il ano H igh D en sity and H ighExpressi on by Two Tem pera ture 2Sh i fted I nducti on i n Escherich ia coli3MA W en 2Feng Z HUANG Ying 2Ping 33 G UO Mei 2J in D I N G Man 2ShengCHU Ju ZHANG Si 2L iang(East China U niversity of Science and Technology,S tate Key Laboratory of B ioreactorEngineering,N ational R eserch Center for B iotechnology,Shanghai 200237)Abstract:The te mperature effect on the reco mbinant pr otein p r oducti on f or mati on was investigated in p resent study 1The culture te mperature of gr owth phase is 30℃,and the culture te mperature of inducti on phase was ar 2ranged according t o three modes 1H ign cell 2density and high ex p ressi on culture of E 1coli t o pr oduct reco mbinant hu 2man apoli popr otein A 2I M ilano by tw o te mperature 2shifted inducti on 1T wo te mperature 2shifted inducti on was carried out high density and high ex pressi on reco mbinant hu man Apo A 21M ilano 1The reco mbinant p r otein Apo A 2I M ilano reached 418g ・L 21with the final cell density of OD 6001501And the t w o te mperature 2shifted inducti on av oided the acetic acid successfully t o the influence of the high density and high ex p ressi on 1T wo te mperature 2shifted inducti on was vi 2able in high density culture and high ex pressi on of heter ogenous pr otein in reco mbinati on E 1coli 1The sduty p r ovides a basic work for p r oducti on of reco mbinant Apo A 2I M ilano in scale 1Key words:Reco mbinant E 1coli ,Apo A 2I M ilano ,H igh density,H igh expressi on,T wo te mperature 2shifted induc 2ti on 大肠杆菌表达异源蛋白的方式依启动子不同,分为组成型和诱导型。
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课程设计说明书课程名称：发酵工程设计题目：大肠杆菌的高细胞密度发酵院系：生物与食品工程学院学生姓名：郑帅超学号：201106040030专业班级：11 生物技术指导教师：李安华2014年5月26日课程设计任务书设计题目枯草芽孢杆菌产淀粉酶发酵工艺的优化学生姓名郑帅超所在院系生物与食品工程学院专业、年级、班11生物技术设计要求：1、树立正确的设计指导思想，严谨负责、实事求是、刻苦钻研、勇于探索的作风和学风。
2、根据所给资料，按照任务书中提出的范围和要求按时独立完成，不得延误，不得抄袭他人成果。
3、说明书应字迹清楚文字通顺，并附有各项设计成果表，摘引其他书籍或杂志的材料必须注明出处。
4、设计标准要求规范、实用、切合实际。
5、设计应严格按有关设计规范进行。
6、设计结束后，以个人为单位提交设计说明书一份（后附流程图）。
学生应完成的工作：1、在老师的帮助下完成题目设计。
2、学生查阅相关文献、资料制定实验路线，并有指导老师检查实验路线的合理性和可行性。
3、学生在实验室完成实验方案。
4、完成课程设计说明书的初稿，由指导老师帮助修改，最后定稿。
参考文献阅读：[1]李寅等著，高细胞密度发酵技术，化学工业出版社，2006-10-01，177~288.[2]陈坚,李寅,毛英鹰,等. 生物工程学报,1998 ,14(4) :452～455.[3]李民,陈常庆,朴勤,等. 生物工程学报,1998 ,14(3) :270～275.[4]杨汝燕,李民,陈常庆. 工业微生物,1998 ,28(3) :30～33.[5 ]李民,陈常庆,朴勤等,生物工程学报,1998 ,14 (3) :270~275.[6]杨汝燕,李民,陈常庆,工业微生物,1999 ,29(1) :25～28.[7]徐皓,李民,阮长庚,等. 工业微生物,1998 ,28(2) :20～25.[8]刘社际,葛永红,杨立明. 中国生物制品学杂志,1999 ,12 (1) :29 ～31.工作计划：2013.5.11分组并确认指导老师，在老师指导下查阅文献，确定题目。
2013.5.12----2013.5.13 进行理论试讲阶段，确定实验路线，然后确定实验方案。
2013.5.14----2013.5.17 进行实验操作和书写设计说明书。
2013.5.18----2013.5.22 修改说明书，和指导老师沟通。
2013.5.23—2013.5.26 上交课程设计说明书，并由指导老师填写评语和成绩。
任务下达日期：2014年5月13日任务完成日期：2014年5月26日指导教师（签名）：学生（签名）：枯草芽孢杆菌产淀粉酶发酵工艺的优化摘要：大肠杆菌被广泛地用于基因工程菌的构建，以获得大量的外源基因产物,利用基因重组技术构建的基因工程菌的发酵工艺不同于传统的发酵工艺。
生物工程菌发酵的目的是希望能获得大量的外源基因产物,尽可能减少宿主细胞本身蛋白的污染。
外源基因的高水平表达不仅涉及宿主,载体和目的基因三者之间的相互关系,而且与其所处环境条件息息相关。
因此仅按传统的发酵工艺生产生物制品是远远不够的,需要对影响外源基因表达的因素进行分析,探索出适于外源基因高效表达的发酵工艺。
高密度、高产率和高浓度培养是近几年发酵工业的目标和方向。
近几年,人们对高密度发酵(high cell density fermentation)进行了大量的研究,并取得了可喜的成果。
对于大肠杆菌,尤其是重组大肠杆菌的发酵来讲,实现高密度发酵,可相应地缩小生物反应器的体积和降低生物量的分离费用,从而降低生产成本,达到提高生产效率的目的。
本文就大肠杆菌高密度发酵的影响因素包括培养基、培养条件、补料方法、发酵工艺以及高密度发酵过程中存在的问题和对策加以讨论,并探讨了如何提高大肠杆菌高密度发酵工艺技术水平。
关键词：大肠杆菌高密度发酵培养基溶氧值菌体密度目录1.设计背景 (1)1.1 大肠杆菌简介 (1)1.2 高细胞密度发酵技术概述 (1)1.3 影响大肠杆菌高细胞密度发酵的因素 (2)2.设计方案 (3)2.1实验材料与条件 (3)2.2培养基 (3)2.3总工艺流程 (4)3.方案实施 (5)3.1 种子的扩大培养 (5)3.3发酵罐的灭菌——实消 (5)3.4接种 (5)3.5取样检测分析 (5)3.6补料 (6)3.7倒罐 (6)4.收获与致谢 (7)5.参考文献 (8)6.附件 (9)1.设计背景1.1 大肠杆菌简介大肠埃希氏菌(Escherichia coli)通常称为大肠杆菌，1885年由Theodor Escherich 发现，分布在自然界，大多数是不致病的，主要附生在人或动物的肠道里,为正常菌群，少数的大肠杆菌具有毒性,可引起疾病。
大肠杆菌是细菌，属于原核生物，具有由肽聚糖组成的细胞壁，只含有核糖体简单的细胞器，没有细胞核有拟核，细胞质中的质粒常用作基因工程中的运载体。
其代谢类型是异养兼性厌氧型。
大肠杆菌在生物技术中的应用：大肠杆菌作为外源基因表达的宿主，遗传背景清楚，技术操作简单，培养条件简单，大规模发酵经济，倍受遗传工程专家的重视。
目前大肠杆菌是应用最广泛，最成功的表达体系，常做高效表达的首选体系。
在培养基选体系培养时无需添加生长因子，向培养基中加入伊红美蓝遇大肠杆菌，菌落呈深紫色，并有金属光泽，可鉴别大肠杆菌是否存在。
1.2 高细胞密度发酵技术概述基因工程技术和大规模培养技术的有机结合，使得原来无法获得的许多天然蛋白能够大量生产：由于大肠杆菌(EscheHchia colo结构简单、遗传学背景清晰、生长周期短、生长条件清楚，成为最为常用的宿主菌,已被广泛应用于重组蛋白,以及非蛋白的生物分子，如氨基酸等的生产。
高细胞密度发酵(high cell density cultivation，HCDC)是指在一定条件和培养体系下，获得最多的细胞量，由此更多地或更高效地获得目的产物。
即利用一定的培养技术和装置提高菌体的发酵密度，使菌体密度较普通培养有显著提高，最终提高产物的比生产率(单位体积单位时间内产物的产量)。
实现高密度发酵不仅可以减少培养体积，强化下游分离提取，还可以缩短生产周期、减少设备投资，从而降低生产成本。
通常认为菌体密度超过50 g(DCW)／L即为高密度发酵。
根据Riesenbere计算，理论上大肠杆菌发酵所能达到的最高菌体密度为400 g(DCW／L)，考虑到实际情况中的种种条件限制，Markel认为最高的菌体密度为200 g(DCW／L)，此时发酵液的25％充满了长3 µm，宽1µm的大肠杆菌，发酵液粘度很高，几乎丧失流动性。
迄今为止，大肠杆菌发酵菌体密度最高的两例为：非重组E coli W3110达174 g(DCW／L)，生产聚．3．羟基丁酸的重组菌达1 75．4 g(DCW／L)。
1.3 影响大肠杆菌高细胞密度发酵的因素利用一般的发酵工艺生产大肠杆菌或以其组建的基因工程菌的表达产物，大肠杆菌的生物量，表达产物在菌体内和发酵液中的浓度比较低，难以获得理想的生产效率和经济效益。
应用高密度发酵不但可获得较高的生物量，而且可显著提高目的基因表达产物的浓度。
高密度发酵对发酵设备有较高的要求，而且对发酵条件也有非常高的要求。
影响高密度发酵的因素非常多，如细菌生长所需的营养物质、发酵过程中生长抑制物的积累、溶氧浓度、培养温度、发酵液的pH值、补料方式及发酵液流变学特性等。
2.设计方案2.1实验材料与条件 2.1.1 实验材料由生物与食品工程学院实验室培养的大肠杆菌菌种2.1.2 实验条件温度：37℃ PH ：7.2~7.6 OD 溶解度：20%~80% 罐压：0.05Mpa 接种量：1% CO2溶解度：1%~3% 转速：300rpm~400rpm 调节PH ：氨水补料时间：有待观察（2~4h 左右） 通气量：100L/h设备：空压机；50L 发酵罐；蒸汽加热器；分光光度计等2.2培养基由于发酵过程主要经历三个阶段：种子的扩大培养、发酵罐初始培养和流加培养。
所以整个过程需要三种培养基：2.2.1 种子培养基的配比2.2.2 发酵罐初始培养基的配比 （35L ）牛肉膏 蛋白胨 氯化钠 水 1.2g4.0g2.0g400ml葡萄糖 蛋白胨 硫酸氨 磷酸二 氢钾 磷酸氢二钾 硫酸镁 酵母提取物350g175g420g105g 630g 42g402.5g2.2.3 流加培养基的配比 （3L ）2.3 总工艺流程种子的扩大培养发酵罐的前期准备实消接种取样检测分析补料倒罐葡萄糖 酵母膏 氯化铵 磷酸氢二钾 磷酸二氢钾 硫酸镁 氯化钠 12g9g12g6g 3g 3g39g3.方案实施3.1 种子的扩大培养种子培养基经过配制和灭菌之后，在超净工作台中，用接种环从保存斜面中接一环至装液量为60ML的1000ML摇瓶中， 250r/min,37℃，摇瓶培养12~16h，制作两瓶种子液。
3.2 发酵罐的前期准备3.2.1发酵罐的清洗发酵罐的清洗发酵罐使用前后都应认真清洗，特别是前后两次培养采用不同的菌株时，更应注意清洗和杀菌工作。
发酵罐内可进行清洗的任何部分都应认真清洗，否则都可能成为杂菌的滋生地。
易被忽略而未能充分清洗的地方有喷嘴内部与取样管内以及罐顶等处。
3.2.2发酵罐溶氧电极和PH电极的校正用标准溶液校正电极3.3发酵罐的灭菌——实消配制发酵培养基并加入发酵罐进行灭菌①排气管为硅胶管,一端装有过滤装置，以保证蒸汽能自由出入发酵罐，同时不会出现染菌现象．②取样口上连接一段硅胶管，在硅胶管上安装节流夹，以防止培养基在灭菌时流出。
③装入发酵罐容积60％的培养基后，通入高压蒸汽加热发酵罐,在121℃下灭菌20min。
当灭菌完成后，确认排气口正常后，以0.3~5L/min的通气量通入过滤气体．接通冷却水管脚开挽拌在低转速下进行培养基的冷却．3.4 接种接种是在发酵罐顶部接种口进行。
适当降低通风量，在接种口四周缠绕上经酒精浸泡的脱脂棉，点燃后戴上石棉手套,迅速打开接种口，将菌种加入到发酵罐中，接种量为1％，然后将接种口盖子在火焰中灭菌后盖好。
在37℃，pH7.4下进行，搅拌速度为300rpm。
通气量100L/h.的条件下进行发酵培养。
3.5 取样检测分析3.5.1还原糖含量的测定还原糖含量测定用的是菲林试剂法。
3.5.2氨基氮含量的测定氨基氮含量的测定用的是甲醛滴定法3.5.3菌体浓度的测量用分光光度仪在OD600下测定菌液的吸光度.对于高于1.0的菌液要进行稀释，并进行吸光度的测定。
此时菌体密度即为吸收值与稀释倍数的乘积。
自培养操作开始起，每4h取一次样。
取样时将取样管口流出的最初15mL左右培养液作为废液，取随后流出的培养液10mL。
3.5.4实验是原始数据3.6 补料根据样品中还原糖的含量、氨基氮的含量、PH、溶氧量（DO值）、菌体密度（OD值）的变化，进行补料培养基的配制灭菌后，用补料瓶进行补料，期间要注意无菌操作和要注意蠕动泵运转中自于硅胶管的弯曲折叠，出现的阻塞现象以及水的渗漏等问题。