吴茱萸质量标准研究_TLC指纹图谱鉴别及HPLC测定吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量

２． 上海中药标准化研究中心 （上海 ２０１２０３）
【摘 要】 目的 建立吴茱萸药材 ＴＬＣ 指纹图谱及测定药材中吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量，为控制药材质量提供科学 依据。方法 利用 ＴＬＣ 法建立吴茱萸药材指纹图谱，采用 ＲＰ－ ＨＰＬＣ 法测定吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量。结果 不同产地吴 茱萸药材 ＴＬＣ 指纹图谱中显示有 ４ 个共有条斑，作为吴茱萸的特征性成分这 ４ 个条斑可用于药材的定性鉴别。不同批次药 材中吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量差异较大。结论 ＴＬＣ 指纹图谱鉴别结合吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量测定能较全面反映吴 茱萸药材质量，可用于药材质量控制。
【关键词】 吴茱萸；质量标准；指纹图谱；含量测定 【中图分类号】 Ｒ２８４．１ 【文献标识码】 Ａ 【文章编号】 １００７－ １３３４（２００８）０５－ ００８６－ ０３
Ｑｕａｌｉｔｙ Ｅｖａｌｕａｔｉｏｎ ｏｆ Ｆｒ ｕｃｔｕｓ Ｅｖｏｄｉａｅ—— —Ｑｕａｌｉｔａｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｒ ｍｉｎａｔｉｏｎ ｂｙ ＴＬＣ Ｆｉｎｇｅｒ ｐｒ ｉｎｔ ａｎｄ Ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ Ｄｅｔｅｒ ｍｉｎａｔｉｏｎ ｏｆ Ｅｖｏｄｉａｍｉｎｅ ａｎｄ Ｒｕｔａｃａｒ ｐｉｎｅ ｂｙ ＨＰＬＣ
·８６·
上海中医药杂志 ２００８ 年第 ４２ 卷第 ５ 期 ＳＨ．Ｊ．ＴＣＭ Ｍａｙ， ２００８； Ｖｏ１．４２ Ｎｏ．５
方药揽胜
吴茱萸质量标准研究
— ——ＴＬＣ 指纹图谱鉴别及 ＨＰＬＣ 测定吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量
段朝辉 １， ２
张红梅 １
朱恩圆 １， ２
侴桂新 １， ２
王峥涛 １， ２
１． 上海中医药大学中药研究所中药标准化教育部重点实验室 （上海 ２０１２０３）
Ｆｒｕｃｔｕｓ ｅｖｏｄｉａｅ； ｑｕａｌｉｔｙ ｓｔａｎｄａｒｄ； ｆｉｎｇｅｒｐｒｉｎｔ； ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ ｄｅｔｅｒｍｉｎａｔｉｏｎ
中 药 吴 茱 萸 为 芸 香 科 植 物 吴 茱 萸 Ｅｖｏｄｉａ ｒｕｔａｅｃａｒｐａ （Ｊｕｓｓ．） Ｂｅｎｔｈ． 石 虎 Ｅｖｏｄｉａ ｒｕｔａｅｃａｒｐａ （Ｊｕｓｓ．） Ｂｅｎｔｈ． Ｖａｒ． ｏｆｆｉｃｉｎａｌｉｓ （Ｄｏｄｅ） Ｈｕａｎｇ 或疏毛吴茱萸 Ｅｖｏｄｉａ ｒｕｔａｅｃａｒｐａ （Ｊｕｓｓ．） Ｂｅｎｔｈ． Ｖａｒ． ｂｏｄｉｎｉｅｒｉ （Ｄｏｄｅ） ｈｕａｎｇ 的干燥近成熟果 实，具有温胃止吐、温脾止泄、镇痛、升高体温等作用［１］。吴茱 萸中含有多种生物碱类成分，吴茱萸碱和吴茱萸次碱作为吴 茱萸的主要活性成分，其含量直接影响药材质量［２］。近年来， 有关吴茱萸药材中生物碱含量测定及 ＨＰＬＣ 指纹图谱研究 均有报道［３－７］。但结合 ＴＬＣ 定性鉴别和 ＨＰＬＣ 含量测定对其
①吸取对照品溶液 ５ μｌ、１ 号供试品溶液 ５ μｌ、其他供试 品溶液各 ２０ μｌ，分别呈条带状点样于薄层板上；以正己烷－ 氯仿－ 丙酮－ 甲醇（２４∶９∶５．５∶１）为展开剂，展开 ８ ｃｍ，取出，晾 干；喷以改良碘化铋钾试液，置于可见光下检视，并摄制图片 （图 １－ Ａ）。
②吸取对照品溶液 １ μｌ、１ 号供试品溶液 １ μｌ、其他供试 品溶液各 ５ μｌ，分别呈条带状点样于薄层板上；以正己烷－ 氯 仿－ 丙酮－ 甲醇（２４：９：５．５：１）为展开剂，展开 ８ ｃｍ，取出，晾干； 薄层板先置于紫外光（２５４ ｎｍ）下观察荧光猝灭色谱，并摄制 图片（图 １－ Ｂ）；然后再喷以 １０％硫酸－ 乙醇溶液，在 １０５ ℃加 热至斑点显色清晰，置于紫外光（３６６ ｎｍ）下观察荧光色谱， 并摄制图片（图 １－ Ｃ）。
２．１ ＴＬＣ 指纹图谱鉴别 ２．１．１ 供试品溶液制备 称取吴茱萸药材粉末（５０ 目）约 １ ｇ， 用氨水 ２ ｍｌ 润湿，加氯仿 １０ ｍｌ，超声处理 ３０ ｍｉｎ，滤过，作为 供试品溶液。 ２．１．２ 对照 品 溶 液 制 备 称取吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照 品适量，加氯仿制成每 １ ｍｌ 含吴茱萸碱和吴茱萸次碱各约 １ ｍｇ 的溶液，即得。 ２．１．３ 色谱条件
１ 仪器与试药
硅胶ＧＦ２５４ 预制板 ２０ ｃｍ×１０ ｃｍ（Ｍａｃｈｅｒｅｙ－ Ｎａｇｅｌ），自动 点 样 仪（ＡＴＳ４， ＣＡＭＡＧ），双 槽 展 开 缸（ＣＡＭＡＧ），薄 层 色 谱 摄像仪 （Ｒｅｐｒｏｓｔａｒ ３，ＣＡＭＡＧ），Ａｇｉｌｅｎｔ １１００ Ｓｅｒｉｅｓ 高效液 相色谱仪；电子分析天平（Ｓａｒｔｏｒｉｕｓ）；ＫＱ－ ２５０ＤＢ 数控超声波 清洗仪。
按供试品溶液制备并按上述方法测定，计算加样回收率，吴 好。以乙腈－ 水（４３∶５７）为流动相，在两种不同品牌（Ｄｉａｍｏｎｓｉｌ
茱萸碱和吴茱萸次碱平均回收率分别为 ９７．４％和 １０２．５％， Ｃ１８ 和 Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｃ１８，４．６ ｍｍ×２５０ ｍｍ，５ μｍ） 色谱柱上进行
ＲＳＤ 分别为 ０．４３％和 １．１％。
Ａ
ａ
１
ｂ
２
３
４
Ｂ
ａ
１
ｂ
２３４Ｃ源自ａ１ｂ２ ３
４
Ａ：可见光，改良碘化铋钾显色；Ｂ：荧光猝灭 ２５４ ｎｍ； Ｃ：显色后荧光 ３６６ ｎｍ，硫酸显色 ａ：吴茱萸次碱；ｂ：吴茱萸碱 图 １ 吴茱萸药材 ＴＬＣ 指纹图谱
Ａ： 对照品；Ｂ：样品 １： 吴茱萸碱；２： 吴茱萸次碱 图 ２ 吴茱萸药材 ＨＰＬＣ 图
ＤＵＡＮ Ｃｈａｏ－ ｈｕｉ１，２ ＺＨＡＮＧ Ｈｏｎｇ－ ｍｅｉ１ ＺＨＵ Ｅｎ－ ｙｕａｎ１，２ ＣＨＯＵ Ｇｕｉ－ ｘｉｎ１，２ ＷＡＮＧ Ｚｈｅｎｇ－ ｔａｏ１，２ １． Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍａｔｅｒｉａ Ｍｅｄｉｃａ， Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ ２． Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｒ＆Ｄ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｓｔａｎｄａｒｄｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ Ｔｒａｄｉｔｉｏｎａｌ Ｃｈｉｎｅｓｅ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ
［基金项目］ 上海市重点学科建设项目资助（Ｙ０３０１） ［作者简介］ 段朝辉（１９７５－ ），男，陕西咸阳人，博士生，主要从事中 药活性成分与质量标准研究。 ［通讯作者］ 王峥涛，教授，博士生导师。Ｅ－ ｍａｉｌ： ｗａｎｇｚｈｔ＠ ｈｏｔｍａｉｌ．ｃｏｍ
进行系统的质量评价尚未见报道。本研究对吴茱萸药材中生 物碱类成分的 ＴＬＣ 指纹图谱鉴别方法进行系统的考察和优 化，利用 ＲＰ－ ＨＰＬＣ 法测定药材中吴茱萸碱和吴茱萸次碱含 量，旨在为控制吴茱萸药材质量提供科学依据。
试验，结果显示在两根色谱柱上吴茱萸碱和吴茱萸次碱均能
·８８·
上海中医药杂志 ２００８ 年第 ４２ 卷第 ５ 期 ＳＨ．Ｊ．ＴＣＭ Ｍａｙ， ２００８； Ｖｏ１．４２ Ｎｏ．５
２）９ 份，每份约 ０．４ ｇ，精密称定，分别精密加入预先制备好的 氢呋喃和乙腈－ 甲醇－ 水溶剂系统进行试验，结果显示乙腈－
对照品溶液 ２ ｍ（ｌ 含吴茱萸碱约 ０．８ ｍｇ 和吴茱萸次碱约 ０．８ ｍｇ）， 水（４３∶５７）对供试品溶液有较好的分离性能，色谱峰对称性
吴茱萸碱和吴茱萸次碱对照品由上海中药标准化研究 中心制备，纯度大于 ９８％。乙腈为色谱纯，水为超纯水，其他 试剂皆为分析纯。吴茱萸商品药材 ９ 件，样品编号：１（广西， 吴茱萸）；２（四川，吴茱萸）；３（江西，疏毛吴茱萸）；４（贵州，疏
上海中医药杂志 ２００８ 年第 ４２ 卷第 ５ 期 ＳＨ．Ｊ．ＴＣＭ Ｍａｙ， ２００８； Ｖｏ１．４２ Ｎｏ．５
２．２．２ 对照 品 溶 液 制 备 精密称取吴茱萸碱和吴茱萸次碱 对照品适量，置 ２５ ｍｌ 量瓶中，乙醇溶解并稀释至刻度，制成 每 １ ｍｌ 含吴茱萸碱 ０．０９５ ｍｇ 和吴茱萸次碱 ０．１２０ ｍｇ 的溶 液，摇匀，作为对照品溶液。 ２．２．３ 供试品溶液制备 取吴茱萸药材粉末（５０ 目）约 ０．１ ｇ， 精密称定，置 ５０ ｍｌ 具塞三角瓶中，精确加入乙醇 ５０ ｍｌ，称 重，浸泡 １ ｈ，超声处理（功率 ２５０ Ｗ，频率 ４０ ｋＨｚ）４０ ｍｉｎ，放 冷，补足重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得。 ２．２．４ 线性关系考察 精密吸取对照品溶液 ０．１，０．２，０．４，１．０， ２．０，４．０，１０ ｍｌ，分别置 １０ ｍｌ 量瓶中，加乙醇至刻度，摇匀。精 密吸取上述溶液各 １０ μｌ，依次注入高效液相色谱仪，计录峰 面积积分值。以色谱峰面积（Ｙ）对进样量（Ｘ）进行回归统计， 得吴茱萸碱回归方程 Ｙｊ＝１．００×１０４Ｘｊ＋１．２２，ｒ＝０．９９９９（ｎ＝７）；吴 茱萸次碱回归方程 Ｙｃ＝４．４４×１０３Ｘｃ－ ２．９６，ｒ＝０．９９９９（ｎ＝７）。表 明吴茱萸碱在 ０．００９５￣０．９５ μｇ 线性关系良好，吴茱萸次碱在 ０．０１２￣１．２０ μｇ 线性关系良好。 ２．２．５ 精 密 度 试 验 精密吸取对照品溶液 （含吴茱萸碱 ３．８ μｇ·ｍｌ－１ 和吴茱萸次碱 ４．８ μｇ·ｍｌ－１）１０ μｌ，连续进样 ６ 次， 记录峰面积积分值，吴茱萸碱和吴茱萸次碱 ＲＳＤ 分别为 ０．２１％和 ０．３３％。 ２．２．６ 重复性试验 取同一份药材 ６ 份，按上述方法测定， 吴茱萸碱和吴茱萸次碱 ＲＳＤ 分别为 １．８％和 １．２％。 ２．２．７ 稳定 性 试 验 取同一份供试品溶液，分别于配制后 １，４，８，１６，２４，３６ ｈ，按上述方法测定，吴茱萸碱和吴茱萸次碱 ＲＳＤ 分别为 １．１％和 １．２％，表明供试品溶液在 ３６ ｈ 内基本稳 定。 ２．２．８ 加样 回 收 率 试 验 取已知含量的同一份药材 （样品
·８７·
毛吴茱萸）；５（贵州，疏毛吴茱萸）；６（浙江，未鉴定）；７（安徽， 吴茱萸）；８（湖南，疏毛吴茱萸）；９（湖南，疏毛吴茱萸）。各样 品基源经中国药科大学中药学院生药教研室张勉副教授鉴 定。
２ 方法与结果
２．２ 吴茱萸碱和吴茱萸次碱含量测定 ２．２．１ 色 谱 条 件 Ｌｉｃｈｒｏｓｐｈｅｒ Ｃ１８ 色 谱 柱 （４．６ ｍｍ×２５０ ｍｍ，５ μｍ）；流动相乙腈－ 水（４３∶５７）；检测波长 ２２５ ｎｍ；流速 １ ｍｌ·ｍｉｎ－１；柱温为室温；进样量 １０ μｌ。理论板数按吴茱萸碱 峰计算不低于 ７ ０００。对照品和样品色谱见图 ２。