高效液相色谱的特点与仪器
高效液相色谱原理及应用
高效液相色谱原理及特点高效液相色谱法是在经典色谱法的基础上，引用了气相色谱的理论，在技术上，流动相改为高压输送（最高输送压力可达4.9′107Pa）；色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）；同时柱后连有高灵敏度的检测器，可对流出物进行连续检测。
一、高效液相色谱仪有哪些特点？1．高压：液相色谱法以液体为流动相（称为载液），液体流经色谱柱，受到阻力较大，为了迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。
一般可达150～350 ×105Pa。
2．高速：流动相在柱内的流速较经典色谱快得多，一般可达1～10ml/min。
高效液相色谱法所需的分析时间较之经典液相色谱法少得多，一般少于1h 。
3．高效：近年来研究出许多新型固定相，使分离效率大大提高。
4．高灵敏度：高效液相色谱已广泛采用高灵敏度的检测器，进一步提高了分析的灵敏度。
如荧光检测器灵敏度可达10-11g。
另外，用样量小，一般几个微升。
5．适应范围宽：气相色谱法与高效液相色谱法的比较：气相色谱法虽具有分离能力好，灵敏度高，分析速度快，操作方便等优点，但是受技术条件的限制，沸点太高的物质或热稳定性差的物质都难于应用气相色谱法进行分析。
而高效液相色谱法只要求试样能制成溶液，而技术平台〉〉〉高效液相色谱仪原理不需要汽化，因此不受试样挥发性的限制。
对于高沸点、热稳定性差、相对分子量大（大于400 以上）的有机物（这些物质几乎占有机物总数的75% ～80%）原则上都可应用高效液相色谱法来进行分离、分析。
据统计，在已知化合物中，能用气相色谱分析的约占20%，而能用液相色谱分析的约占70%～80%。
二、高效液相色谱法可分为哪几种主要类型？各自的分离原理是什么？高效液相色谱按其固定相的性质可分为高效凝胶色谱、疏水性高效液相色谱、反相高效液相色谱、高效离子交换液相色谱、高效亲和液相色谱以及高效聚焦液相色谱等类型。
高效液相色谱法
2．高效液相色谱法与气相色谱法的比较
（l）气相色谱法：分析对象仅占有机物总数的20％。 高效液相色谱法：分离和分析占有机物总数近80％的那些 高沸点、热稳定性差、离子型化合物及摩尔质量大的物质。
（2）气相色谱：流动相与组分不产生相互作用力，仅起运 载作用。 高效液相色谱法：流动相对组分可产生一定亲和力，并参与 固定相对组分作用的剧烈竞争，流动相对分离起很大作用， 相当于增加了一个控制和改进分离条件的参数；
高压输液泵应符合下列要求：密封性好，输出 流量恒定，压力平稳，可调范围宽，便于迅速 更换溶剂及耐腐蚀。
高压输液泵
常用的输液泵分为恒流泵和恒压泵两种。 恒流泵特点是在一定操作条件下，输出流量保持恒定而与色谱 柱引起阻力变化无关； 恒压泵是指能保持输出压力恒定，但其流量则随色谱系统阻力 而变化，故保留时间的重视性差。 目前主要使用恒流泵，又称机械泵，它又分机械注射泵和机械 往复泵两种，应用最多的是机械往复泵。
（四）检测系统
两种基本类型的检测器： 溶质型检测器：它仅对被分离组分的物理或化学特性有响应， 属于这类检测器的有紫外、荧光、安培检测器等。 总体检测器：它对试样和洗脱液总的物理或化学性质有响应， 属于这类检测器的有示差折光，电导检测器等。 （l）紫外检测器 （2）荧光检测器 （3）示差折光率检测器 （4）电化学检测器
高效液相色谱法
High Performance Liquid Chromatography，HPLC
§1
概 述
Introduction
一、高效液相色谱法概述
高效液相色谱法（HPLC）吸取了气相色谱与经典液相色谱优 点，并用现代化手段加以改进。
引入了气相色谱的理论;
在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器; 具备速度快、效率高、灵敏度高、操作自动化的特点;
北京化工大学仪器分析第三章高效液相色谱精品文档
检测器
用来连续监测经色谱柱分离后的流出物 的组成和含量变化的装置。
紫外-可见检测器 荧光检测器 电化学检测器 蒸发光散射检测器 质谱检测器
紫外-可见检测器
单波长UV检测器，光源用Hg灯，加滤光 片 可 以 到 254 ， 280 ， 313 ， 334 ， 365 等 。 生化中用到很多。
多波长 光度计类似，光栅或棱镜分光
残留农药和兽药是食品中主要的污染物 世界上许多国家制定并实施食品安全法规，但是
在美国、加拿大、欧盟以及日本食品安全法规更 加严格的完善。 在食品和农产品国际贸易中，残留农药和兽药的 检测中非常苛刻的。
食品中残留检测
农产品 - 谷物：大米等 - 豆类：大豆、豌豆等。 - 水果：橘柑，苹果，葡萄等。 - 蔬菜：洋白菜（甘蓝）、菠菜等 - 茶叶，种子，蜂蜜等。
全多孔型担体 薄壳型微珠担体
固定相 --- 化学键合
R --- 极性基团 疏水基团 离子交换基团
Si OO
Si
HCO S l iOC HS l i3 ()2 C RHO SiOSi3 ()2 C RH
O
SiOH
SiOSi3 ()2 C RH
固定相的化学构造
非键合相表面
键合相表面
ODC
C18
C8
C1 Phenyl
样品的分析实例
食品 啤酒，清酒，葡萄酒，酱油等
体液 血清，尿等
医药品 肾的透析液，钙制剂等
发酵 微生物培养液，酸奶等
环境 工厂废水等
有机酸标准品的色谱图1
一个分析柱
1. 磷酸 2. 柠檬酸 3. 丙酮酸 4. 苹果酸 5. 琥珀酸 6. 乳酸 7. 甲酸 8. 乙酸 9. 乙酰丙酸 10. 焦谷氨酸
高效液相色谱法(HPLC)
高效液相色谱法(HPLC) High Performance LiquidChromatography§3-1 高效液相色谱法概述一、定义以高压输出液体为流动相，以小粒径填料填充色谱柱的色谱分析方法。
高效液相色谱法是继气相色谱之后，70年代初期发展起来的一种以液体做流动相的新色谱技术.二、HPLC特点1、高压经典的液相色谱法，流动相在常压下输送，所用的固定相柱效低，分析周期长。
而现代液相色谱法中，流动相改为高压输送（150～350 ⨯105 Pa，最高输送压力可达450⨯105 Pa）;2、高速由于流动相流速高，分析时间大大缩短，几min、十几min可完成一个分析任务。
3、高效HPLC色谱柱是以特殊的方法用小粒径的填料填充而成，从而使柱效大大高于经典液相色谱（每米塔板数可达几万或几十万）。
4、高灵敏度利用高灵敏度的检测器，检测灵敏度大大提高。
紫外检测器10-9g荧光检测器10-11g高效液相色谱三、液相色谱分离原理及分类液相色谱分离的实质是样品分子（以下称溶质）与溶剂（即流动相或洗脱液）以及固定相分子间的作用，作用力的大小，决定色谱过程的保留行为。
根据分离机制不同，液相色谱可分为：液固吸附色谱、液液分配色谱、化学键合相色谱、离子交换色谱以及分子排阻色谱等类型。
四、液相色谱与气相色谱的比较1、相同点（1）基本原理一致：不同组分在两相中的作用力不同。
（2）基本概念一致：基本概念：保留值、塔板数、塔板高度、分离度、选择性等与气相色谱一致。
（3）基本理论一致：塔板理论与速率方程也与气相色谱基本一致。
2、不同点由于在液相色谱中以液体代替气相色谱中的气体作为流动相，而液体和气体的有性质本质不同，因此，两种方法也有不同之处：（1）仪器设备和操作条件不同；（2）应用范围不同；气相色谱仅能分析在操作温度下能气化而不分解的物质。
对高沸点化合物、非挥发性物质、热不稳定化合物、离子型化合物及高聚物的分离、分析较为困难。
仪器分析-高效液相色谱法
流动相的选择与制备
选择合适的流动相
根据被分析化合物的性质， 选择适当的流动相，如有 机溶剂、缓冲液等。
流动相的配制
按照实验要求，准确称量 流动相组分，混合均匀， 并进行过滤和脱气处理。
流动相的梯度洗脱
对于多组分分离，可以采 用梯度洗脱技术，以提高 分离效果。
仪器的开机与平衡
开机
按照仪器说明书，打开仪器电源， 启动仪器操作系统。
药物制剂质量控制
高效液相色谱法可以用于药物制剂的质量控制， 检测制剂中药物的含量、纯度和稳定性等指标。
环境样品分析中的应用
污染物检测
高效液相色谱法可以用 于检测环境中的有机污 染物，如农药、多环芳 烃等，为环境污染控制 和治理提供依据。
饮用水质量检测
通过高效液相色谱法可 以检测饮用水中的有害 物质，如消毒副产物、 微量有机物等，保障公 众的饮用水安全。
粒径
色谱柱的粒径影响分离效 果和分离时间。粒径越小， 分离效果越好，但分离时 间越长。
长度
色谱柱的长度影响分离效 果和载样量。长度越长， 分离效果越好，但载样量 越小。
检测器
类型
常用的检测器有紫外-可见光检测器、荧 光检测器、电导检测器等，根据被测物质 的性质和检测需求选择合适的检测器。
响应速度
线性范围
质。
测定水体、土壤、空气 中的污染物和有害物质。
用于蛋白质、核酸、细 胞等生物大分子的分离
和检测。
高效液相色谱法的优势与局限性
优势
高分离效能、高灵敏度、高选择 性、应用范围广。
局限性
需要专业操作人员、仪器昂贵、 样品前处理复杂、耗时长。
02 高效液相色谱法的仪器构成
CHAPTER
高效液相色谱检测器的种类及特点
一、概述高效液相色谱（HPLC）是一种常用的分析化学技术，广泛应用于化学、生物、医药和食品等领域。
在HPLC技术中，检测器是至关重要的一部分，它负责检测样品中化合物的浓度，并将其转化为可读的信号输出。
本文将对HPLC检测器的种类及特点进行详细介绍。
二、紫外-可见光（UV-Vis）检测器1. 原理：UV-Vis检测器利用化合物中的紫外或可见光吸收特性来检测化合物。
2. 特点：1）广泛适用：UV-Vis检测器适用于大多数有机化合物和许多无机化合物的分析。
2）灵敏度高：对于绝大多数有机化合物，UV-Vis检测器的灵敏度较高。
3）简单易用：UV-Vis检测器的操作相对简单，适合实验室常规分析。
三、荧光检测器1. 原理：荧光检测器利用化合物在受激光照射下产生荧光的特性来检测化合物。
2. 特点：1）高灵敏度：荧光检测器对于有荧光活性的化合物具有极高的灵敏度。
2）特异性强：由于荧光本身具有较高的特异性，荧光检测器可以用于分析中对混杂物的忽略。
3）应用广泛：在生物学、医学和环境领域，荧光检测器得到了广泛的应用。
四、蒸发光散射检测器1. 原理：蒸发光散射检测器通过样品与蒸发后的溶剂之间的差异来检测化合物。
2. 特点：1）通用性强：蒸发光散射检测器对于大多数非吸收性化合物都具有较好的检测能力。
2）无需色谱柱：相比于其他检测器，蒸发光散射检测器可以不需要色谱柱，适用于高分子化合物的检测。
3）灵敏度较低：蒸发光散射检测器的灵敏度通常较低，需要较高浓度的样品才能进行检测。
五、质谱检测器1. 原理：质谱检测器通过将化合物转化为离子，并对离子进行质量分析来检测化合物。
2. 特点：1）高分辨率：质谱检测器具有极高的分辨率，可以准确确定化合物的质荷比。
2）特异性强：质谱检测器对于复杂混合物的成分分析具有很强的特异性。
3）操作复杂：相比于其他检测器，质谱检测器的操作和维护较为复杂，需要专业的操作人员。
六、综述HPLC检测器种类繁多，每种检测器都有其特定的适用场景和优势。
环境仪器分析 第七章 高效液相色谱法
主要区别：固定相差别，输液设备和检测手段
柱内径1~3cm，固定相粒径>100μm 且不均匀 常压输送流动相 柱效低（H↑，n↓） 分析周期长 无法在线检测
1．经典LC：仅做为一种分离手段
2．HPLC：分离和分析
柱内径2~6mm，固定相粒径<10μm（球形，匀浆装柱） 高压输送流动相 柱效高（H↓，n↑） 分析时间大大缩短 可以在线检测
A 2 dp
next
A dp
， dp A H ， n 柱效
图示
续前
3）传质阻抗项及其影响
C C m C sm C s C m C sm （忽略固定相传质阻抗 ）
注：只考虑流动相和静态流动相的传质阻抗 忽略固定相传质阻抗
A dp
B 2 D m 2 D g
B t R ，B D g
T T D g 或D g M df 2 C Cm C s C g Cl Cl Cl Dl
DL T
续前
2. HPLC ： H A C u
B 2 D m
第七章
高效液相色谱法
High Pressure Liquid Chromatography
第一节
概述
高效液相色谱法：以气相色谱为基础，在经典液相 色谱实验和技术基础上建立的一种液相色谱法
一、HPLC与经典LC区别 二、HPLC与GC差别
三、高效液相色谱的特点
四、高效液相色谱的局限性
一、HPLC与经典LC区别
•
•
• • •
液-液分配色谱技术的关键是相体系选择。 可通过调节流动相的极性，来获得良好的柱 效和缩短分析时间。 液-液分配色谱可用于几乎所有类型化台物， 极性的或非极性的、有机物或无机物、大分 于或小分于物质的分离，只要官能团不同、 或者官能团数目不同、或者是分子量不同均 可获得满意的分离。
高效液相色谱分析
（3）试样在流动相中应有适宜的溶解度，防止产生沉 淀并在柱中沉积。
（4）流动相同时还应满足检测器的要求。当使用紫外 检测器时，流动相不应有紫外吸收。
五、 影响分离的因素 1. 影响分离的因素 （1） 影响分离的因素与提高柱效的途径
• 在高效液相色谱中 , 液体的扩散系数仅为气体的万 分之一，则速率方程中的分子扩散项 B/U较小，可以忽 略不计，即： H=A+Cu 故液相色谱H-u曲线与气相色谱的形状不同，如图所 示。
5. 离子色谱 ion chromatography 离子色谱是在20世纪70年代中期发展起来的 一中技术，其与离子交换色谱的区别是其采用了 特制的、具有极低交换容量的离子交换树脂作为 柱填料，并采用淋洗液抑制技术和电导检测器，
是测定混合阴离子的有效方法。
6. 尺寸排斥色谱 size- exclusion chromatography
固定相：早期涂渍固定液，固定液流失，较少采用；
化学键合固定相：（将各种不同基团通过化学反应键 合到硅胶（担体）表面的游离羟基上。
C-18柱（反相柱）。
2. 液-固吸附色谱 liquid-solid adsorption chromatography
固定相：固体吸附剂为，如硅胶、氧化铝等，较常使
用的是5～10μm的硅胶吸附剂；
高压 高速
3 . 流程及主要部件 （1） 流程
（2）主要部件
① 高压输液泵
主要部件之一，压力：150～350×105 Pa。
为了获得高柱效而使用粒度很小的固定相（ <10m），液 体的流动相高速通过时，将产生很高的压力，因此高压、高 速是高效液相色谱的特点之一。 应具有压力平稳、脉冲小、流量稳定可调、耐腐蚀等特性
高效液相色谱法HPLC
VS
报告结果
整理分析数据，撰写分析报告，提供各组 分的浓度、纯度等相关信息，为科研或生 产提供决策依据。
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实验操作步骤
流动相的准备与平衡
根据实验要求配制流动相，通过泵以适宜的流速 通过色谱柱进行平衡。
洗脱与检测
流动相带着样品经过色谱柱洗脱，各个组分依次 流出并进入检测器进行检测。
ABCD
进样
将样品注入进样器，通过压力将样品送入色谱柱 进行分离。
数据处理与结果分析
对检测器输出的信号进行处理，得到各组分的峰 形和峰面积，进行定性和定量分析。
01
02
03
04
进样
将样品注入色谱柱。
分离
在流动相的带动下，样品中的 组分在色谱柱中进行分离。
检测
检测器对分离后的组分进行检 测，并记录信号。
数据处理
对采集到的数据进行处理、分 析和存储。
高效液相色谱仪的维护和保养
定期清洗色谱柱
使用适当的溶剂清洗色谱柱， 以去除残留物和杂质。
维护和检查检测器
定期检查检测器的性能和准确 性，确保其正常运行。
数据处理系统
用于采集、处理、分析和存储色谱数据，通常采用色谱工 作站。
高效液相色谱仪的操作流程
01
02
03
样品准备
将样品进行适当处理，以 便注入色谱柱。
流动相制备
根据实验要求，选择合适 的流动相，并进行过滤和 脱气处理。
系统平衡
在进样之前，确保色谱系 统达到平衡状态，以提高 分离效果。
高效液相色谱仪的操作流程
样品的预处理
分离
对于复杂样品，需要进行分离操 作以去除杂质或提取目标成分。 常用的分离方法包括离心、过滤、
仪器分析第4讲 高效液相色谱法
经典液相色谱法 75-600 0.01-1.0 1-20 50-200 2-50 1-10
高效液相色谱法 3-50（常用5-10）
20-300 0.05-1.0
2-30 104-105 10-6-10-2
2．高效液相色谱法与气相色谱法
（l）气相色谱法分析对象只限于分析气体和 沸点较低的化合物，它们仅占有机物总数 的20％．对于占有机物总数近80％的那些高 沸点、热稳定性差、摩尔质量大的物质， 目前主要采用高效液相色谱法进行分离和 分析．
3. 柱外效应
由于色谱柱之外的因 素引起的色谱峰的展 宽，例如进样系统、 连接管路及检测器的 死体积等。
3-3 高效液相色谱的类型及其分离原理
液—液分配色谱及化学键合相色谱 液—固吸附色谱 离子交换色谱 离子色谱 空间排阻色谱
1、 液-液分配色谱
liquid- liquid partition chromatography
4、 离子色谱
ion chromatography
离子色谱法是由离子交换色谱法派生出来的一种 分离方法。由于离子交换色谱法在无机离子的分 析和应用受到限制。例如，对于那些不能采用紫 外检测器的被测离子，如采用电导检测器，由于 被测离子的电导信号被强电解质流动相的高背景 电导信号掩没而无法检测。
2、 液-固吸附色谱
liquid-solid adsorption chromatography
流动相为液体，固定相为固体吸附剂
分离原理：利用溶质分子占据固定相表面吸附 活性中心能力的差异
分离前提：K不等或k不等
液—固吸附色谱
固体吸附剂主要类型： 极性的硅胶（应用最广） 氧化铝 分子筛 非极性的活性炭
1971年科克兰等人出版了《液相色谱的现代实践》一 书，标志着高效液相色谱法（HPLC）正式建立。
《环境仪器分析》第九章 高效液相色谱法
2019/10/31
东华大学Hale Waihona Puke 相表面存在的某种特异性亲和
力，进行选择性分离。
先在载体表面键合上一种
具有一般反应性能的所谓间隔
臂(环氧、联胺等)，再连接上配
基(酶、抗原等)，这种固载化的
配基将只能和具有亲和力特性
吸附的生物大分子作用而被保
留，没有这种作用的分子不被保留。
2019/10/31
东华大学
六、亲和色谱（Affinitychromatograph）
定相上的吸附作用不同来进行分离。 固 定 相：固体吸附剂如硅胶、氧化铝、活性炭、聚酰胺、硅
-镁吸附剂等，较常使用的是5～10μ m的硅胶吸附剂。 在高效液相色谱法中，表面多孔型或全多孔型都可作吸附色谱
中的固定相，它们具有填料均匀、粒度小、孔穴浅等优点，能极 大提高柱效。
但表面多孔型由于试样容量较小，目前最广泛使用的还是全多 孔型微粒填料。
• 选择溶剂还必须与检测器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、 甲苯、氯仿、二甲基酰胺和水等。
• 分离对象：以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品， 以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。
2019/10/31
东华大学
六、亲和色谱（Affinity chromatograph）
原理：利用生物大分子和固定
（2）气相色谱采用流动相是惰性气体，它对组分没有亲和力， 即不产生作用力，仅起到载气作用。而HPLC流动相可选用不 同极性的液体，对组分产生作用力，流动相对分离起很大作用。
仪器分析高效液相色谱法
仪器分析高效液相色谱法高效液相色谱法（High Performance Liquid Chromatography，简称HPLC）是目前广泛应用于仪器分析领域的一种重要分析方法。
它通过利用柱子中流动的流动相和样品的物理化学性质的相互作用，使样品组分在柱子中发生分离，再通过检测器对各组分进行定量或定性分析。
仪器分析高效液相色谱法主要由流动相供给系统、进样器、柱子、检测器和数据处理系统等组成。
流动相供给系统通过恒压或恒流的方式将流动相送入进样器中，进样器将样品注入柱子中，柱子根据物理化学性质的差异，使不同组分发生分离，之后检测器检测进入检测器的各组分的浓度，并通过数据处理系统对数据进行分析和整理。
高效液相色谱法具有分离效率高、分离时间短、适用范围广等特点。
与传统的液相色谱法相比，高效液相色谱法的流动相的流速更高，柱子填充物颗粒更小，从而大大提高了分离效率。
同时，高效液相色谱法对样品的需求量较小，具有较好的分析灵敏度。
因此，高效液相色谱法被广泛应用于生物、环境、食品、药物、化工等领域的组分分析和质量控制。
在生物领域中，高效液相色谱法常用于生物样品中代谢产物和药物的分析。
通过绑定柱子、手性柱子以及使用不同的检测器，可以对复杂的生物样品中的不同组分进行准确的分析和定量测试。
例如，对尿液中的代谢产物进行分析可以帮助人们了解人体健康状态，对药物的残留物进行分析可以保证食品和水的安全等。
在环境领域中，高效液相色谱法常用于水质、大气和土壤等环境样品中有机污染物的分析。
通过连接各种不同相的柱子，可以对复杂的环境样品中的有机污染物进行有效的分离，使用紫外-可见光检测器或质谱检测器可以对分离后的各组分进行检测和定量。
在食品领域中，高效液相色谱法常用于食品中添加剂、农药残留物和食品中的有害物质的分析。
通过选择合适的柱子和检测器，可以对复杂的食品样品进行分离和检测，以保证食品的安全性和质量。
在药物领域中，高效液相色谱法常用于药品中活性成分和杂质的分析。
仪器分析 第7章 高效液相色谱法
由非极性固定相和极性流动相所组成的 液相色谱体系，与正相 HPLC 体系正好相反。 其代表性的固定相是十八烷基键合硅胶 (ODS 柱），代表性的流动相是甲醇和乙腈。 是当今液相色谱的最主要分离模式。
液-液分配色谱固定相的液体往往容易溶解到流 动相中去，所以重现性很差，不大为人们所采用。 后来发展起来的键合固定相以化学键合的方法 将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解 到流动相中去了。
(3)工作温度： 气相色谱一般都在较高温度下进行的，而 高效液相色谱法则经常可在室温条件下工作。
高效液相色谱法主要类型
类 型 液固吸附色谱 主要分离机理 吸附能，氢键 主要分析对象或应用领域 异构体分离、族分离，制备
液液分配色谱 凝胶色谱 离子交换色谱
手性色谱 亲和色谱
疏水分配作用 溶质分子大小 库仑力
由于离子对化合物A-B+具有疏水性，因而 被非极性固定相（有机相）提取。组分离 子的性质不同，它与反离子形成离子对的 能力大小不同以及形成的离子对疏水性质 不同，导致各组分离子在固定相中滞留时 间不同，因而出峰先后不同。
B. 键合相反相离子对色谱法
离子对色谱法类型很多，根据流动相和 固定相的极性可分为反相离子对和正相离子 对色谱法。其中以键合相离子对色谱法最重 要。这种色谱法的固定相采用非极性的疏水 键合相［如十八烷基键合相（ ODS ）等］， 流动相为加有平衡离子（反离子）的极性溶 液（如甲醇—水或乙睛—水）。
抑制柱离子色谱的原理：
以阴离子分析为例：
分析柱反应：
R—Cl + NaOH R—OH + NaCl
抑制柱反应： + NaOH
R—Na + H2O
以阳离子分析为例：
《仪器分析》4-高效液相色谱法
(4) 示差折光检测器： 是一种中等灵敏度(10–6 g/mL)的通用型检测器。
是利用纯流动相和含有待测组分的流动相之间折射率的 差别进行检测的。
可分为三类：反射式；折射式（偏振式）和干涉式。常 用前两种。
优点：灵敏度适宜，操作简便是一种通用型的检测器； 缺点：对温度变化敏感，不能用于梯度洗脱。 应用范围：聚合物、糖。还用于分析以紫外检测和荧光
精选课件
药典中的液相色谱检测器
精选课件
常用的检测器:
(1) 紫外光度检测器：是一种选择性浓度检测器，仅 对那些在紫外波长有吸收的物质有响应。
作用原理：基于待测试样对特定波长的紫外光有选择 性的吸收，试样浓度与吸光度的关系服从比尔定律。
结构：
1－低压汞灯 2－透镜 3－遮光板 4－测量池 5－参比池 6－紫外滤光片 7－双紫外光敏电阻
精选课件
⑶ 色谱柱 GC柱很长，特别是毛细管柱可长至几十米至上百米，柱效
很高(理论塔板数N = 104~106)。HPLC柱较短，一般为15~25 cm，柱效(理论塔板数N = 103~104)，低于GC柱。 ⑷ 检测器
与GC相比，HPLC检测器种类较多。 ⑸ 制备色谱
GC难以制备样品，因为进样量小，难以收集或被破坏。 HPLC可进行制备，即制备色谱。
精选课件
2. 进样系统
在高效液相色谱中，常用的进样方式： 高压阀进样：优点是能用于高压，适于大体积进样，重现性
好；缺点是进样阀进样时需排掉一部分试样，不同的进样 量需用不同的定量管，同时峰的扩展也比注射进样大。 微量注射器进样：也可由微量注射器注入取样环少量样品， 即采用较大体积取样环而进少量试样，进样量由注射器控 制，试样不充满取样环，只填充一部分体积。
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high performance liquid chromatograph
一、高效液相色谱仪
instrument of HPLC
二、高效液相色谱法的 特点
feature of HPLC
第一节 高效液相色谱的 特点与仪器
feature and instrument of HPLC
2016/10/20
2．流动相脱气 流动相在使用前必须进行脱气处理 除去其中溶解气体，防止流动相由柱流至检测器 时，因压力降低而产生气泡，而增加基线噪声。 使用荧光检测器，溶解在流动相中的氧气，会造 成荧光猝灭。 还会导致样品中某些组分被氧化或会使柱中固定 相发生降解而改变柱的分离性能。
合进行定性分析。 可对每个色谱峰的指定位置（峰前沿、顶、尾） 进行光谱比较，以判断色谱峰的纯度及分离情 况。
目前灵敏度不及UVD。
2016/10/20
（3）示差折光检测器（RID） 整体性质检测器，普及程度仅次于UVD。
检测原理：通过连续测定参比流通池中和样品流 通池中溶液折射率的差值方法，来测定试样浓度。 折射率的差值与 组分的浓度成正比
有很灵敏检测器和较灵敏的通用检测器
流动相为气体，无毒、易于处理
没有较灵敏的通用检测器
流动相有毒、费用较高
运行和操作容易 仪器制造难度较小
运行和操作较气相难 仪器制造难度较大
实际应用中，凡是能用GC分析的样品一般不 用LC，因为GC更快，更灵敏，更方便，且耗费 较低 。
2016/10/20
三、流程及主要部件
2016/10/20
常用的脱气方法 吹氦脱气法，在0.1MPa下，以约60mL/min流速 通入流动相10~15min。此法适用于所有的溶剂， 脱气效果较好，但价格较贵。 加热回流法，此法的脱气效果较好 。 抽真空脱气法，用微型真空泵除去溶解气体，降 压至0.05~0.70MPa。 超声波脱气法，流动相置放于超声波清洗器中， 用超声波振荡10~15min。脱气效果最差。 在线真空脱气法，真空脱气装置串接到储液系统 中，使流动相进入输液泵前连续真空脱气。此法 脱气效果最好，适于多元溶剂体系 。
流路中为高压力工作状态； 通常使用耐高压的六通阀进样装置； 特点：耐高压，进样的重现性好，易于自动化， 易造成色谱峰柱前扩宽。
2016/10/20
三、进样装置
装入状态
采样环
进样状态
进色谱柱
泵入溶剂 出口
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四、高效分离柱
柱材：一般采用不锈钢管和 PEEK 塑料。 柱型及尺寸：一般采用管内径1～6 mm，柱长 5～40 cm直型柱，标准柱型φ3.9 或 4.6mm ，L 15、 30cm。 填料粒度：5~10 µ m，柱效5000～10000 ， 3~5 µ m，L 5~10cm。 发展趋势是减小填料粒度和柱径以提高柱效。
2016/10/20
2. 高压泵分类： 恒流泵：输出流量恒定，与柱引起阻力无关。 恒压泵：输出压力恒定，与柱引起阻力无关。 (1) 恒流泵：常用往复式柱塞泵和注射泵。
特点：流量恒定，液腔体积小（0.1ml），更换 溶剂和梯度洗提方便，但有脉动，应用广泛。
2016/10/20
2016/10/20
(2) 恒压泵：常用气动泵
2016/10/20
二、高效液相色谱法的特点
HPLC的优点 1. 分离效能高
GC 分离效能较高，n=103塔板/米，HPLC 可 达到 5×103~3×104 塔板/米，可使用较短的柱子。
2. 选择性高
HPLC 柱效高，流动相可以控制和改善分离的 选择性。
3. 检测灵敏度高
HPLC广泛采用高灵敏度检测器，如UV（10-9 g/mL），荧光检测器（10-11g/mL）。
光源发出紫外光→单色
器1→吸收池（光被吸收， 激发组分）产生荧光→单色 器2→光电倍增管，产生的 荧光强度与组分浓度成正比。
2016/10/20
特点：
1. 灵敏度高，比UVD高102，适用于痕量分析;
2. 有选择性;
3. 线性范围较低，约为103; 4. 可用于梯度洗脱；
5. 操作比较复杂。 应用：
根据压力传导原理设计的，即 P1.SA=P2.SB P1 低压，推动大面积 SA，则在小面积 SB 活塞 输出大压力P2 。
特点：压力恒定，无脉动，液腔体积较大，更 换流动相不方便。当泵的负荷阻力小时可提供大的 输出流量，适于匀桨法填装柱子。
2016/10/20
3．梯度洗脱装置
梯度洗提：在分离过程中按一定的程序连续改 变载液中溶剂的配比和极性。 通过载液极性改变来改变分离因素，改善分离 效果、缩短分析时间、改善峰形，提高分析精度。
2016/10/20
五、液相色谱检测器
理想的HPLC 检测器应具备的特性
灵敏度高；
对所有溶质都有快速响应；
响应对流动相流量和温度变化不敏感；
线性范围宽； 不引起柱外扩散。 至今没有一种检测器完全具备。 常用的检测器 UVD；RID；ECD；FLD。
2016/10/20
⑴ 紫外检测器
溶质性质检测器。 构造：
共轭结构的有机芳环分子，如多环芳烃、维
生素Ｂ、黄曲霉素、许多生化物质和代谢产物、药
物、胺类、氨基酸、甾族化合物，非荧光物质也可
通过荧光试剂反应变成荧光物质后检测。
2016/10/20
高压梯度（内梯度） 两台高压泵，将两种
不同极性溶剂按一定比例
送入梯度混合室，混合后
进入色谱柱。
2016/10/20
2016/10/20
低压梯度（外梯度）:
一台高压泵, 通过比例调节阀,将两种或多种
不同极性的溶剂按一定的比例抽入高压泵中混合。
2016/10/20
2016/10/20
三、进样装置
2016/10/20
（2） 光电二极管阵列检测器（PDAD） 二级管阵列检测器是UV检测器的重要进展，
光电二极管阵列检测器： 1024 个二极管阵列，各
检测特定波长，计算机快速处理。 与普通UVD的区别 进入检测器流通池的不再是单色光；获得的检 测信号不是单一波长上的，而是全部紫外光波长上
的信号。可提供组分的光谱信息，利于定性分析。
高效液相色谱仪的主要部件： 储液罐、高压输液泵、进样装置、色谱柱、检 测器、记录仪和数据处理装置。 工作流程
2016/10/20
一、储液罐及流动相的脱气
1. 储液罐 溶剂在放人储液罐之前必须经过0.45μm滤膜过 滤：除去溶剂中的机械杂质，以防输液管道或进 样阀产生阻塞现象。 储液罐的材料应耐腐蚀 ：常用玻璃、氟塑料或 PEEK塑料 ，容积约为0.5~2.0L。 储液罐放置位置要高于泵体：以保持一定的输液 静压差。 使用过程储液罐应密闭：防溶剂蒸发引起流动相 组成变化，还可防止空气中O2、CO2重新溶于已 脱气的流动相中。
r r样 品 池 r参 比 池 r c
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特点： 1. 通用型检测器，几乎每种物质都有各自的折射率 都可用差示折光检测器检测； 2. 灵敏度低，可以达到10-7g/mL ； 3. 对温度、流量变化敏感； 4. 不能用于梯度洗脱。
2016/10/20
（4）荧光检测器（FLD） 荧光检测器是一种高灵敏度的选择性检测器。 构造及光路 检测原理：
2016/10/20
4.分析速度快
HPLC 载液流速可达1~10ml/min，完成一个样 品分析仅需几分钟到几十分钟。
5.应用范围广
HPLC 法不受样品沸点、挥发度和热稳定性限
制，适于分析生物大分子、离子型化合物、不稳定
的天然物及各种高分子化合物。原则上相对分子量
大于400 的有机物都可用 HPLC 法分析。
2016/10/20
2016/10/20
二、高压输液泵
1. 高压泵性能 • 有足够的输出压力：压力范围250~400kg/cm2。 • 输出流量恒定：流量精密度应在1%，无脉动。 • 流量范围宽：分析仪器应在0.1 ~10.0ml/min。 制备仪器1~100ml/min。 • 抗溶剂的腐蚀：常用不锈钢和PEEK塑料。 • 泵死体积要小；以便迅速更换溶剂和梯度洗提。
2016/10/20
三、流程及主要部件
general process and
main assembly of HPLC
一、液相色谱仪器（ high performance
liquid chromatograph）
2016/10/20
Waters LC 2695
2016/10/20
IC 4500i
2016/10/20
特点：灵敏度高 (10-9g/mL ），线性范围宽，易
于操作，对流动相的流速和温度变化不敏感，适
用于梯度洗脱。
应用：HPLC中使用最为广泛。
检测原理： 基于被测组分对紫外光的选择性吸收，其吸光 度与试样中组分浓度成正比，
即 A ∝ C。
2016/10/20
① 无组分进入时，测量池和参比池只通过流动相， 光电管接受的辐射强度相等，无信号输出。 ② 组分进入时，其吸收一定紫外光，光电管接受 到辐射强度不等，有信号输出。
2016/10/20
HPLC的局限性
分析成本高，宜引起污染。
缺少高灵敏度的通用型检测器。
不能替代GC完成沸程范围宽的石油产品的分
析。
操作较GC复杂。
2016/10/20
HPLC与GC比较
气相色谱 只能分析挥发性物质 不能用于热不稳定物质的分析 毛细管色谱可得到很高的柱效 高效液相色谱 几乎可分析各种物质 可用于热不稳定物质的分析 色谱柱不能很长、柱效不会 很高