基因工程工具酶
基因工程常用的工具酶
2024/10/14
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识别序列呈典型的旋转对称型回文结构
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
回文结构:两条核苷酸链的核酸序列呈双重旋转对称排列的 DNA双螺旋结构
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第三节 DNA聚合酶
2024/10/14
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DNA聚合酶：能够催化DNA复制和修复DNA分子损伤 的一类酶
❖作用特点
能够把脱氧核苷酸分子连续的加到DNA分子引物链的3’-OH末端，催 化核苷酸的聚合
❖作用条件
➢ 脱氧核苷酸原料：四种脱氧核苷三磷酸dNTP（dATP、dTTP、 dCTP、dGTP）
属名
种名
株名
Haemophilus influenzae d
HindΙ、 HindⅡ、 Hind Ⅲ
不同限制修饰系统
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4
三、Ⅱ型限制酶的特性-识别序列
识别双链DNA分子中特定的4 - 8对核苷酸序列
EcoR I的切割位点
EcoR I的识别序列
5‘ … G C T G A A T T C G A G … 3’ 3‘ … C G A C T T A A G C T C … 5’
5‘ HO 3‘ HO
T4-PNP
5‘ p 3‘ HO
OH 3‘ OH 5‘
Mg2+ pppATP（g-32P-ATP）
OH 3‘
5‘ HO
BAP / CIP
基因工程基因工程工具酶
基因工程工具酶引言基因工程是一门利用重组DNA技术来改变生物体遗传性状的学科。
在基因工程的过程中，基因工程工具酶发挥着关键的作用。
本文将介绍几种常用的基因工程工具酶，包括限制性内切酶、连接酶和修饰酶。
一、限制性内切酶1.1 定义限制性内切酶（Restriction Enzyme）是一类具有特异性切割DNA双链的酶。
它可以识别并切割DNA的特定序列，通常这个序列是对称的，在切割后会产生特定的片段。
1.2 工作原理限制性内切酶能够通过识别和结合DNA的特定序列来进行切割。
它们通常识别的序列是4到8个碱基对长，具有一定的对称性。
一旦内切酶与特定序列结合，它会切断DNA的链，在特定的位置形成断裂，从而将DNA切割成特定的片段。
1.3 应用限制性内切酶在基因工程中有着广泛的应用。
它们可以用于构建基因工程载体、进行DNA片段的精确克隆等。
通过选择适当的限制性内切酶，可以对DNA进行特定的切割和连接，从而实现对目标基因的定向操作。
二、连接酶2.1 定义连接酶（Ligase）是一种酶类，能够将两条DNA片段连接起来。
在基因工程中，连接酶通常被用于连接目标基因和载体。
2.2 工作原理连接酶通过催化两条DNA片段之间的磷酸二酯键的形成来连接DNA。
它可以将两条具有互补末端的DNA片段连接在一起，形成一个新的DNA分子。
2.3 应用连接酶在基因工程中的应用非常广泛。
它们可以用于构建重组DNA分子、进行目标基因的插入等。
通过连接酶的作用，可以将多个DNA片段连接起来，构建出符合需要的重组DNA分子。
三、修饰酶3.1 定义修饰酶是指能够修饰DNA分子的酶类。
在基因工程中，修饰酶通常被用于添加或去除特定的DNA序列。
3.2 工作原理修饰酶可以通过催化酸解或碱解反应来改变DNA分子的结构。
它们可以添加或去除DNA上的甲基基团、酶解酶切位点等。
3.3 应用修饰酶在基因工程中起着重要的作用。
它们可以用于DNA甲基化的分析、目标基因的修饰等。
基因工程的工具酶
用衔接物分子连接平末端的DNA片段
衔接物：指用化学方法 合成的一段由若干个核 苷酸组成的、具有一个 或数个限制酶识别位点 的寡核苷酸片段
四、重组DNA实验的一般程序
a. 选用一种对载体DNA只具唯一限制识别位点的限制酶
（如EcoR I）作位点特异的切割，形成全长的具粘性 末端的线性DNA分子 b. 再将外源DNA片段也用同一种酶作相同的消化。 c. 混合，加入DNA连接酶。由于具有相同的（如EcoR I） 粘性末端，能退火形成双链结合体。其中单链缺口经 DNA连接酶封闭之后，便产生稳定的杂种DNA分子。
核酸水解酶类
核酸内切酶 核酸外切酶
DNA聚合酶 RNA聚合酶 DNA连接酶 磷酸酶 核苷酸激酶 核苷酸转移酶 甲基化酶
程常用工具酶 限制性核酸内切酶 DNA连接酶 DNA聚合酶 核酸酶 核酸修饰酶
分子克隆最常用两个工具酶
“分子 剪刀”
⒈ 限制性核酸内切酶 —— 在DNA上核苷酸的 特定连接处以特定的方式把DNA双链切开。如EcoRI, HpaI
④ 反应体积和甘油浓度：
商品化的限制性内切核酸酶均加50％甘油 作为保护剂，一般在-20℃保存。酶切反应时， 加酶的体积一般不超过总反应的10％，否则甘 油浓度过高，影响酶切反应
⑤ 反应时间：通常为1h；进行大量DNA酶切反 应时一般让酶解过夜
⑥ DNA纯度和结构 DNA样品中所含的蛋白质、有机溶剂、
4. Taq DNA聚合酶
5. 逆转录酶：依赖于RNA的DNA聚合酶
6. RNA聚合酶
大肠杆菌DNA聚合酶I
以一条DNA为模板通过聚合作用把脱氧核苷酸加到 双链DNA分子的 3’-OH 端而合成新的 DNA.
用途：DNA缺口平移中标记DNA探针
基因工程-工具酶
基因敲入
2
能。
利用工具酶将外源DNA片段整合到目标基
因中，实现新基因的表达。
3
基因编辑
通过工具酶修饰目标基因的特定碱基， 实现精确的基因改造。
农业、医药和工业领域的应用
农业
利用基因工程和工具酶，开发抗 虫、抗病、耐旱和高产的转基因 作物。
医药
工具酶在基因治疗中起着关键作 用，用于修复人类遗传病和癌症 等疾病的基因。
基因工程-工具酶
基因工程是利用DNA技术对生物体进行改造的科学，工具酶在基因工程中起 着至关重要的作用。
工具酶的作用
工具酶是基因工程中的重要工具，用于切割、连接和修饰DNA分子，使得科 学家能够精确操控基因。
常用的工具酶类型
限制酶
识别和切割DNA序列，用于定位和克隆特定基因。
连接酶
将不同DNA片段连接在一起，构建重组DNA分子。
修饰酶
对DNA分子进行修饰，如甲基化、去甲基化等。
造极酶
用于扩增DNA序列，如聚合酶链反应（PCR）中 的DNA聚合酶。
工具酶的工作原理
工具酶通过与DNA特定序列的互作用，识别并结合到目标序列上，然后以特 定的方式切割、连接或修饰DNA分子。
பைடு நூலகம்
基因修饰的方法
1
基因敲除
通过工具酶切割目标基因，使其失去功
工业
利用工具酶进行工业发酵，生产 各种化学品、药物和生物燃料。
挑战和限制
• 技术限制：某些DNA序列难以切割或修饰。 • 安全问题：基因修饰可能带来意想不到的风险和后果。 • 伦理考虑：对基因工程的道德和伦理问题需引起广泛关注。 • 法律和监管：基因工程面临严格的法律和监管要求。
第二节 基因工程工具酶
第二节 基因工程工具酶【掌握常用工具酶的定义、特点、作用方式】我们大家都知道，基因工程是现代生物技术的核心技术，带动其他技术的发展。
基因工程的基本技术就是：切接 转 增 检用人工的方法把不同生物的遗传物质（基因）分离出来，在体外进行剪切、拼接、重组，形成基因重组体，然后再把重组体引入宿主细胞或个体中以得到高效表达，最终获得人们所需要的基因产物。
在进行这些操作时，需要借助一类特殊的工具【如同做外科手术需要手术刀这种工具一样】，在基因工程操作中这种必不可少的工具就是——酶；由于这些酶类被用作工具，所以称之为“工具酶”。
这些酶种类繁多，作用、特点各异，到目前为止，常用的工具酶有300多种。
下面着重讲解一些重要的工具酶。
一、限制性核酸内切酶● 定义：是一类能够识别双链DNA 分子中的特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。
● 生理功能特性：切割降解入侵的外源DNA ，使得外源DNA 的入侵受到限制的现象。
（一）命名EcoR Ⅰ(E ：属名；co ：种名；R ：细菌株RY13的第一个字母；Ⅰ：发现次序)Eco Escherichia属名 Coli 种名 Ry13 株系编号（三）基本特性1、识别特定序列✧绝大多数的Ⅱ型限制性核酸内切酶都能够识别由4-8个核苷酸组成的特定的核苷酸序列。
限制性核酸内切酶就是从其识别序列内切割DNA分子的，因此这些识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。
✧识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如GANTC)两种，它们都呈回文结构。
2、切割方式：由核酸内切限制酶的作用而造成的DNA分子的断裂作用，通常有下列两种不同的方式：（1）产生平末端在识别序列双链DNA两条链的对称轴上同时切断磷酸二酯键，形成平头双链末端，称为平整末端。
【书上p15图】（2）产生粘性末端限制性内切酶交错切割DNA双链而形成彼此互补的单链末端，可形成氢键，叫做~。
5’粘性末端【书上】3’粘性末端它们能够通过互补碱基间的相互作用而重新环化起来。
基因工程基因工程工具酶
2023-11-03
目录
• 基因工程工具酶概述 • 基因工程工具酶的种类及应用 • 基因工程工具酶的生产及纯化 • 基因工程工具酶的发展趋势及挑战 • 基因工程工具酶的相关法规及伦理问题
01
基因工程工具酶概述
基因工程工具酶的定义
基因工程工具酶是指那些在基因工程实验中用于切割、修饰 、检测和操控DNA的酶。
详细描述
DNA连接酶可以连接DNA片段之间的缺口，实现DNA分子的拼接。在基因工程中，它被广泛应用于 基因克隆、载体构建、测序等实验中。根据来源不同，DNA连接酶具有不同的特性和应用范围。
逆转录酶
总结词
逆转录酶是一种能够将RNA转化为cDNA 的酶，是基因工程中重要的工具酶之一。
VS
详细描述
逆转录酶可以逆转录RNA分子，生成 cDNA分子。在基因工程中，它被广泛应 用于RNA测序、cDNA库构建、基因克隆 等实验中。根据来源不同，逆转录酶具有 不同的特性和应用范围。
03
基因工程工具酶的生产及 纯化
基因工程工具酶的生产
01
02
03
基因克隆
将目标酶的基因克隆到表 达载体中，构建成重组 DNA分子。
细胞转化
将重组DNA分子导入宿 主细胞，使目标基因在细 胞内表达。
培养基选择
选择适合细胞生长和酶表 达的培养基，优化培养条 件。
基因工程工具酶的纯化
细胞破碎
采用物理或化学方法破碎 细胞，释放出目标酶。
这些酶主要来自生物体内，但也可以通过基因工程技术进行 人工改造和优化。
基因工程工具酶的重要性
基因工程工具酶是实现基因操作的关键工具，没有它们，我们无法实现从DNA片 段到完整基因组的精确编辑。
基因工程的工具酶
T
T
A
G
C
C
G
怎样切？ • 基因的剪刀——限制性内切酶（简称限制酶）
例：大肠杆菌(E.coli)的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。
限制酶
限制酶
几种II型限制性核酸内切酶的酶切位点
Pst I
Provindencia stuartii 164
Haemophilus influenzae Rd
4363 pBR322物理图谱
练习题
为了绘制长为3.0kb BamH Ⅰ限制性片段的限制性图谱，分别用EcoR Ⅰ、Hpa Ⅱ、 EcoR Ⅰ+Hpa Ⅱ消化这一片段的三个样品，然后通过凝胶电泳分离DNA片段，溴化乙锭染色后观 察DNA带型。请根据这些结果绘制一个限制性图谱，要标明EcoR Ⅰ和Hpa Ⅱ识别位点间的 相对位置，以及它们之间的距离（kb）。
现非特异性的DNA片段的现象。 易产生星活性的内切酶用*标记。如：EcoR I*
造成星活性参数 甘油浓度12-20%，酶与DNA比例，离子强度，45%聚乙二醇(PEG)，有机溶剂，8%二甲基
亚枫，二价阳离子，12%
限制性内切酶的应用
1、重组DNA前的切割 2、构建新质粒 3、构建物理图谱 4、DNA分子杂交 5、制备DNA探针 6、亚克隆以用作序列分析 7、基因定位，DNA同源性研究。
A. 连接的两条链必须分别具有 3′端自由羟基（-OH）和5 ′端磷酸基团（-P），而且只有这两 个基团彼此相邻时才能进行连接反应；
B. 在羟基和磷酸基团间形成磷酸二酯键是一种耗能过程，因此连接反应必须有能量分子的参与， 通常有两种能量分子，即ATP和NAD+。
是两条链－因此不能将两条单链连接起来或使单链环化起来。
基因工程中常用的酶
分类与用途
分类
根据识别序列的长度和切割位点的特性，限制性内切核酸酶 可分为Ⅰ型和Ⅱ型。Ⅰ型限制性内切核酸酶识别位点较长， 切割位点不规则；Ⅱ型限制性内切核酸酶识别位点较短，切 割位点规则。
用途
限制性内切核酸酶在基因工程中主要用于DNA的克隆、基因 的定位、突变分析等方面。通过限制性内切核酸酶的切割， 可以将DNA片段分离出来，再进行后续的克隆和转化等操作 。
生物制药
在生物制药中，使用DNA 连接酶将药物基因或疫苗 基因插入到载体中，制备 基因药物或基因疫苗。
03
聚合酶
定义与特性
聚合酶
是一种能够催化DNA复制和修复的酶， 通过聚合核苷酸片段，合成新的DNA 链。
特性
聚合酶具有专一性、高效性和耐受性 等特性，能够在特定的模板指导下， 高效地合成DNA链。
分类与用途
分类
根据来源不同，反转录酶可分为天然反转录酶和重组反转录酶。
用途
在基因工程中，反转录酶主要用于将RNA转录为cDNA，以便进行基因克隆、表达和功能研究。
反转录酶的应用案例
基因克隆
通过反转录酶将mRNA转化为 cDNA，再利用限制性内切酶将其 切割成适当大小的片段，进行基 因克隆和测序。
基因工程中常用的酶
• 限制性内切核酸酶 • DNA连接酶 • 聚合酶 • 反转录酶 • 其他常用酶类
01
限制性内切核酸酶
定义与特性
定义
限制性内切核酸酶是一类能够识 别并切割DNA特定序列的酶，是 基因工程中常用的工具酶之一。
特性
限制性内切核酸酶具有高度的特 异性，能够识别并切割DNA中的 特异序列，切割位点通常是DNA 双链中的特定位点。
限制性内切核酸酶的应用案例
基因工程中常用的三种工具酶
一、限制性核酸内切酶（restriction endonuclease）1．定义：凡能识别和切割双链DNA分子内特定核苷酸序列的酶，也称为限制酶（restriction enzyme，RE）。
2．类型：来自原核生物，有三种类型。
Ⅰ型：兼具甲基化修饰和ATP参与的核酸内切酶活性，随机切割。
Ⅱ型：大多能特异识别4～6个核苷酸序列（回文结构），最大识别序列为8个核苷酸，如SfiI、NotI；但有近10种Ⅱ型限制酶的识别序列为非回文结构，如SfaNI、MnlI等，Ⅱ型限制酶均可作为基因工程的工具酶。
另有一些来源不同的限制酶的识别位点是相同的核苷酸序列，将这类酶特称为同工异源酶（isoschizomers）或同裂酶。
同工异源酶切割产生相同的末端；有一些同工异源酶对于切割位点上的甲基化碱基的敏感性有所差别，故可用来研究DNA 甲基化作用，如SmaI和XmaI；HpaII和MspI；MboI和Sau3AI是成对的同工异源酶；其中HpaII和MspI是一对同工异源酶，其识别位点是CCGG。
与同工异源酶对应的一类限制酶，它们虽然来源各异，识别序列也各不相同，但都产生出相同的粘性末端，称为同尾酶（isocaudamers）。
常用的限制酶BamHI、BclI、BglII、Sau3AI和XhoII就是一组同尾酶，它们切割DNA之后都形成由GATC4个核苷酸组成的粘性末端。
显而易见，由同尾酶所产生的DNA片段，是能够通过其粘性末端之间的互补作用而彼此连接起来的，因此在基因克隆实验中很有用处。
但必须指出，由两种同尾酶消化产生的粘性末端，重组之后所形成的序列结构再不能被原来的任何一种同尾酶所识别。
Ⅲ型：功能基本同Ⅰ型，但为特定位点切割。
三种限制酶的区别如下表所示：Ⅰ型Ⅱ型Ⅲ型DNA底物dsDNA dsDNA dsDNA辅助因子Mg2+,A TP,SAM Mg2+ Mg2+,A TP识别序列特异特异特异切割位点非特定（于识别序列前后100~1000bp范围之内）特定（切割于识别序列之中或近处，固定位点）特定（切割点在识别序列后25~75bp处）与甲基化作用的关系内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用酶蛋白不具有甲基化作用内切酶蛋白同时具有甲基化酶的作用3．命名：第一个字母取自产生该酶的细菌属名，用大写；第二、第三个字母是该细菌的种名，用小写；第四个字母代表株。
第二章基因工程中常用的工具酶
第二章 基因工程中常用的工具酶限制性内切酶—主要用于DNA 分子的特异切割分子的特异切割DNA 甲基化酶—用于DNA 分子的甲基化分子的甲基化 核酸连接酶—用于DNA 和RNA 的连接的连接核酸聚合酶—用于DNA 和RNA 的合成的合成核酸酶—用于DNA 和RNA 的非特异性切割的非特异性切割核酸末端修饰酶—用于DNA 和RNA 的末端修饰的末端修饰其它酶类--用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
用于生物细胞的破壁、转化、核酸纯化、检测等。
§2-1 核酸内切限制酶定义：核酸内切限制酶是一类能够识别双链DNA 分子中的某种特定核苷酸序列，并由此切割DNA 双链结构的核酸内切酶。
双链结构的核酸内切酶。
到目前为止已经从许多种不同的微生物中分离出了2300种以上不同的核酸内切限制酶。
种以上不同的核酸内切限制酶。
核酸内切限制酶的发现及其生物功能（图）一 、限制修饰系统的种类（图）限制修饰系统的种类（图）二、 限制性内切酶的定义、命名1. 定义：广义指上述三个系统中的限制酶；广义指上述三个系统中的限制酶；狭义指II 型限制酶。
型限制酶。
2. 命名：限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
限制酶由三部分构成，即菌种名、菌系编号、分离顺序。
例如：Hin d Ⅲ 前三个字母来自于菌种名称H. influenzae ，“ｄ”表示菌系为ｄ型血清型；“Ⅲ”表示分离到的第三个限制酶。
表示分离到的第三个限制酶。
Eco RI RI——Escherichia coli RI RI Hin d Ⅲ—Haemophilus influensae d ⅢSac I (II)—Streptomyces achromagenes I (Ⅱ)三、Ⅰ型和Ⅲ型核酸内切限制酶的缺点a.Ⅰ型核酸内切限制酶虽然能够识别DNA 分子中的特定序列，但它们的切割作用却是随机的，在距特异性位点至少1000bp 的地方可以随机地切割DNA 分子，因此这类酶在基因克隆中显然是没有用处的。
基因工程操作的工具酶
也称为Kronberg酶，是Kronberg等1956年发 现的第一个DNA聚合酶。
具有三种酶活性
a、5’ ---3’DNA聚合酶活性
CCGATA-OH E.coli DNA pol I CCGATAGCCT
GGCTATCGGA Mg2+ dNTP
GGCTATCGGA
.
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b、3’ ---5’ 外切酶活性
.
44
3. DNA聚合酶
分为两类： ①依赖于DNA的DNA聚合酶，包括大肠杆菌
DNA聚合酶I（全酶）、大肠杆菌DNA聚合 酶I的Klenow大片段酶、T4 DNA聚合酶、 T7DNA聚合酶和耐高温的DNA聚合酶等。 ②依赖于RNA的DNA聚合酶，有逆转录酶。
.
45
DNA聚合酶
(1)大肠杆菌DNA聚合酶I （E.coli DNA pol I)：
.
21
常见的限制性内切酶
限制性核酸内切酶名称 识别序列和切割点
EcoR Ⅰ
G↓AATTC
HindⅡ
GTPy↓PuAC
Hind Ⅲ
A↓AGCTT
BsuR I
GG↓CC
.
22
Pst Ⅰ Sma Ⅰ Xba Ⅰ Xho Ⅰ BamHⅠ Not Ⅰ
CTGCA↓G CCC↓GGG
T↓CTAGA C↓TCGAG G↓GATCC
.
14
限制性酶的识别序列一般为4~8个核苷 酸，这些序列大多呈回纹结构。
Eco RⅠ识别6个核苷酸序列，在特定的G-A 之间切割DNA分子。 5’ … G↓A –A- T –T – C … 3’ 3’ … C – T –T –A –A↑G … 5’
.
15
Pst Ⅰ酶切 5’ … C – T –G –C–A↓G … 3’ 3’ … G↑A–C – G–T– C… 5’
基因工程的工具酶
03
应用领域：基 因工程、生物 制药、环境保
护等领域
04
发展趋势：定 向进化与优化 将成为工具酶 研究的重要方 向，推动基因 工程领域的发
展。
工具酶在合成生物学中的应用与前景
工具酶在合成生物学中的作用：作为构建基因电路的关键元件，实现对基因的精确调控 工具酶的发展趋势：更高效、更精确、更稳定的工具酶不断被开发出来 工具酶在生物制药中的应用前景：利用工具酶进行药物设计和生产，提高药物疗效和降低成本 工具酶在环境保护中的应用前景：利用工具酶进行污染治理和生态修复，保护生态环境和促进可持续发展
工具酶在基因治疗和生物医学中的未来发展
01
基因治疗：工具酶在基因编辑和基因治疗中的应用
02
生物医学：工具酶在疾病诊断和治疗中的应用
03
未来发展：工具酶在个性化医疗和精准医疗中的应用
04
展望：工具酶在基因治疗和生物医学领域的发展趋势和挑战
THANK YOU
YOUR LOGO
04
应用：基因工 程、DNA测序 、基因治疗等
领域
DNA连接酶
功能：连接 DNA片段，形 成重组DNA
特点：高效、 特异性强、稳 定性好
应用：基因克 隆、基因突变、 基因表达调控 等
类型：T4 DNA连接酶、 T7 DNA连接 酶等
聚合酶
01
功能：在基因工程中，聚合酶用于切割和连 接DNA，以实现基因的插入、删除和修改
工具酶：基因工程工具酶是指 在基因工程中用于切割、连接 和修饰DNA的酶
12
34
应用：在基因突变的研究中，
实例：例如，使用限制性内切
基因工程工具酶可以用来诱导
酶切割DNA，然后使用DNA连
第三章 基因工程工具酶
（3）牛血清蛋白 (BSA)
BSA 是酶稳定剂，可避免热、表面张力、化学品导致 是酶稳定剂，可避免热、表面张力、 的酶变性。过量 BSA 会引起电泳拖尾。 的酶变性。 会引起电泳拖尾。
Ⅱ类 R-M 系统由限制性核酸内切酶和甲基化酶两 种酶分子组成。大多数限制酶都已分离出相应的甲 基化酶。 甲基化酶也称修饰酶 (modification enzyme)，用 来修饰限制酶的识别序列，在该序列位点的胞嘧啶 （C）5- 氨基上加一个甲基，使得该序列可以被限 制性内切酶识别而免于切割。
甲基化酶分两类： 甲基化酶分两类：
第三章 基因工程工具酶
基因工程工具酶
基因工程的操作，是在分子水平上的操作， 基因工程的操作，是在分子水平上的操作， 是依赖一些酶(如限制性核酸内切酶，连接酶， 是依赖一些酶 如限制性核酸内切酶，连接酶， 如限制性核酸内切酶 DN聚合酶等 作为工具对基因进行人工切割， 聚合酶等)作为工具对基因进行人工切割 聚合酶等 作为工具对基因进行人工切割， 拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“ 拼接和扩增等操作。所以把这些酶称之为“工 具酶” 工具酶是对野生菌株（ 具酶”。工具酶是对野生菌株（或真核生物如 酵母）进行改造、优化、 酵母）进行改造、优化、而产生的生物工程产 品。
DNA连接酶（ligase） 连接酶（ 连接酶 ）
能够催化 DNA 中相邻的 3’-羟基和 5’-磷酸 基末端之间形成3′，5′-磷酸二酯键; T4DNA 连接酶 可连接带匹配粘性末端的 DNA 分子，也可 使平端的双链 DNA 分子相互连接。 大肠杆菌 DNA 连接酶 只能连接带匹配粘末端的 DNA 分子.
基因工程的工具酶
基因工程的工具酶⏹限制性核酸内切酶⏹DNA连接酶⏹DNA聚合酶⏹碱性磷酸酶⏹末端脱氧核苷酸转移酶限制性核酸内切酶是一类能识别双链DNA分子特异性核酸序列的DNA水解酶.是体外剪切基因片段的重要工具限制性核酸内切酶不仅是DNA重组中重要的工具,而且还可以用于基因组酶切图谱的鉴定防御机制：⏹任何物种都有排除异物、保护自身的防御机制⏹人:免疫系统⏹细菌：限制与修饰系统寄主控制的限制与修饰现象限制与修饰系统是细胞的一种防卫手段, 各种细菌都能合成一种或几种能够切割DNA双链的核酸内切酶，它们以此来限制外源DNA存在于自身细胞内，但合成这种酶的细胞自身的DNA不受影响，因为这种细胞还合成了一种修饰酶,对自身的DNA进行了修饰,限制性酶对修饰过的DNA不能起作用.这种现象被称为寄主控制的限制与修饰现象。
限制酶(restriction enzyme）修饰酶(modifying enzyme）核酸酶切位点：既可以在3ˊ，5ˊ—磷酸二酯键的3ˊ酯键处（A）,也可以在5ˊ酯键处（B）切断磷酸二酯键1）核酸限制性内切酶的类型2）核酸限制性内切酶的基本特性3）同裂酶和同尾酶4）核酸限制性内切酶的命名法5）影响核酸限制性内切酶活性的因素限制性核酸内切酶的类型及特性按照限制酶的组成、与修饰酶活性的关系以及切断核酸的情况不同,分为三类：Ⅰ型Ⅱ型＊Ⅲ型第一类（I型）限制性内切酶:能识别专一的核苷酸顺序并在识别点附近的一些核苷酸上切割DNA分子中的双链但是切割的核苷酸顺序没有专一性，是随机的这类限制性内切酶在DNA重组技术或基因工程中用处不大，无法用于分析DNA结构或克隆基因如：Eco B、Eco K等第二类(II型)限制性内切酶：能识别专一的核苷酸顺序（回文对称顺序）并在该顺序内的固定位置上切割双链是DNA重组技术中最常用的工具酶之一这种酶识别的专一核苷酸顺序最常见的是4个或6个核苷酸,少数也有识别5个核苷酸以及7个、8个、9个、10个和11个核苷酸的回文对称顺序：有一个中心对称轴，从这个轴朝二个方向“读”都完全相同⏹切割后形成具有粘性末端（cohesive end)的DNA片段⏹切割后形成具有平末端（blunt end）的DNA片段限制酶在识别序列的对称轴上切割,形成的DNA片段没有突出的单链第三类（III型)限制性内切酶也有专一的识别顺序,但不是对称的回文顺序，在识别顺序旁边几个核苷酸对的固定位置上切割双链.但这几个核苷酸对不是特异性的。
3第三章基因工程的工具酶
三、核酸酶
作用：降解磷酸二酯键 分为：外切酶 内切酶
（一） Bal 31(来自于细菌 Alteromonas espejiana)
单链特异内切，双链特异外切，依赖于Ca2+ 用途： 构建限制酶图谱 产生末端缺失突变 DNA超螺旋线性化
ห้องสมุดไป่ตู้
（四） DNase I: 来自于牛胰腺，既可 以降解单链也可以降解双链，没有特异 性，产生单核苷酸或短链
（五）RNase H： 切割DNA—RNA杂交双链中的RNA
序列，使杂交双链变成单链DNA结构
（一）
四、聚合酶
（二） Klenow酶
该酶无5‘-3’外切活性，保留了5‘-3’聚合活性 及3‘-5’外切活性。
建立酶切图谱需要的酶类 确定每一种酶酶切后产生的分子量和片段数目 进行双酶切 比较酶切和双酶切的结果，绘制酶切图谱 含糊的位点可以通过部分酶切解决（可短时间 的酶切或者在4℃条件下进行）
六、 限制性内切酶的star活性
在pH不合适，或甘油浓度过高≥10%时， 限制性内切酶的切割位点会出现非专一性，因 此应确保酶的体积为总体积的十分之一以下。
蛋白结构 异源三聚体
同源二聚体
异源二聚体
辅助因子 ATP Mg2+SAM
Mg2+
ATP Mg2+SAM
识别序列 TGAN8TGCT
旋转对称序列
GAGCC
AACN6GTGC
CAGCAG
切割位点 距识别序列1kb处 识别序列内或附近 距识别序列下游
随机性切割
特异性切割
24-26bp处
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A.识别序列
• 识别序列又叫核酸内切酶的切割位点或靶序列。
• 回文序列的概念：具有特异性识别的反向重复序列称为回文 序列。
• 识别序列有连续的（如GATC）和间断的(如GANTC)两种， 它们都呈回文结构。
①由于附有标注字母在印刷上很不方便，所以 现在通行的是把全部略语字母写成一行。
②在上下文已经交待得十分清楚只涉及限制酶
四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性
1. 为单链多肽, 最适pH6-8, 能被盐抑制、被Mg2+激 活； ，2. 底物DNA分子双链中有特异性识别序列，通常有 4-8个bP甚或更多，大都为一回文对称的结构（即识别 序列中有一个中心对称轴，若从这个轴向两侧方向 “读”，内容都是完全相同的，也称为反向重复序 列）。
2、发现 早在20世纪中期，以Arber等人对入噬菌体在大肠
杆菌不同菌株的平板培养效应的研究中，就发现了原
在限制--修饰系统中限制作用是指宿主细菌 可以通过自身限制酶的作用，破坏入侵的外源 DNA(如噬菌体DNA等)，使得外源DNA对生 物细胞的入侵受到限制，而保护了宿主菌；
而生物细胞(如宿主)的DNA分子合成后，通 过自身修饰酶的作用，使特定位置上的碱基发 生甲基化而得到了修饰，可免遭自身限制性酶 的破坏，这就是R--M系统中修饰作用的含义。
1978年 W. Arber，H. O.Smith，Nathans因 发现限制性内切酶及对其功能研究的突出贡献 获得诺贝尔奖。
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二．核酸内切限制酶的类型 及切割频率
1、类型
特性 （7项）
I型
II型
III型
限制和修饰活 性
单一多功能的 酶
分开的核酸内 切酶和甲基化 酶
具有一种共同 亚基的双功能 的酶
• 以其功能可分为三大类：核酸降解酶类、核酸合 成酶类、核酸修饰酶类
第一节
限制性核酸内切酶和DNA片段化（九个问题）
一、限制性内切酶的发现 二．核酸内切限制酶的类型 及切割频率 三．核酸内切限制酶的命名原则 四.Ⅱ型核酸限制性内切酶的基本特性 五．影响核酸内切限制酶活性的因素（5点+1） 六. 限制性内切酶反应的终止 七、限制酶消化反应的步骤 八. 使用限制酶的注意点（4点） 九、DNA的片段化
基因工程工具酶
基因工程工具酶
• 自然界的许多微生物体内存在着一些具有特异功 能的酶类。
• 这些酶类参与微生物的核酸代谢，在核酸复制和 修复等反应中具有重要作用，有的酶还具有微生 物区别自己DNA和非己DNA的功能，进而作为 降解非己DNA的防御工具。
• 在研究掌握了最好的基因工程“工 具”。
酶的识别序列是6 bp时，则其切割频率 为(1/4)6 =1/4096，即每隔4.1kb就可能
有一个切割点。 当识别序列为n个 bp， 则其切割频率为（1/4）n 。
三．核酸内切限制酶的命名原则
由于发现了大量的限制酶，所以需要有一 个统一的命名法。H．O．Smith和D． Nathans(1973)提议的命名系统，已被广大学者 所接受。他们建议的命名原则包括如下几点： （1） 用属名的第1个字母（大写）和种名的头 2个字母（小写），组成3个字母的略语表示寄主 菌的物种名称。例如，大肠杆菌(Escherichia coli)用Eco表示，流感嗜血菌(Haemophilus influenzae)用Hin表示。
核酸内切限制 酶的蛋白质结 构
3种不同的亚基
单链多肽
2种不同的亚基
切割位点距 离识别位点 的情况
甲基化作用 的位点
在距寄主特 异性位点至 少1000bp的 地方可能随 机寄地主切特割异 性 的位点
位于寄主特 异性位点内 或其两侧
寄主特异性 的位点
距寄主特异 性位点3，端 24~26bp处
寄主特异性 的位点
识别未甲基 能
能
能
化的序列进
行核酸内切
酶切割
序 列 特 异 的 不是
是
是
切割
D N A 克 隆 中 无用 的用处
十分有用
用处不大
切割频率
---是指某限制性核酸内切酶在DNA分子中预期的切割概率。 有了它，又知道DNA序列的长度，就可以估算该限制性核酸 内切酶在某种DNA分子中的切点数N。
但前提是：假定DNA的碱基组成是均一的、识别序列在DNA 分子上是随机分布的。 因为所有的DNA分子都是由4种 脱氧核苷酸组成的，每一种出现的概率即为1/4 。如果某限 制性核酸内切
（4）名称： 限制酶，核酸内切限制酶用R表示 外，还要带有系统的名称，例如，流感嗜血菌核 酸内切酶 R．HindIII；
修饰酶，则在它的系统名称之前加上甲基化 酶M表示。相应于核酸内切酶R．HindIII的流感 嗜血菌Rd菌株的修饰酶，命名为甲基化酶M. HindIII。
但在实际应用上，这个命名体系已经作了进 一步的简化：
限制性核酸内切酶的命名
Escherich Coli ia
Ry13
EcoR I
属名
种名
株系
编号
若种名头2个字母相同则其中一个可用种名 的第一和第三个字母。
（2） 用一个写在右下方的标注字母代 表菌株或型，例如Ecok、 Hind 。
（3）如果一种特殊的寄主菌株，具有几 个不同的R-M体系时，则以罗马数字表 示。例如，流感嗜血菌Rd菌株的几个限 制与修饰体系分别表示为HindI、HindII、 HindIII等等。
A B C C’ B’
A’
或
A’ B’ C’ C
BA
A B N B’ A’ 或
A’ B’ N’ B A
A B B’ A’ A B B’ A’
不同核酸内切酶的特异识别位点
一、限制性内切酶(restriction enzyme)的发现 1．限制性核酸内切酶：
---是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核 苷酸序列，并由此切割DNA双链结构的核酸内切酶。 它们主要是从原核生物中分离纯化出来的。
根据1994年美国出版的《分子生物学百科全书 》的统计数字，仅Ⅱ型核酸内切限制酶一项迄今就已 从各种不同的微生物当中，分离出2 300种以上，可 识别230种不同的DNA序列。