生化实验：聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶

聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 乳酸脱氢酶同工酶
实验目的：
1. 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理 2. 掌握聚丙烯酰胺凝胶分离乳酸脱氢酶的操作技术 3. 掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色
重点难点：
1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理 2. 连续体系和不连续体系
实验原理
▪ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ▪ 连续系统和不连续系统 ▪ 乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色
实验步骤
胶的制备
待分离样品的准备
加样
电泳
（电压220，60 min）
染色
电泳结束后，分离凝胶，放在大培养皿内，加入染色液，染色10-20min
胶的制备
➢准备玻璃管，标记
PH 8.9 缓冲液 丙烯酰胺储存液 双蒸水
过硫酸铵(AP)
0.9 ml 0.9 ml 2.7 ml 0.25 ml
➢ 最后加TEMED 1滴 ➢ 置小烧杯中,混匀,用长滴管迅速注入到玻管,凝胶加至距
不连续电泳的四个不连续性 凝胶浓度的不连续 性；缓冲液离子成分的不连续性；缓冲液pH梯度的不 连续性；电位梯度的不连续性。
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净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳
分离蛋白质的原理
净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对天然状态生物大分子 进行的电泳，目的是为了保持蛋白质的天然构象、其亚 基之间的相互作用及其生物学活性。利用蛋白质分子中 所带净电荷、分子质量、形状的差异，在电场中泳动的 速度和方向不同，从而达到分离的目的。多数蛋白质的 pI在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱性缓冲系统中 进行电泳，蛋白质分子带负电荷，以不同速度向阳极迁 移，称为阳极电泳；对于一些碱性蛋白，使用酸性缓冲 系统进行电泳，蛋白质分子带正电荷而向阴极迁移，称 为阴极电泳。
1959年Markert等用电泳的方法将纯化的心肌乳酸脱氢酶(LDH) 分离出5条区带，由阳极到阴极依次命名为LDH1、LDH2、LDH3、 LDH4、LDH5，它们均具有LDH催化活性，从而首先提出了同工酶 的概念。目前已知LDH同工酶是由H和M亚基按不同比例组成的四 聚体。
LDH同工酶广泛存在于动植物及微生物中，动物各组织中LDH 同工酶各组分含量不同。临床上对LDH及同工酶的检测可作为某些 疾病诊断的依据之一。
凝胶的总质量浓度T和交联度C决定凝胶的有效 孔径。凝胶的三维网状结构具有分子筛效应，不同 大小和形状的大分子通过孔径时所受的阻滞力不同， 加上大分子的电荷效应，使各种大分子迁移率不同 得以分离。
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实验原理
（二）连续系统和不连续系统
连续系统 是指电泳系统采用相同孔径的凝胶、 缓冲系统等条件下进行区带电泳，是利用蛋白质分子 的电荷效应和分子筛效应进行分离，一般只用于分离 一些比较简单的样品，缺点是分辨率不高。优点是制 胶简单快捷，缓冲系统的pH恒定，可以防止样品进胶 后因pH变化发生凝聚和沉淀，缓冲系统组成简单。
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电泳： 加样后，盖上电泳槽安全盖，接通电源，
注意正负电极的连接，将电泳仪调至恒压220 V， 直到溴酚蓝前沿到达距凝胶下端约0.5 cm时（60 min），关闭电源，停止电泳。
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活性染色： 电泳结束后，将凝胶柱取下，用注射器辅助剥胶，
使凝胶掉入装有活性染色液的培养皿中。轻轻摇动培 养皿，使凝胶完全浸泡在染色液（在电泳结束前10分 钟配置，用前再加PMS，混匀置于37℃备用）中，放 入37℃恒温水浴中保温，染色过程注意避光，待大多 数条带显现蓝紫色时除去染色液，显色时间一般为 10~20 min。加入脱色液终止酶促反应，摇动3~5 min， 凝胶底色脱去直至背景清亮，数码相机照相。
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乳酸脱氢酶同工酶活性染色
用活性染色对LDH进行鉴定，将凝胶浸泡在活性染色 液中，LDH与底物的反应，用甲硫吩嗪(PMS)作为电子的 中间载体，氯化硝基四氮唑蓝(NBT)作为最终电子受体， 底物脱下的氢最后传递给NBT，NBT被还原后，产生蓝紫 色的不溶于水的物质以对LDH定位。反应式如下：
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蛋白质在净电荷聚丙烯酰胺凝胶 电泳中的分离因素
电荷因素 分子大小 分子形状
▪ 电荷因素 蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 ▪ 分子大小 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同 ▪ 分子形状 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同
12ຫໍສະໝຸດ Baidu
实验原理
（三）乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色
玻璃管上端的2cm处，加水封胶 ➢ 在室温中聚合5-10分钟 注意：制胶时避免产生气泡
准备电泳：
将凝胶玻璃管安装在电泳槽本体上 将凝胶玻璃
管从橡胶管上取下，去水，垂直插到电泳槽本体上， 旋紧。
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加样 取电极缓冲液加入上、下缓冲液
槽中，注意上槽液要高过电极，凝胶柱与下 液槽的缝隙处无气泡。凝胶柱上端灌满缓冲 液，用微量进样器吸取一定体积的样品溶液， 小心地将样品加在凝胶柱上端。
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实验原理
▪ （一）聚丙烯酰胺凝胶电泳 ▪ 聚丙烯酰胺凝胶:
是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis) 在催化剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(TEMED)和过硫 酸铵(AP)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此 凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
▪ AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合 反应进行。
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不连续系统 是指使用不同孔径的凝胶和不同缓 冲体系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶 的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先 浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，然后在一定浓度或 浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效应，也有 分子筛效应。虽然制胶操作难度较大，但是它具有连 续系统不可比拟的优越性，分辨率高。
AP-TMTED催化体系
▪ TEMED催化AP生成硫酸自由基：
S2O82－
2SO4·¯
▪ 硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：
▪ Bis将单体长链间连成网状结构：
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实验原理
O
O
O
CH2 = CH—C—NH2 CH2
(Acr)
+ CH2 = CH—C—NH—CH2—NH—C—CH =
聚合反应
(Bis)
自由基
交联
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（聚丙烯酰胺）
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聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：
1.凝胶透明，有弹性，机械性能好； 2.化学性能稳定，与被分离物不起化学反应； 3.对pH和温度变化较稳定,几乎无吸附和电渗
作用； 4.样品用量少，灵敏度可达10-6g; 5.凝胶孔径可调节； 6.分辨率高。