免疫检测技术

1 2 3 4 5 6 7 、免疫疾病诊断 动物植物生理活动研究（激素、维生素） 、动物植物生理活动研究（激素、维生素） 、物种及微生物鉴定 、动物、植物性状的免疫标记 动物、 、免疫增强药物和疫苗的研究 、发病机理研究 、分子生物学研究
第一节 抗原抗体反应原理
抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。这种 抗体能特异性地识别相应的抗原，并与之结合。 结合在体外也能发生，当抗原和抗体在体外特异性结合后 结合在体外也能发生， 可出现肉眼可见或借助仪器可检测出的反应现象。 可出现肉眼可见或借助仪器可检测出的反应现象。 这种特性就是许多免疫检测方法的基础!! 这种特性就是许多免疫检测方法的基础!! 试验时既可用已知抗体检测标本中有无相应抗原，也可 试验时既可用已知抗体检测标本中有无相应抗原， 用已知抗原检测标本中有无相应抗体。 用已知抗原检测标本中有无相应抗体。
第九章
免疫检测技术
免疫检测是目前生物学检测方法中 用途最广泛的一种方法。 用途最广泛的一种方法。 具有高度精确、灵敏、特异的特点。 具有高度精确、灵敏、特异的特点。 可用于免疫学的基础理论和应用研 究，也可应用于生物学研究的各个 领域。 领域。
免疫检测技术在生物科学领域中的应用： 免疫检测技术在生物科学领域中的应用：
絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低， 絮状沉淀试验方法简单，设备要求低，敏感度较低，目前 多用以测定抗原抗体反应的最适比。 多用以测定抗原抗体反应的最适比。
环状沉淀试验
操作步骤： 操作步骤：
（1） 用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管（5×50mm）底部， 用毛细滴管吸取抗血清加于沉淀管（ 50mm）底部， 避免产生气泡。（已知！） 。（已知 避免产生气泡。（已知！） 将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上， （2） 将抗原溶液沿管壁缓缓叠加于抗血清液面上，形成清晰 的交界面。（待测！ 。（待测 的交界面。（待测！ ） 置沉淀管于室温下使其反应，1~5min内在两界面间呈现 （3） 置沉淀管于室温下使其反应，1~5min内在两界面间呈现 乳白色沉淀环为阳性。30min仍无沉淀环出现则为阴性 仍无沉淀环出现则为阴性。 乳白色沉淀环为阳性。30min仍无沉淀环出现则为阴性。 应用：主要用于抗原的定性试验。用已知抗体来检测未知抗原。 应用：主要用于抗原的定性试验。用已知抗体来检测未知抗原。 诊断炭疽的Ascoli实验 细菌分型、血迹鉴定）。 实验、 （诊断炭疽的Ascoli实验、细菌分型、血迹鉴定）。
网格理论——解释抗原抗体形成沉淀的机制 网格理论——解释抗原抗体形成沉淀的机制
抗体过剩
抗体抗体比例合适
抗原过剩
网格学说（ 网格学说（lattice theory） ）
抗原 抗体
二、影响抗原抗体反应的因素
①温度：在一定温度范围内，提高温度可加速反应 温度：在一定温度范围内， 速度，缩短反应时间，常用反应温度为37-45℃。 速度，缩短反应时间，常用反应温度为37-45℃ ②溶液的pH：pH过高或过低可改变抗原和抗体理化 溶液的pH：pH过高或过低可改变抗原和抗体理化 性质，影响反应结果，因此溶液的pH应适宜 性质，影响反应结果，因此溶液的pH应适宜 （pH 6-8）。 6③电解质：反应中必须有适宜的电解质（0.85%NaCl） 电解质：反应中必须有适宜的电解质（0.85%NaCl） 参与，否则不出现可见反应。 参与，否则不出现可见反应。
一、体外抗原抗体反应的特点
①特异性：抗原抗体反应具有高度的特异性。 特异性：抗原抗体反应具有高度的特异性。 ②可逆性：抗原抗体反应所形成的复合物较稳定， 可逆性：抗原抗体反应所形成的复合物较稳定， 但在一定条件下可解离。（低酸、高盐） 但在一定条件下可解离。 低酸、高盐） ③比例性：抗原抗体的比例合适，才可出现可见的 比例性：抗原抗体的比例合适， 反应现象。（网格理论） 反应现象。（网格理论） 。（网格理论 ④阶段性：特异性结合阶段和可见反应阶段。 阶段性：特异性结合阶段和可见反应阶段。
四、免疫标记技术 常见标记免疫技术
放射免疫技术 酶免疫技术 荧光免疫技术
1. 放射免疫技术（125I） 放射免疫技术（
该法是用放射性核素作为标记物标记抗原或抗体 所进行的抗原抗体反应， 所进行的抗原抗体反应，尽管放射免疫技术需特殊 仪器设备且有一定的放射性危害， 仪器设备且有一定的放射性危害，但由于其具有高 度的灵敏度（pg）和自动化检测等特点， 度的灵敏度（pg）和自动化检测等特点，因此在实 验研究和临床检测中仍被广泛应用。 验研究和临床检测中仍被广泛应用。 主要用于激素、小分子药物、 主要用于激素、小分子药物、肿瘤标志物等 小分子化合物的定量分析。 小分子化合物的定量分析。
单向免疫扩散试验示意图
双向免疫扩散试验
双向免疫扩散试验是在琼脂板上按一定距离 打数个小孔， 打数个小孔，在相邻的两孔内分别放入抗原 和抗体材料。 和抗体材料。当抗原和抗体向四周凝胶中扩 在两孔间可出现2 条沉淀线， 散，在两孔间可出现2～3条沉淀线，本法常 用于抗原或抗体的定性或定量检测， 用于抗原或抗体的定性或定量检测，或用于 两种抗原材料的抗原相关性分析。 两种抗原材料的抗原相关性分析。
免疫电泳原理图解
火箭免疫电泳
火箭免疫电泳技术又称作单向电泳扩散 免疫沉淀试验， 免疫沉淀试验，它是由单向扩散发展起 来的一项定量技术， 来的一项定量技术，实质上是加速度的 单向扩散。 单向扩散。
火箭电泳图
沉淀线的高度与抗原量成正比
二、凝集反应（Agglutination） 凝集反应（Agglutination）
3.免疫电泳技术 3.免疫电泳技术
免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。 免疫电泳技术是电泳分析与沉淀反应的结合产物。 这种技术有两大优点：一是加快了沉淀反应的速度， 这种技术有两大优点：一是加快了沉淀反应的速度， 二是将某些蛋白组分利用其带电荷的不同而将其分 再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。 开，再分别与抗体反应，以此作更细微的分析。 免疫电泳包括:血清免疫电泳、对流免疫电泳、 免疫电泳包括:血清免疫电泳、对流免疫电泳、 火箭电泳、免疫印迹等 火箭电泳、
免疫荧光技术有直接法和间接法等。 免疫荧光技术有直接法和间接法等。
免疫荧光技术——直接法 免疫荧光技术——直接法
荧光素标记的 特异性抗体
Ag 组织切片
免疫荧光技术——间接法 免疫荧光技术——间接法
荧光素标记 的抗抗体 待测抗体
一、免疫沉淀反应
絮状沉淀
1. 液相沉淀反应
环状沉淀 免疫浊度沉淀
单向琼脂扩散试验
2. 凝胶扩散沉淀
双向琼脂扩散试验 血清免疫电泳
3. 凝胶免疫电泳
火箭电泳 对流免疫电泳
免疫印迹等
絮状沉淀试验
操作步骤： 操作步骤：
（1） 将可溶性抗原作一系列倍比稀释。 ） 将可溶性抗原作一系列倍比稀释。 （2） 各管加入一定浓度的适量抗血清。 ） 各管加入一定浓度的适量抗血清。 （3） 振摇使抗原、抗体充分混匀，置37℃孵育。 ） 振摇使抗原、抗体充分混匀， ℃孵育。 （4） 产生沉淀量随抗原量而不同，以出现沉淀物最多的管 ） 产生沉淀量随抗原量而不同， 为最适比例管。 为最适比例管。
颗粒性抗原（如细菌、细胞）与相应抗体， 颗粒性抗原（如细菌、细胞）与相应抗体，在适当电解 质存在的条件下， 质存在的条件下，经过一定时间后出现肉眼可见凝集块 称为凝集反应。 称为凝集反应。 1、直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应，出 直接凝集：将细菌或红细胞与相应的抗体直接反应， 现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。 现细菌凝集或红细胞凝集现象。又分为玻片法和试管法。 2、间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面， 间接凝集：将可溶性抗原包被在红细胞或乳胶颗粒表面， 与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。 与相应抗体反应出现颗粒凝集现象。
三、补体结合实验
（2个系统，5种成分） 个系统， 种成分）
三、补体结合实验
（2个系统，5种成分） 个系统， 种成分）
• 已知抗原加入血清（检测抗体） 已知抗原加入血清（检测抗体） – 加入标准量补体 – 加入包被抗体的红细胞 – 检测红细胞溶解情况
Ab
Ag
No Ab
Patient’s serum
血清免疫电泳
将抗原混合物（病人血清）在凝胶中用电泳 将抗原混合物（病人血清） 分离后，沿电泳方向挖一平行的小槽， 分离后，沿电泳方向挖一平行的小槽，加入 抗血清，进行双向扩散。 抗血清，进行双向扩散。沉淀线的特点显示 病人血清与正常人血清存在的差异， 病人血清与正常人血清存在的差异，即血清 蛋白组分的缺少或增加。 蛋白组分的缺少或增加。
Ag*
1000
2. 免疫荧光技术
将荧光素（异硫氰酸荧光素或罗丹明等）标记抗体， 将荧光素（异硫氰酸荧光素或罗丹明等）标记抗体， 制成荧光抗体诊断试剂。 制成荧光抗体诊断试剂。 用荧光显微镜观察荧光的产生或荧光强度， 用荧光显微镜观察荧光的产生或荧光强度，以此判断 抗原的存在、定位和分布情况。 抗原的存在、定位和分布情况。
单向琼脂扩散试验
原 理：
将适当浓度的抗体混入琼脂凝胶中， 将适当浓度的抗体混入琼脂凝胶中，琼脂 抗体混入琼脂凝胶中 凝固后，打成小孔，加入待测的抗原物质， 凝固后，打成小孔，加入待测的抗原物质， 使抗原在凝胶中由小孔自由向周围扩散， 使抗原在凝胶中由小孔自由向周围扩散，并 在小孔周围合适的位置与抗体结合形成沉 淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。 淀环，沉淀环的大小与抗原浓度呈正相关。
放射免疫分析－基本原理 放射免疫分析－
竞争性结合反应的经 典标记抗原（Ag*）和 典标记抗原（Ag*） 非标记抗原（Ag） 非标记抗原（Ag）与限 量抗体(Ab)竞争性结合 量抗体(Ab)竞争性结合 (Ab) Ag*和Ag具有等同的 Ag*和Ag具有等同的 与Ab结合能力 Ab结合能力
放 射 免 疫 测 定 法 (RIA) 示 意 图