生化实验：聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶
烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶
实验八聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶一、实验目的１学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理。
２掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板（及同盘）电泳的操作技术。
３掌握同工酶定义、理化性质的差异，了解过氧化物酶的染色原理。
４掌握过氧化物酶的活性的测定。
二实验原理聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺（Acr）和交联剂（即共聚体的N,N－甲叉双丙烯酰胺Bis）在加速剂（N,N,N',N'－四甲基乙二胺TEMED）和催化剂（过硫酸胺(NH4)4S2O8 简称AP）的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶。
（一）聚丙烯酰胺凝胶聚合原理及相关特性１聚合反应聚丙烯酰胺是由Acr和Bis在催化剂（AP）或核黄素（C17H20O6N4）和加速剂（TEMDA）的作用下聚合而成的三维网状结构。
催化剂和加速剂的种类很多，目前常用的有２种催化体系：①AP-TEMED 属化学聚合作用②核黄素－TEMED 属光聚合作用２凝胶孔径的可调性及其相关性质①凝胶性能与总浓度及交联度的关系凝胶的孔径、机械性能、弹性、透明度、粘度和聚合程度取决于凝胶总浓度和Acr与Bis之比：a:b<10 脆硬乳白交联度：a:b>100糊状易断②凝胶浓度与孔径的关系T（Acr和Bis总浓度）增加孔径减小移动颗粒穿过网孔阻力增加③凝胶浓度与被分离物分子量的关系分子量增加阻力增加移动速度减慢。
同时还与分子形状及分子电荷有关系。
在操作时，可以选用凝胶。
因为生物体内大多数蛋白质在此范围内电泳均可取得满意的结果。
３试剂对凝胶聚合的影响水中金属离子或其他成分对凝胶电泳的电泳速度、分离效果等有影响。
（二）聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）原理根据有无浓缩效应可分为：连续系统：电泳体系中由于缓冲液PH值及凝胶浓度相同，带电颗粒在电场中主要靠电荷及分子筛效应。
不连续系统：电泳体系中由于缓冲液离子成分、PH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应，分子筛效应，还有浓缩效应。
实验5 聚丙烯酰胺电泳分离LDH
LDH同工酶分布于动物各组织、各种微生物和植物中。 心、肾以LD1为主，LD2次之； 肺以LD3、LD4为主； 骨骼肌以LD5为主； 肝以LD5为主，LD4次之。 血清中LD含量的顺序是LD2>LD1>LD3>LD4>LD5。
由于同工酶在不同的组织器官中分布不同，即具有组织特异性，
所以常用同工酶谱作临床诊断的依据及生物分类、遗传标记中。
一、目
的
复习有关同工酶的知识； 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢 酶同工酶原理、底物染色原理 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢 酶同工酶及底物染色操作技术。
二、原
理
以聚丙烯酰胺凝胶为支持物进行电泳，分离小鼠脏 器中乳酸脱氢酶； 分离后有5个同工酶区带，由正极开始向负极依次 为LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5；
电极缓冲溶液：称取甘氨酸28.8g及三羟甲基 氨基甲烷（Tirs）6.0g，分别溶解后加蒸馏水 到1000mL，pH＝8.3。 – 样品稀释液：浓缩胶缓冲溶液25mL，加蔗糖 10g及0.05％溴酚蓝5mL，最后加水至100mL。 2. 5mg/mL氧化型辅酶Ⅰ溶液：称50mg NAD +,加蒸 馏水10mL，置棕色试剂瓶，4℃贮存可稳定两星 期 3. 1mol/L乳酸钠溶液：取60％乳酸钠9.25mL，加蒸 馏水定容至50mL，置棕色瓶4℃贮存。 4. 0.1mol/L氯化钠溶液：称0.584g NaCl，加蒸馏水 溶解并定容至100mL。
Separation gel Lower gel buffer 30%聚丙烯酰胺 dH2O TEMED 10%AP
7.5％ 5mL 5mL 10mL 20μ L 100μ L
9％ 5mL 6mL 9mL 20μ L 100μ L
第四章实验五乳酸脱氢酶_LDH_同工酶的分离纯化
NAD+：10 mL NBT：10 mL PMS：2 mL 0.5 M PH7.6 Tris-HCl: 15 mL 0.5 M乳酸钠：15 mL 0.1NaCl：5 mL 去离子水：43 mL
共计100 mL
四、实验操作
1.样品处理：1 g 组织切碎，加 pH 7.4 Tris-HCl缓 冲液10 mL，匀浆，10,000 g ，4℃，离心10 min，上
离子交换剂结构：以Sephadex-QAE A-50为例
葡聚糖 -N+(CH3)3 –Cl基质 功能基团 平衡离子
电荷基团 反离子
离子交换剂的种类
1 按基质种类不同： 离子交换树脂，离子交换纤维素，离子交换凝胶等
2 按功能基团不同： 强酸型 含磺酸基团 (R-SO3H)， 中等酸型 含磷酸基团 (-O-PO2H4) 弱酸型 含酚基、羧基 强碱型 含季胺基团 [-N+(CH3)3]，弱碱型 含叔胺、伯胺基团[-N(CH3)2] 3 按平衡离子的性质不同：
ABC
D
E
A280
5 10 15 20 25 30 35 40 50
洗脱体积
4.聚丙烯酰胺凝胶电泳鉴定：活性电泳 只做分离胶，胶倒好直接插上试样梳，进行聚合
编号 1 2 3 4 5
总体积
溶液名称 30% Acr –0.8% Bis pH 8.9 Tris -HCl TEMED 10% AP H2O
三、实验试剂
1、20 mM Tris-HCl，pH 7.4缓冲液； 2、A液: 20 mM Tris-HCl，pH 6.3缓冲液 3、B液: A液含60 mM NaCl 4、C液: A液含100 mM NaCl 5、D液: A液含150 mM NaCl 6、E液: A液含240 mM NaCl 7、QAE-Sephadex A-50准备：取1克QAE-Sephadex A-50于烧杯中加入100 mL A
生化实验课件 实验四、聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清ldh
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3．缓冲溶液：
① pH值：溶液的pH值决定带电颗粒的解离程度， 亦即决定Q。
② 离子强度：一般最适的离子强度在0.02～0.2 之间，溶液的离子强度越高，则电泳速度越慢。
③ 溶液粘度：迁移率与溶液粘度呈反比关系。
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4．电场强度（E）：
电场强度是电泳支持物上每厘米的电位降， 也称电势梯度。
E↑，v ↑
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【聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）】
聚丙烯酰胺凝胶的性能 聚丙烯酰胺凝胶的制备 聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理
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一、聚丙烯酰胺凝胶的性能
特性： ➢ 机械强度好，有弹性，透明，相对化学稳定，
对pH和温度变化较稳定，没有吸附和电渗作用。 ➢ 调节单体的浓度和交联度可以控制孔径大小。 聚丙烯酰胺凝胶电泳技术，能分离、小量制备
体浓度。
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【凝胶总浓度及交联度对凝胶的影响】
凝胶溶液中单体和交联剂的总浓度和两者的比例是决定聚丙烯酰胺凝胶特性包 括其机械性能、弹性、透明度、粘着度及孔径大小的主要因素。
T为凝胶总浓度，C为交联度。
T ab100% m
C b 100% ab
a为丙烯酰胺单体的质量(g)，b为交联剂的质量(g)，m为溶液的终体积(mL)。
凝胶a、b的比例决定了凝胶的物理性状。当a:b小于10时，凝胶脆且硬，
不透明，呈乳白色；当a:b大于100时，即使用5%的丙烯酰胺凝胶也呈
糊状；通常用a:b在30左右，并且丙烯酰胺浓度高于3%，凝胶富有弹
性并且透明。
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三、聚丙烯酰胺凝胶电泳的原理
乳酸脱氢酶同工酶电泳结果
乳酸脱氢酶同工酶电泳结果
【原创实用版】
目录
1.乳酸脱氢酶同工酶电泳简介
2.乳酸脱氢酶同工酶检测方法
3.乳酸脱氢酶同工酶结果分析
4.乳酸脱氢酶同工酶的作用
5.结论
正文
一、乳酸脱氢酶同工酶电泳简介
乳酸脱氢酶同工酶电泳（ldhisol）是一种分离和检测乳酸脱氢酶同
工酶的方法，它可将人组织中乳酸脱氢酶分离出 5 种同工酶区带。
乳酸
脱氢酶同工酶的检测方法包括电泳法、离子交换柱层析法、免疫法、抑制法和酶切法等，但迄今最好的和用得最多的是电泳法。
二、乳酸脱氢酶同工酶检测方法
1.电泳法：乳酸脱氢酶同工酶电泳采用聚丙烯酰胺凝胶电泳法，可以将乳酸脱氢酶同工酶分离成五个区带。
2.离子交换柱层析法：离子交换柱层析法可以对乳酸脱氢酶同工酶进行分离和测定。
3.免疫法：免疫法可以通过检测乳酸脱氢酶同工酶的抗原来进行测定。
4.抑制法：抑制法可以通过检测乳酸脱氢酶同工酶的活性来确定其存在。
5.酶切法：酶切法可以通过检测乳酸脱氢酶同工酶的降解产物来确定其存在。
三、乳酸脱氢酶同工酶结果分析
乳酸脱氢酶同工酶结果分析主要用于诊断疾病，如急性肾皮质坏死、各种血管内外溶血症、骨骼肌炎症、损伤及退化、肝损伤、癌等。
四、乳酸脱氢酶同工酶的作用
乳酸脱氢酶同工酶在生物体内参与乳酸的代谢过程，对维持细胞内外酸碱平衡具有重要作用。
此外，乳酸脱氢酶同工酶的变化还可以作为诊断某些疾病的参考指标。
五、结论
乳酸脱氢酶同工酶电泳是一种有效的检测方法，可以用于诊断多种疾病。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分析过氧化物酶同工酶
实验五 聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶一、目的同工酶是指能催化同一种化学反应， 但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组 酶。
它们是 DNA 编码的遗传信息表达的结果。
最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生 长发、代谢调节及抗性等都有一定的关系。
因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的 意义。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高，重现性强，测定结果便于 观察、记录和保存。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生 长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。
因此，测定这种酶 的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶 的生物化学反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验，主要要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装置、凝胶配制等问题，熟悉所有 的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。
二、原理1．电泳现象带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。
由于带电胶粒或分子中各种成份，所具有的电荷和分子量不同，在电场中将以不同的速 度移动，因而在电泳进行过程中，不同的成份将按照各自的迁移速度得到有效的分离。
2．影响电泳的主要因素若将带净电荷 q 的粒子放入电场，则该粒子所受到的引力 F 引可用数学式表示如下：F 引 =E × q (1)式中 E 为电场强度，单位为“伏特／厘米” ，表示电场中单位距离上的电位差。
如果这种情况发生在真空中，则带电粒子会朝着电极加速前进并且最后与电极相撞。
但 在溶液中，由于电场的牵引力 F 引与加速运动的粒子和溶液之间产生的阻力（即摩擦力）F 阻 相对抗，故上述现象不会发生。
根本 Stokes 公式，阻力的大小取决于粒子的大小和形状以 及所在介质的粘度：F 阻 = 6pghn(2) 式中 F 阻是球形粒子所受的阻力，g 是球形粒子的半径，h 是溶液的粘度，n 是粒子移动的速度。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶
6、电泳
将电泳槽架放入电泳槽内，倒入其余的电极缓冲液至正极槽(外槽)，按正负极位置放 上电泳槽盖，盖紧，并按正负极连接上电泳仪。用稳压挡将电压调至80V，待样品蓝带 全部进胶后，调高电压至150V，继续电泳，当指示剂溴酚蓝的蓝带泳动至胶底部并出胶 后半小时到40分钟，关闭电源，停止电泳，前后共约2.5-3小时。
CH2=CH
N, N’-甲叉 双丙烯酰胺
化学聚合的凝胶孔径较小，常用于制备分离胶，重复性好。聚合反应受各种因素 的影响：
催化剂和加速剂的浓度 应选择合适的和浓度使聚合时间控制在30—60内较好，过量 的催化剂和加速剂会引起烧胶和蛋白质条带的畸变。
只能以游离碱的形式发挥作用，在酸性条件下，叔胺缺少自由碱基，引发产生自 由基的过程会被延迟，聚合时间延长。
聚丙烯酰胺凝胶电泳 分离乳酸脱氢酶同工
酶
样品的消化（为下周实验做准备）
• 每2组取3支消化管，按下表操作
•
编号
1 （空白） 2（样品） 3（标准）
• 试剂处理
• 样品液
—
1
—
• 标准磷原液
—
—
1
• 去离子水
1
—
—
• 524
2
2
2
•
•
加小漏斗，300℃加热沸腾10分钟，250℃左右继续
•
消化3～4小时至溶液透明，冷却，待用。
蛋白质为例，根据已学生化知识，蛋白质在小于或大于其等电点的时，可带不同的净电荷， 所以也有电泳现象。不同蛋白质质点带电性质、带电量多少、质点大小、形状都不同，决定 了各自在电场中移动速率和距离不相同，因而互相之间得以分离。
实验三十二聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶（活性染色鉴定
实验三十二聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶（活性染色鉴定法）目的要求(1)复习有关同工酶的知识．(2)掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳分离乳酸脱氢酶同工酶、底物染色技术及有关原理.实验原理1959年Markert等用电泳的方法将牛心肌提纯的LDH结晶分离出5条区带，靠近阳极一端的称LDH₁,，靠近阴极一端的称为LDH₅，；其余3种，由阳极到阴极依次命名为LDH₂，LDH₃及LDH₄。
它们均具有LDH催化活性，从而首先提出了同工酶(1soenzyme)的概念．目前：已知LDH同工酶是由H亚基及M亚基按不同比例组成的四聚体，它们是H₄(LDH₁)，H₃M(LDH₂)，H₂M₂(LDH₃)，HM₃(LDH₄)及M₄(LDH₅)5种，这些LDH同工酶广泛分布于动物的各种组织以及微生物和植物中．心肌中以LDH₁，含量高，骨骼肌及肝中LDH₅含量高。
图是正常人血清、心肌和肝组织提取液的LDH同工酶图1.2.8 电泳模式图。
LDH同工酶底物染色显色反应如下：反应式中PMS为甲硫吩嗪(phenazine methosulfate)，NBT为氯化硝基四氮唑蓝(nitrroblue tetrazolium chloride)的缩写，它们都是接受电子的染料。
LDH与底物染色液在37℃温浴中脱下的氢最后传递给NBT生成蓝紫色的NBTH2称为甲 ，此物不溶于水，有利于显色后区带的保存，但可溶于氯仿及95%乙醇（9：1）的混合液。
因此，电泳后的显色区带可通过浸泡法浸出，于560nm比色，也可用光吸收扫描仪扫描得出LDH同工酶间相对百分含量。
目前，LDH及其同工酶检测已广泛用于临床，作为某些疾病鉴别诊断的依据，常用醋酸纤维素薄膜电泳，琼脂糖电泳及聚丙烯酰胺电泳分离LDH及其同工酶，这3种不同支持物电泳及染色原理完全相同，但灵敏度不同。
因而正常值不完全相同。
本实验用连续PAGE 法分离LDH及其同工酶。
试剂与器材（一）材料人（动物）未溶血新鲜血清，动物组织提取液[组织重量与组织匀浆缓冲液体积比为1：5或1：10（g/ml）]。
实验六：聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶实验报告
班级：植物142 姓名：刘国强学号：1401080229实验六：聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工一、研究背景及目的同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
它们是DNA 编码的遗传信息表达的结果。
研究表明，同工酶与生物的遗传、生长发、代谢调节及抗性等都有一定的关系。
因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。
因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼叶叶片和根部的过氧化物酶同工酶，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验，主要要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装置、凝胶配制等问题，熟悉所有的操作过程二、实验原理本实验采用不连续聚丙烯酰胺凝胶系统，分离小麦幼叶叶片和根部的过氧化物酶同工酶。
利用过氧化物酶在分解过氧化氢的过程中产生自由氧基，从而将联大茴香胺连接到过氧化物酶分子上，使之呈现棕褐色，将电泳后的凝胶置于含有过氧化氢的联大茴香胺染色液中浸泡，有过氧化酶同工酶蛋白的部位便可以观察到褐色的谱带。
通过这些谱带的数量、位置等获得相关信息。
三、仪器试剂1．实验材料小麦幼苗2．仪器:垂直板电泳槽(型号：DYY-III28A型电泳槽厂家：北京市六一仪器厂) 电泳仪（型号：DYY-III2稳压稳流电泳仪厂家：北京市六一仪器厂）主要器具：移液器、微量进样器、培养皿一套（直径15cm）、小烧杯3.试剂（1）分离胶缓冲液(pH8.9 Tris-HCl缓冲液)：称取48 mL 1mol/L HCl，Tris36.8g，用无离子水溶解后定容至100 mL。
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶实验报告
班级：植物092 姓名：徐炜佳学号：0901080223聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶研究背景及目的带电颗粒在电场作用下向着与其电性相反的电极移动，称为电泳(electrophoresis，简称EP )。
1937年瑞典科学家Tiselius建立了“移界电泳法(moving boundary EP)”，成功地将血清蛋白质分成清蛋白、α1、α2、β和γ球蛋白5个主要成分，由于他的突出贡献，1948年荣获诺贝尔奖金。
50年代，许多科学家着手改进电泳仪，寻找合适的电泳支持介质，先后找到滤纸、醋酸纤维素薄膜、淀粉及琼脂作为支持物。
60年代，Davis等科学家利用聚丙烯酰胺凝胶作为电泳支持物，在此基础上发展了SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、等电聚焦电泳、双向电泳和印迹转移电泳等技术。
这些技术具有设备简单，操作方便，分辨率高等优点。
目前，电泳技术已成为生物化学与分子生物学以及与其密切相关的医学、农、林、牧、鱼、制药、某些工业分析中必不可少的手段。
同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
它们是DNA 编码的遗传信息表达的结果。
最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生长发、代谢调节及抗性等都有一定的关系。
因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高，重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。
过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断发生变化。
因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一时期植物体内代谢的变化。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生物化学反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验，主要要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装置、凝胶配制等问题，熟悉所有的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。
华南农业大学-LDH同工酶圆盘聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 乳酸脱氢酶（lactate dehydrogenase 简称 LDH， EC.1.1.1.27）是催化丙酮酸和乳酸可逆转化的 酶。 • 1959年 Markert 等用电泳的方法将牛心肌提纯 的LDH结晶分离出5条区带，靠近阳极一端的称 LDHl ，靠近阴极一端的称为LDH5；其余3种，由 阳极到阴极依次命名为LDH2 ，LDH3及LDH4。它 们均具有LDH 催化活性，从而首先提出了同工酶 (isoenzyme)的概念。 • 目前已知LDH同工酶是由亚基及M亚基按不同比例 组成的四聚体，它们是H4（LDHl），H3M （LDH2），H2M2（LDH3），HM3（LDH4）及M4 （LDH5）5种。心肌中以LDHl含量高，骨骼肌及 肝中LDH5 含量高。
12
7.2
7.2
30
3
15
72
• （2）把配好的染色液倒入试管中，脱出的凝胶 放入盛有染色液的试管中,避光置37℃水浴中保 温10～20min，待LDH 同工酶呈现蓝紫色区带,回 收染色液。 • （3）用蒸馏水洗3次除去染色液，加入水浸泡， 凝胶底色脱净，背景清晰，把凝胶柱放在灌满水 的试管中，对光观察过乳酸脱氢酶同工酶谱，并 画电泳图或拍照。 • （也可将凝胶板放在保存液中浸泡）
(三)、试剂
1 制备样品有关试剂（老师配） （1）0.01mo1／L pH 6.5磷酸盐缓冲液（PBS）， 用于组织匀浆缓冲液及LDH的染色液 Na2HPO4· 12H2O 0.2256g ，NaH2PO4· H2O 0.2137g，加水定容到200mL。 （2）40%蔗糖溶液 20g蔗糖用水溶解定容至50mL。 （3）0.5％溴酚兰 10mL
乳酸脱氢酶同工酶的分离
LDH
CH3-CHOH-COOH+NAD+
CH3-CO-COOH+NADH+H+
2.同工酶 能催化同一化学反应，但其酶蛋白的分子组成不同
的一组酶
例如：LDH就是由2种亚基L和M以不同比例组成的四 聚体，即H4、H3M、H2M2、HM3、M4共5种同工酶。
二、实验内容
用聚丙烯酰胺电泳法分离LDH的同工酶，用活性染色法呈现同 工酶的区带。
七、思考与讨论
1.LDH活性染色法能否用于定量测定，能否用于比色 法测定其他生化反应？
此法可以用于溶液的比色定量测定，也可用于其 他生化的氧化还原反应。但由于NBTH2不溶于水，在 琥珀酸脱氢酶测定中，可使PMSH2与溶于水的2，6-二 氯酚定酚相偶联而进行比色测定。
2.同工酶能否用SDS-聚丙烯酰胺电泳分离？为什么？
SDS是解离剂，而许多同工酶是由2种亚基以不同 比例组成的全酶，被解离后进行电泳，获得的是亚基 的条带，无法显示同工酶的条带，故不能用此法分离。
谢谢！
单体：丙烯酰胺(Acr)
交联剂：N,N’- 甲叉双丙烯酰胺(Bis)
聚合反应 AP-TEMED催化体系：
过硫酸铵 (AP)
催化剂
四甲基乙二胺 (TEMED)
加速剂
结构
三维网状结构的凝胶
三、实验原理
4、蛋白质、核酸在常规聚丙烯酰胺凝胶电泳中的分离原理
净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对天然状态生物大 分子进行的电泳，目的是为了保持蛋白质的天然构象、 其亚基之间的相互作用及其生物学活性。利用蛋白质 分子中所带净电荷、分子质量、形状的差异，在电场 中泳动的速度和方向不同，从而达到分离的目的。多 数蛋白质的pI在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱 性缓冲系统中进行电泳，蛋白质分子带负电荷，以不 同速度向阳极迁移，称为阳极电泳；对于一些碱性蛋 白，使用酸性缓冲系统进行电泳，蛋白质分子带正电 荷而向阴极迁移，称为阴极电泳。
6-聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶
聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳分析过氧化物酶同工酶植物098 原硕0901080808摘要：本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生化反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验，主要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装臵、凝胶配臵等问题，熟悉所有的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。
关键字：聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳，同工酶一、研究背景及目的：同工酶是指能催化同一种化学反应，但其酶蛋白本身的分子结构组成却有所不同的一组酶。
它们是DNA编码的遗传信息表达的结果。
最近的研究表明，同工酶与生物的遗传、生长发育、代谢调节及抗性等有一定关系。
因此，测定同工酶在理论上和实践上都有重要的意义。
用聚丙烯酰胺凝胶电泳测定同工酶，方法简便、灵敏度高、重现性强，测定结果便于观察、记录和保存。
过氧化物是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶。
它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有关系。
在植物生长发育过程中它的活性不断变化。
因此，测定这种酶的活性或其同工酶的变化情况，可以反映某一种时期植物体内代谢的变化。
本实验采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术，分离小麦幼苗过氧化物酶同工酶，根据酶的生化反映，通过染色方法显示出酶的不同区带，以鉴定小麦幼苗过氧化物酶同工酶。
通过本实验，主要掌握电泳技术的原理、方法、设计、装臵、凝胶配臵等问题，熟悉所有的操作过程，另外，对同工酶有一个感性的认识。
二、研究依据及原理：聚丙烯酰胺凝胶是由单体丙烯酰胺(acrylamide，简称Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(N，N—methylene-bisacylamide，简称Bis)在加速剂N，N，N ，N —四甲基乙二胺(N，N，N ，N —tetramethyl ethylenedia mine，简称TEMED)和催化剂过硫酸铵(ammonium persulfate (NH4)2S2O8，简称AP)或核黄素(ribofavin即vita min B2，C17H20O6N4)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(polyacrylamide gel electrophoresis，简称PAGE)。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离过氧化物同工酶temp
电荷因素 蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 分子大小 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同 分子形状 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同
聚丙烯酰胺凝胶电泳的三种效应: 1) 浓缩效应、2) 电荷效应、3) 分子筛效应
电泳过程示意图
A为电泳前3层凝胶排列顺。B显示电泳开始后，蛋白质样品夹在快、慢 离子之间被浓缩成极窄的区带。C显示蛋白质样品分离成数个区带。
TEMED 丙烯酰胺 + 甲叉双丙烯酰胺------------------聚丙烯酰胺凝胶 Ap (三维网状结构)
AP-TMTED催化体系
TEMED催化AP生成硫酸自由基：
S2O82－
¯ 2SO4·
硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：
Bis将单体长链间连成网状结构：
通过改变凝 胶浓度及交 联度来调节 凝胶的孔径， 具有良好的 分子筛效应。
二、实验原理
聚丙烯酰胺凝胶 垂直板电泳 不连续系统 分离因素
1、聚丙烯酰胺凝胶 作为电泳的支持物
•聚丙烯酰胺凝胶 是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂甲叉 双丙烯酰胺(Bis)在催化剂过硫酸铵(AP)和加速剂 N,N,N’,N’-四甲基乙二胺(TEMED)作用下聚合交联而成 的三维网状结构的凝胶。
3、样品的制备
过氧化物酶的提取：称 取1g水稻种子置于冰浴 上的研钵内，加入1ml样 品提取液(内含 pH6.8 、 0.05mol/L Tris－HCl， 20%蔗糖)研成匀浆后， 再加2ml提取液研磨均匀， 转入离心管，于3500rpm 离心15min，其上清液即 为酶的提取液，供电泳 分析用。
6、剥胶、染色
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH同工酶.
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离血清LDH同工酶【目的要求】1.掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理。
2.熟悉聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳分离蛋白质的操作技术。
【实验内容】乳酸脱氢酶目前发现有五种同工酶，分别是LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5，根据五种同工酶分子结构以及理化性质的不同，pI各不相同，在同一pH条件下带电荷多少不同，在电场中移动速度不同，可用电泳法将其分离。
采用聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳可将新鲜血清中的乳酸脱氢酶同工酶进行分离，然后用由乳酸、NAD+、PMS、NBT组成的染色液染色，显示清楚的五条色带，即五种乳酸脱氢酶同工酶，从阳极到阴极分别是LDH1、LDH2、LDH3、LDH4、LDH5。
最后将分离的乳酸脱氢酶凝胶柱用波层层析扫描仪在560nm波长处扫描，测出光密度，计算出各种LDH同工酶的百分含量。
【实验材料】1．仪器与材料真空泵、圆盘电泳槽、电泳仪、刻度吸管、微量加样器、长头注射器、烧杯等。
2．试剂30％丙烯酰胺贮存液、催化剂1％过硫酸铵、1％TEMED缓冲液、电泳槽缓冲液、蔗糖、乳酸钠、辅酶I、PMS、NBT、7.5%醋酸溶液3．样品血清【基本步骤】1. 准备玻璃管：准备5×60mm玻璃管若干支，洗净烤干，管下端套一密塞的橡皮套或瓶塞，垂直插入管架上。
2. 配制凝胶：TEMED缓冲液 1.5ml30%Acr-Bis溶液 4ml蒸馏水6ml混匀真空抽气5分钟0.14%过硫酸铵6ml轻轻摇匀准备装管3. 装管：用细长滴管或长头注射器吸取凝胶装入玻璃管中，高度距离管上口8mm为宜，检查管内无气泡后，向胶面缓缓注入蒸馏水约4mm高度，在自然光下聚合约40分钟，见水与胶之间有明显界面出现，为胶已聚合。
用滤纸条吸取凝胶上方水层，取下管底部的橡皮套管，将凝胶管垂直插入电泳槽圆孔中并尽量使各管高度一致。
4. 加样：用微量加样器每管加血清—蔗糖稀释液100ul，（血清1份，40%蔗糖6份，溴酚兰少许混合而成）。
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳法
sds聚丙烯酰胺凝胶电泳法
SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法（SDS-PAGE）是一种常用的蛋白质分离技术。
它是利用SDS（十二烷基硫酸钠）将蛋白质分子的电荷中和，使其按照分子量大小进行分离的一种凝胶电泳方法。
在SDS-PAGE实验中，首先需要将待测蛋白质样品加入SDS样品缓冲液中，然后将其煮沸，使其完全变性。
SDS样品缓冲液含有SDS，可以将蛋白质中的三级结构全部破坏，并且SDS还可以将蛋白质分子的电荷中和，使其带有同样的负电荷。
接下来，将样品加入聚丙烯酰胺凝胶中，让蛋白质分子在电场作用下向电极移动，根据分子量大小在凝胶中进行分离。
最后，可以通过染色或Western blot等方法检测分离出的蛋白质。
SDS-PAGE方法具有分离效率高、准确度高、操作简单等优点，被广泛应用于生物化学、分子生物学、生物工程等领域的蛋白质分离和纯化。
乳酸脱氢酶凝胶电泳
乳酸脱氢酶凝胶电泳乳酸脱氢酶凝胶电泳是一种常用的生化分离和定量分析技术。
它通过将样品中的乳酸脱氢酶进行电泳分离，并通过染色方法进行定量分析，从而确定样品中乳酸脱氢酶的含量和活性。
本文将从乳酸脱氢酶的作用机制、凝胶电泳原理和实验步骤等方面进行详细介绍。
乳酸脱氢酶是一种重要的酶类，广泛存在于生物体内。
它在糖酵解过程中起着关键作用，能够催化乳酸的氧化还原反应。
乳酸脱氢酶的活性与多种疾病的发生密切相关，因此准确测定乳酸脱氢酶的含量和活性对于临床诊断和疾病监测具有重要意义。
乳酸脱氢酶凝胶电泳是一种基于电泳原理的分析方法。
其基本原理是利用电场将样品中的乳酸脱氢酶分离，根据电泳迁移速度的差异来确定酶的分子量和电荷性质。
在凝胶电泳中，常用的凝胶有聚丙烯酰胺凝胶和琼脂糖凝胶。
这些凝胶具有不同的孔隙结构和电泳性质，可以根据需要选择合适的凝胶。
乳酸脱氢酶凝胶电泳的实验步骤包括样品制备、电泳条件设定、电泳分离和染色定量等。
首先，需要从样品中提取乳酸脱氢酶，并进行纯化和浓缩。
然后，将样品加入凝胶孔道中，进行电泳分离。
电泳过程中，乳酸脱氢酶会根据其分子量和电荷性质在凝胶中迁移，从而实现分离。
最后，通过染色方法对凝胶进行染色，并使用图像分析软件进行定量分析。
乳酸脱氢酶凝胶电泳具有许多优点。
首先，这种方法操作简单，成本低廉。
其次，凝胶电泳可以同时分离多个样品，提高实验效率。
此外，凝胶电泳还可以用于研究乳酸脱氢酶的异构体和同功酶，深入了解酶的结构和功能。
然而，凝胶电泳也存在一些局限性，如分辨率较低、分离时间较长等。
乳酸脱氢酶凝胶电泳是一种常用的生化分离和定量分析技术，具有重要的临床意义。
通过对其原理和实验步骤的了解，我们可以更好地应用该技术进行乳酸脱氢酶的测定和分析。
未来，随着科技的不断发展，乳酸脱氢酶凝胶电泳技术将进一步完善和广泛应用，为疾病的早期诊断和治疗提供更多帮助。
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净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳
分离蛋白质的原理
净电荷聚丙烯酰胺凝胶电泳是对天然状态生物大分子 进行的电泳，目的是为了保持蛋白质的天然构象、其亚 基之间的相互作用及其生物学活性。利用蛋白质分子中 所带净电荷、分子质量、形状的差异，在电场中泳动的 速度和方向不同，从而达到分离的目的。多数蛋白质的 pI在中性偏酸性范围，通常是将样品在碱性缓冲系统中 进行电泳，蛋白质分子带负电荷，以不同速度向阳极迁 移，称为阳极电泳；对于一些碱性蛋白，使用酸性缓冲 系统进行电泳，蛋白质分子带正电荷而向阴极迁移，称 为阴极电泳。
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实验原理
▪ （一）聚丙烯酰胺凝胶电泳 ▪ 聚丙烯酰胺凝胶:
是由单体丙烯酰胺(Acr)和交联剂N,N-甲叉双丙烯酰胺(Bis) 在催化剂N，N，N，N—四甲基乙二胺(TEMED)和过硫 酸铵(AP)的作用下聚合交联成三维网状结构的凝胶，以此 凝胶为支持物的电泳称为聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)。
▪ AP提供自由基，TEMED是催化剂，催化自由基引起的聚合 反应进行。
玻璃管上端的2cm处，加水封胶 ➢ 在室温中聚合5-10分钟 注意：制胶时避免产生气泡
准备电泳：
将凝胶玻璃管安装在电泳槽本体上 将凝胶玻璃
管从橡胶管上取下，去水，垂直插到电泳槽本体上， 旋紧。
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加样 取电极缓冲液加入上、下缓冲液
槽中，注意上槽液要高过电极，凝胶柱与下 液槽的缝隙处无气泡。凝胶柱上端灌满缓冲 液，用微量进样器吸取一定体积的样品溶液， 小心地将样品加在凝胶柱上端。
(Bis)
自由基
交联
LOGO
（聚丙烯酰胺）
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聚丙烯酰胺凝胶有下列特性：
1.凝胶透明，有弹性，机械性能好； 2.化学性能稳定，与被分离物不起化学反应； 3.对pH和温度变化较稳定,几乎无吸附和电渗
作用； 4.样品用量少，灵敏度可达10-6g; 5.凝胶孔径可调节； 6.分辨率高。
聚丙烯酰胺凝胶电泳分离 乳酸脱氢酶同工酶
实验目的：
1. 掌握聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理 2. 掌握聚丙烯酰胺凝胶分离乳酸脱氢酶的操作技术 3. 掌握乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色
重点难点：
1. 聚丙烯酰胺凝胶电泳的基本原理 2. 连续体系和不连续体系
实验原理
▪ 聚丙烯酰胺凝胶电泳 ▪ 连续系统和不连续系统 ▪ 乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色
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电泳： 加样后，盖上电泳槽安全盖，接通电源，
注意正负电极的连接，将电泳仪调至恒压220 V， 直到溴酚蓝前沿到达距凝胶下端约0.5 cm时（60 min），关闭电源，停止电泳。
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活性染色： 电泳结束后，将凝胶柱取下，用注射器辅助剥胶，
使凝胶掉入装有活性染色液的培养皿中。轻轻摇动培 养皿，使凝胶完全浸泡在染色液（在电泳结束前10分 钟配置，用前再加PMS，混匀置于37℃备用）中，放 入37℃恒温水浴中保温，染色过程注意避光，待大多 数条带显现蓝紫色时除去染色液，显色时间一般为 10~20 min。加入脱色液终止酶促反应，摇动3~5 min， 凝胶底色脱去直至背景清亮，数码相机照相。
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不连续系统 是指使用不同孔径的凝胶和不同缓 冲体系的电泳方式，在电泳分离过程中，由于浓缩胶 的堆积作用，可使样品在浓缩胶和分离胶的界面上先 浓缩成一窄带，对样品进行浓缩，然后在一定浓度或 浓度梯度的凝胶上进行分离，既存在电荷效应，也有 分子筛效应。虽然制胶操作难度较大，但是它具有连 续系统不可比拟的优越性，分辨率高。
实验步骤
胶的制备
待分离样品的准备
加样
电泳
（电压220，60 min）
染色
电泳结束后，分离凝胶，放在大培养皿内，加入染色液，染色10-20min
胶的制备
➢准备玻璃管，标记
PH 8.9 缓冲液 丙烯酰胺储存液 双蒸水
过硫酸铵(AP)
0.9 ml 0.9 ml 2.7 ml 0.25 ml
➢ 最后加TEMED 1滴 ➢ 置小烧杯中,混匀,用长滴管迅速注入到玻管,凝胶加至距
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乳酸脱氢酶同工酶活性染色
用活性染色对LDH进行鉴定，将凝胶浸泡在活性染色 液中，LDH与底物的反应，用甲硫吩嗪(PMS)作为电子的 中间载体，氯化硝基四氮唑蓝(NBT)作为最终电子受体， 底物脱下的氢最后传递给NBT，NBT被还原后，产生蓝紫 色的不溶于水的物质以对LDH定位。反应式如下：
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凝胶的总质量浓度T和交联度C决定凝胶的有效 孔径。凝胶的三维网状结构具有分子筛效应，不同 大小和形状的大分子通过孔径时所受的阻滞力不同， 加上大分子的电荷效应，使各种大分子迁移率不同 得以分离。
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实验原理
（二）连续系统和不连续系统
连续系统 是指电泳系统采用相同孔径的凝胶、 缓冲系统等条件下进行区带电泳，是利用蛋白质分子 的电荷效应和分子筛效应进行分离，一般只用于分离 一些比较简单的样品，缺点是分辨率不高。优点是制 胶简单快捷，缓冲系统的pH恒定，可以防止样品进胶 后因pH变化发生凝聚和沉淀，缓冲系统组成简单。
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蛋白质在净电荷聚丙烯酰胺凝胶 电泳中的分离因素
电荷因素 分子大小 分子形状
▪ 电荷因素 蛋白质分子形状和大小相同，所带电荷性质和数量不同 ▪ 分子大小 蛋白质分子形状和所带电荷性质和数量相同，分子大小不同 ▪ 分子形状 蛋白质分子所带电荷性质和数量相同，分子形状不同
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实验原理
（三）乳酸脱氢酶同工酶及酶活性染色
AP-TMTED催化体系
▪ TEMED催化AP生成硫酸自由基：
S2O82－
2SO4·¯
▪ 硫酸自由基的氧原子激活Acr单体并形成单体长链：
▪ Bis将单体长链间连成网状结构：
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实验NH2 CH2
(Acr)
+ CH2 = CH—C—NH—CH2—NH—C—CH =
聚合反应
1959年Markert等用电泳的方法将纯化的心肌乳酸脱氢酶(LDH) 分离出5条区带，由阳极到阴极依次命名为LDH1、LDH2、LDH3、 LDH4、LDH5，它们均具有LDH催化活性，从而首先提出了同工酶 的概念。目前已知LDH同工酶是由H和M亚基按不同比例组成的四 聚体。
LDH同工酶广泛存在于动植物及微生物中，动物各组织中LDH 同工酶各组分含量不同。临床上对LDH及同工酶的检测可作为某些 疾病诊断的依据之一。