小鼠E1A激活基因阻遏子RNA干扰表达载体的构建

中国组织工程研究与临床康复 第 12 卷 第 37 期 2008–09–09 出版Journal of Clinical Rehabilitative Tissue Engineering Research September 9, 2008 Vol.12, No.37基础医学小鼠E1A激活基因阻遏子RNA干扰表达载体的构建*★郭 鹏,闫承慧,郭 亮,康 建,韩雅玲Constructing RNA interference vector carrying cellular repressor of E1A-stimulated genes in miceGuo Peng, Yan Cheng-hui, Guo Liang, Kang Jian, Han Ya-ling AbstractBACKGROUND: Proliferation of vascular smooth muscle is the major mechanism of atherosclerosis and in-stent restenosis. Cellular repressor of E1A-stimulated genes (CREG) can inhibit the proliferation of vascular smooth muscle, and become the new therapy target in cardiovascular field. OBJECTIVE: To construct the small molecular CREG RNA eukaryotic expression vector, and down-regulate CREG expression in mice cells. DESIGN, TIME AND SETTING: The observation experiment was performed at Cardiovascular Research Institute, General Hospital of Shenyang Military Area Command from April to October, 2007. MATERIALS: Mice fibroblast (NIH3T3) was provided by Professor Shaohua Li from Department of Pathology and Laboratory Medicine, Robert Wood Johnson Medical School, New Jersey, USA. METHODS: Four pairs of short hairpin RNA which could be linked with CREG were designed by on-line RNAi Design. Chemical synthesis method was used to synthesize and clone short hairpin RNA to the pEN_mH1c vector. After LR were recombined with pDS_hpEY, pDS_shCREGs vectors with 4 types of different impressions shCREG fragments were obtained. LipofectamineTM 2000 was used to transfect pDS_shCREGs into NIH3T3 cells and select stably transfected cell clones using G418. MAIN OUTCOME MEASURES: Silencing efficiency of CREG was examined by reverse transcription-polymerase chain reaction and protein immunoblotting, respectively. RESULTS: Restriction enzyme analysis and DNA sequencing results confirmed that sequence of inserted fragment in 4 types of recombinant pDS_shCREG vector was correct. Reverse transcription-polymerase chain reaction and protein immunoblotting proved that the CREG level in stably transfected cells was declined to different extents, and the RNA and protein expression of clone cells were decreased 87% and 70% respectively in stably transfected pDS_shCREG1. CONCLUSION: Eukaryotic expression vector of CREG gene was successfully constructed, and expression level of CREG protein in NIH3T3 cells decreased significantly in vitro. Guo P, Yan CH, Guo L, Kang J, Han YL. Constructing RNA interference vector carrying cellular repressor of E1A-stimulated genes in mice.Zhongguo Zuzhi Gongcheng Yanjiu yu Linchuang Kangfu 2008;12(37):7277-7281(China) [/zglckf/ejournal/upfiles/08-37/37k-7277(ps).pdf]Department of Cardiology, Cardiovascular Research Institute, General Hospital of Shenyang Military Area Command of Chinease PLA, Shenyang 110016, Liaoning Province, China Guo Peng★, Master, Department of Cardiology, Cardiovascular Research Institute, General Hospital of Shenyang Military Area Command of Chinease PLA, Shenyang 110016, Liaoning Province, China ravende@ Correspondence to: Han Ya-ling, Professor, Chief physician, Department of Cardiology, Cardiovascular Research Institute, General Hospital of Shenyang Military Area Command of Chinease PLA, Shenyang 110016, Liaoning Province, China hanyaling@ Supported by: the National Natural Science Foundation of China, No. 30570644* Received: 2008-01-05 Accepted: 2008-08-19摘要背景:血管平滑肌的增殖是动脉粥样硬化及支架内再狭窄发生的重要机制,小鼠 E1A 激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)可以抑制血管平滑肌的增殖,成为心血管领域新的治疗靶点. 目的:构建小鼠 CREG 小分子 RNA 干扰真核表达载体,下调小鼠细胞中 CREG 基因的表达. 设计,时间及地点:观察性实验,于 2007-04/10 在解放军沈阳军区总医院心血管研究所完成. 材料:小鼠成纤维母细胞系(NIH3T3)由美国新泽西州 Robert Wood Johnson 医学院病理实验科李少华教授馈赠. 方法:应用 RNA 干扰在线设计工具设计 4 对可与小鼠 CREG 基因 cDNA 结合的短发夹 RNA.通过化学合成法合成并克隆 至 pEN_mH1c 载体中,与目的载体 pDS_hpEY 进行 LR 重组得到 4 种表达不同 shCREG 片段的表达载体 pDS_shCREGs.应 用 LipofectamineTM 2000 将 pDS_shCREGs 转染至小鼠 NIH3T3 细胞,G418 筛选获得稳定转染的细胞克隆. 主要观察指标:应用反转录-聚合酶链反应和蛋白免疫印迹分别检测 CREG 的沉默效率. 结果:经酶切和 DNA 测序证实,4 种重组 pDS_shCREG 载体中插入片段的序列正确.反转录-聚合酶链反应和蛋白免疫印 迹证实,4 种稳定转染细胞中的 CREG 表达水平均有不同程度的下降,稳定转染 pDS_shCREG1 的细胞克隆中 CREG 基因 mRNA 和蛋白表达分别降低了 87%和 70%. 结论:成功构建小鼠 CREG 基因真核干扰表达载体,使体外培养 NIH3T3 细胞中 CREG 蛋白表达明显降低. 关键词:mCREG(小鼠 CREG);RNA 干扰;LR 重组;组织构建 郭鹏,闫承慧,郭亮,康建,韩雅玲. 小鼠 E1A 激活基因阻遏子 RNA 干扰表达载体的构建[J].中国组织工程研究与临床康 复,2008,12(37):7277-7281[/zglckf/ejournal/upfiles/08-37/37k-7277(ps).pdf]ISSN 1673-8225 CN 21-1539/RCODEN: ZLKHAH7277 解 放 军 沈阳 军 区 总医院心内科, 全 军心血管研究所, 辽宁省沈阳市 110016 郭 鹏★,男, 1982 年生,辽宁 省 辽 阳 市人 , 汉 族,2008 年辽宁 医 学 院 毕业 , 硕 士, 主要从事冠心 病 介 入 诊断 与 治 疗的研究. ravende@ 通 讯 作 者: 韩 雅 玲,教授,主任医 师, 解放军沈阳军 区总医院心内科, 全 军 心 血管 研 究 所, 辽宁省沈阳市 110016 hanyaling@263. net 国 家 自 然科 学 基 金 资 助 项 目 (30570644)*中图分类号:R318 文献标识码:B 文章编号:1673-8225 (2008)37-07277-04 收稿日期:2008-01-05 修回日期:2008-08-19 (08-50-1-110/WLZ)郭鹏,等. 小鼠 E1A 激活基因阻遏子 RNA 干扰表达载体的构建>>本 文 导 读 <<课 题 背 景 :课题受国家自然科学基金(30570664)资助.鉴于小鼠 E1A 激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated gene, CREG) 参与血管平滑肌细胞表型的 调控但具体机制尚不清楚的现状,实验尝试构建小鼠 CREG 基因干扰载体,验证 CREG 表达载体沉默效率,旨 在为进一步深入探讨 CREG 影响胚胎血管新生作用,及 CREG 影响细胞增殖分化的机制研究提供实验方法.同 行 评 价 : 实验在构建及鉴定小鼠 E1A 激活 基因阻遏子 RNA 干扰表 达载体和研究 CREG 的 生物学功能方面提供了 有效方法, 具有一定的创 新性.偏 倚 或 不 足 : 由于实验器材的局限性, 仅用反转录聚合酶链反应与蛋白免疫 印迹双半定量评定沉默效 率, 而未采用实时定量聚合 酶链反应, 因此在沉默效率 的评定上会出现偏差.时间及地点:实验于2007-04/10在解放军 0 引言 RNA干扰(RNA interference,RNAi)是生物 体抑制特异基因表达的一种现象.它是指当细 胞 中 导 入 与 内 源 性 mRNA编 码 区 同 源 的 双 链 RNA(double stranded RNA,dsRNA)时,该 mRNA发 生 降 解 而 导 致 基 因 表 达 沉 默 . 依 据 RNAi现象建立的RNAi技术 (即人工设计并合成 针对某特定基因序列的dsRNA用以抑制或关闭 该基因的表达) 已被越来越广泛地用于基因功 , 能研究中[1-4]. E1A激活基因阻遏子(Cellular repressor of E1A-stimulated genes,CREG)是1998年Gill利 用酵母双杂交技术从Hela细胞文库中克隆的一 个新基因,其具有高度的种属同源性.Gill等的 最初研究发现,作为一种细胞内转录因子, CREG可以对抗腺病毒E1A蛋白引起的基因转 录 [5-6].进一步的研究证实,CREG是一种分泌 型糖蛋白,它在成熟分化的组织细胞中广泛表 达,在低分化组织或细胞中如鼠胚胎干细胞, 人胚胎瘤细胞中则低表达, 提示CREG表达与细 胞分化状态密切相关[7-10]. 本室研究发现,去血清能够诱导体外培养 的人血管平滑肌细胞从合成表型逆转为分化表 型,同时CREG蛋白表达明显增加[11-13].随后, 反转录病毒介导的CREG过表达可以诱导体外 培养的大鼠血管平滑肌细胞由合成表型向分化 表型逆转, 证实CREG参与血管平滑肌细胞表型 的调控[14-18]沈阳军区总医院心血管研究所完成. 材料:小鼠成纤维母细胞系(NIH3T3)由 美国新泽西州Robert Wood Johnson医学院病理 实验科李少华教授馈赠.主要试剂及仪器 来源日本 Olympus 公司 荧光显微镜 PCR 扩增仪 iCycler, 凝胶成像仪,美国 Bio-Rad 公司 凝胶图像分析 Geldoc2000, 电泳仪 PAC2000,转膜装置 紫外分光光度仪 6131,核酸蛋白 德国 Eppendorf 公司 测定 BioPhotomete 美国 UVP 公司 紫外透照仪 TFM-20 哈尔滨东联电子技术 全温振荡培养箱 HZQ-F160 开发有限公司 台式离心机 Biofuge Pico,台式 德国 Heraeus 公司 冷冻离心机:Biofuge Strators 纯水器 Milli-Q biocel,PVDF 膜 美国 Millipore 公司 美国柯达公司 X 光底片 R&D 公司 抗 CREG 单克隆抗体 Invitrogen 公司 LipofectamineTM 2000 与 Gateway LR ClonaseTM Ⅱ Enzyme Mix 试剂盒 北京中杉金桥生物公司 辣根过氧化物酶标记的二抗 蛋白质印迹化学发光试剂(ECL, Amersham 公司 RPN2106) TaKaRa 公司 RNA PCR Kit(DR019A) , DNA 测序 Promega 公司 DNA 回收试剂盒,质粒提取 试剂盒 上海生物工程公司 引物及寡核苷酸片段合成 国产分析纯 其他生化试剂实验过程:小 鼠 CREG 基 因 RNAi 序 列 的 设 计 : 在PubMed上获取小鼠CREG基因的cDNA序列 (GenBank No.NM_11804).应用dharmacon公 司提供的RNAi在线设计工具RNAi Design(网 址:/),设计了4 对 与 小 鼠 CREG基 因 cDNA序 列 结 合 的 短 发 卡RNA(short hairpin RNA,shRNA).序列两 端分别引入BamHⅠ,XhoⅠ酶切位点.选取 无意义的NotⅠ酶切位点识别序列为阴性对 照.具体序列见表1.送上海生物工程公司合 成.P.O. Box 1200, Shenyang 110004 kf23385083@,但具体的调控机制尚不清楚.因此,本实验应用RNAi技术构建能特异性沉默小 鼠CREG基因的干扰载体, 旨在为进一步深入探 讨CREG生物学功能提供有效方法. 1 材料和方法 设计:观察性实验.7278郭鹏,等. 小鼠 E1A 激活基因阻遏子 RNA 干扰表达载体的构建表 1 mCREG-shRNA 及 Linker 序列 Table 1 Mouse CREG-shRNA and Lingker sequencesShRNA shRNA1 Sense strand 5'-gat ccc cCA AGA CAG AAG AGG ACT ATt tca aga gaA TAG TCC TCT TCT GTC TTG ttt ttc-3' 5'-gat ccc cTC GCG GAC ATC ATC TCA ATt tca aga gaA TTG AGA TGA TGT CCG CGA ttt ttc-3' 5'-gat ccc cCT GGC CAC TAT CTC CAC AAT Att caa gag aTA TTG TGG AGA TAG TGG CCA Gtt ttt c-3' 5'-gat ccc cGA ATG AAT CCT TCA GTC GAG Gtt caa gag aCC TCG ACT GAA GGA TTC ATT Ctt ttt c-3' 5'-TCG AGG CGG CCG CG-3' Non-template strand 5'-tcg aga aaa aCA AGA CAG AAG AGG Atc tct tga aAT AGT CCT CTT CTG TCT TGg gg-3' 5'-tcg aga aaa aTC GCG GAC ATC ATC TCA ATt ctc ttg aaA TTG AGA TGA TGT CCG CGA ggg-3' 5'-tcg aga aaa aCT GGC CAC TAT CTC CAC AAT Atc tct tga aTA TTG TGG AGA TAG TGG CCA Ggg g-3' 5'-tcg aga aaa aGA ATG AAT CCT TCA GTC GAG Gtc tct tga aCC TCG ACT GAA GGA TTC ATT Cgg g-3' 5'-GAT CCG CGG CCG CC-3'表 2 CREG 及 GAPDH 的引物序列 Table 2 CREG and GAPDH primer sequencePrimer CREG Upper primer Downstream primer 5'-CCA TCG ATG GCC AAC CCT TCA AGT GTG C-3' 5'-GTT GTC ATG GAT GAC CTT GGC C-3' Amplified Fragment (bp) 752shRNA25'-CCA AGC TTG CGT CAT GGC TGC CCG TGC T-3' GAPDH 5'-TCT TCA CCA CCA TGG AGA AGG-3'750shRNA3蛋白免疫印迹检测:按照文献[4]的方法,进行SDS-shRNA4聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE),湿法转移到PVDF膜 上,抗体结合及ECL试剂盒显色.一抗分别为抗小鼠 CREG和抗β-actin. 主要观察指标:反转录-聚合酶链反应和蛋白免疫 印迹分别检测CREG的沉默效率. 设计,实施,评估者:实验设计,干预实施为第一 作者,评估为第二作者,经过正规的培训,未采用盲法 评估. 统计学分析: 由第一作者采用SPSS 11.5软件完成统 计处理,计量资料以x ±s表示,多组均数间比较采用 one-way ANOVA分析,两两比较用LSD检验,P < 0.05 为差异有显著性意义. 2 2.1 结果 重组表达载体的鉴定酶切鉴定:重组的入门载体行 BamHⅠ和 BglⅡ双酶_Linker入门载体的构建: 将4对正反义链寡核苷酸分别退火形成双链DNA,经BamHⅠ和XhoⅠ酶切位点克隆至 pEN_mH1c载体中,转化DH5α感受态细胞,获得阳性 转化菌落,扩增并行酶切鉴定.酶切鉴定正确的载体命 名为pEN_shCREG1,2,3,4及pEN_Linker.表 达 载 体 的 构 建 : 按 Invitrogen 公 司 Gateway LRClonaseTM Ⅱ Enzyme MixTM 试 剂 盒 的 方 法 , 将 pEN_shCREGs 及 pEN_Linker 与 目 的 载 体 pDS_hpEY 进 行LR重组. 反应产物转化至DH5α感受态细胞中, ℃ 37 培养16~24 h,挑取克隆,扩增并酶切鉴定.得到的4 种正向重组载体分别命名为pDS_shCREG1,2,3,4 及pDS_Linker.细胞培养,转染及阳性克隆的筛选: 细胞培养条件为含体积分数为 0.1 新生牛血清的 DMEM 培养基, 37 ℃,体积分数为 0.05 的 CO2 环境恒温培养.当 NIH3T3 细胞生长达到 50%~60%融合时, 更换无血清 的 RPMI 1640 培养基,应用 LipofectamineTM 2000 脂 质体转染试剂,分别将 pDS_shCREGs 和 pDS_Linker 转染 NIH3T3 细胞,37 ℃ 24 h,更换培养基继续培 养 72 h,400 mg/L G418 筛选,对挑取筛选得到的抗 性克隆行扩增培养.以 pDS_Linker 转染细胞和野生 型 NIH3T3 细胞为对照组进行下述实验.反转录-聚合酶链反应: Trizol 一步法提取细胞总切鉴定,重组质粒为 3 000 bp 和 1 100 bp 片段,空载体 的酶切片段为 3 000 bp 和 1 500 bp,电泳结果与预期片 段大小一致,见图 1.M 1 2 3 4 5 62 000 bp 1 000 bp 750 bp 500 bp 250 bp3 000 bp 1 500 bp 1 100 bpRNA,用琼脂糖电泳检测完整性,紫外分光光度计检 测浓度.分别取 2 μg 总 RNA 样品行反转录合成 cDNA 第一链并进行反 转录-聚合酶链反应扩增. 20 μL 反应体系包括 cDNA 2 μL;0.4 μmol/L 上,下游引物各 1 μL,10×PCR buffer 2 μL,Ex Taq 1 μL,ddH2O 13 μL. 扩增条件:95 ℃ 变性 5 min;95 ℃ 变性 30 s,63 ℃ 退火 30 s, 72 ℃ 延伸 30 s, 个循环后, ℃ 延伸 10 min. 30 72 产物经 0.8% 琼脂糖凝胶电泳检测.扩增基因的引物序列见表 2.M: DL2000Marker; 1: pEN_mH1c; 2: pEN_Linker; 3: pEN_shCREG1; 4: pEN_shCREG2; 5: pEN_shCREG3; 6: pEN_shCREG4Figure 1Identification of recombination entry vector by dual restriction enzyme digestion 图 1 重组入门载体 BamHⅠ,BglⅡ双酶切鉴定图入门载体与 pDS_hpEY 进行 LR 重组后的质粒以 BamHⅠ单酶切鉴定,正确重组质粒为 3 000 bp 和 1 500 bp 2 个条带,而未重组的 pDS_hpEY 空载体酶 切片段为 3 000 bp,2 000 bp 和 750 bp 3 个条带,见 图 2.7279ISSN 1673-8225 CN 21-1539/RCODEN: ZLKHAH郭鹏,等. 小鼠 E1A 激活基因阻遏子 RNA 干扰表达载体的构建M 1 234 5 62.23 000 bp 2 000 bp 1 500 bp 750 bp表达载体沉默效率的鉴定反转录-聚合酶链反应测定 CREG mRNA 的表达: 反转录-聚合酶链反应结果证实,野生型 NIH3T3 细胞及转 染阴性对照 pDS_Linker 后均有较强的 CREG 表达. 而 pDS-shCREG1,2,3,4 转染组的 CREG mRNA 表达水 平分别降低了 87%,52%,33%和 11%. 电 泳 图 谱 结 合 电 泳 条 带 的 密 度 扫 描 显 示 , 与 pDS_Linker 及野生型 NIH3T3 细胞相比, pDS-shCREG1 转染组中 CREG mRNA 表达水平有显著性差异(P < 0.05),见图 4.2 000 bp 1 000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bpM: DL2000Marker; 1: pEN_mH1c; 2: pEN_Linker; 3: pEN_shCREG1; 4: pEN_shCREG2; 5: pEN_shCREG3; 6: pEN_shCREG4Figure 2 Identification of recombination expression vector by single enzyme digestion 图 2 重组表达载体 BamHⅠ单酶切鉴定图1 2 3 4 5 6 7DNA序列鉴定: 经酶切鉴定正确的单克隆, 送大连宝生物公司测序,测序所得序列与设计序列完全相同,见图3.2 000 bp 1 000 bp 750 bp 500 bp 250 bp 100 bp 2 000 bp 1 000 bp 750 bp 500 bpCREGGAPDHa: shCREG1250 bp 100 bp M: DL2000 Marker; 1: NIH3T3; 2: pDS_Linker; 3: pDS_shCREG1; 4: pDS_shCREG2; 5: pDS_shCREG3; 6: pDS_shCREG4Figure 4The evaluation of CREG-mRNA by RT-PCR in cell clones 图 4 反转录-聚合酶链反应检测稳定转染细胞克隆 CREG mRNA 表达b: shCREG2蛋白免疫印迹检测 CREG 蛋白的表达: 蛋 白 免 疫 印 迹 结 果 显 示 , 与 pDS_Linker 转 染 组 和 野 生 型 NIH3T3 相比,pDS-shCREG1,2,3,4 转染组细胞中 CREG 蛋白表达分别下降了 70%,47%,25%和 12%. ECL 胶片 条带 的密度 扫描 显 示,与 pDS_Linker 及野生 型c: shCREG3NIH3T3 细胞相比,pDS-shCREG1 转染组中 CREG 蛋白表达有 显著性差异 (P < 0.05),见图 5.123456CREG d: shCREG4β-actine: Linker1: NIH3T3; 2: pDS_Linker; 3: pDS_shCREG1; 4: pDS_shCREG2; 5: pDS_shCREG3; 6: pDS_shCREG4Figure 3 DNA sequencing results of recombination entry vector shRNA 图 3 重组表达载体 shRNA 片段 DNA 测序结果Figure 5 Evaluation of CREG-mRNA by Western blotting in cell clones 图 5 蛋白免疫印迹检测稳定转染细胞中 CREG 蛋白表达7280P.O. Box 1200, Shenyang110004kf23385083@郭鹏,等. 小鼠 E1A 激活基因阻遏子 RNA 干扰表达载体的构建中CREG基因的表达.这不仅为深入研究在体或/离体血 3 讨论 近年研究发现,血管平滑肌细胞的表型转化及其异 常增殖与动脉粥样硬化,支架内再狭窄等心血管疾病的 发生密切相关.大鼠颈动脉球囊损伤实验证实,血管损 伤后CREG基因在mRNA水平的变化与血管平滑肌细胞 增殖程度呈负相关,即在分化成熟的血管平滑肌细胞中 CREG呈高表达,在去分化增殖表型的血管平滑肌细胞 中则明显低表达或不表达 [14-17] .在此基础上进行的 CREG基因转染人胸廓内动脉血管平滑肌细胞的实验研 究显示,CREG基因的外源性表达使体外培养的血管平 滑肌细胞增生明显受到抑制.以上研究均提示CREG参 与维持血管平滑肌细胞的分化,抑制其增殖,但具体的 作用机制仍不明确.为更深入的研究CREG基因的生物 学功能,实验应用Gateway技术的LR反应成功构建了 CREG-RNAi表达载体,显著下调了CREG基因在小鼠 NIH3T3细胞中的表达,为其生物学功能研究提供了一 个有效的实验方法. Gateway克隆技术是Invitrogen公司根据λ噬菌体溶 菌周期和溶源周期位点重组特性, 开发的一套用于DNA 体外重组的技术.它是目前用于功能基因分析和蛋白质 表达研究的先进且高效的操作系统[19-20].这个多功能操 作系统使目标DNA通过位点特异的重组实现在所需载 体之间的转移.LR和BP 2个反应构成了Gateway操作系 统.LR反应是入门克隆和目的载体之间的重组反应,通 过重组来实现目的序列转移,从而使携有目的片段的表 达载体获得目的载体的特性;BP反应为其逆反应,可以 使得目的序列在不同的载体之间转移.实验将小鼠 CREG的shRNA插入pEN_mH1c中,随后行LR重组,成 功的构建了CREG-RNAi表达载体,使其获得目的载体 中携带的黄色荧光基团,G418抗性及小鼠U6启动子. 这一表达载体的建立,可使CREG基因的有效shRNA片 段通过BP反应亚克隆到病毒或其他质粒载体中, 实现同 一片段在不同载体中的跳跃,从而解决了不同组织细胞 对不同载体存在着转染,筛选效率明显差异等一系列问 题,为CREG基因的生物学研究开辟了新的途径. 实验分别应用反转录-聚合酶链反应和蛋白免疫印 迹鉴定了CREG基因的沉默效率.结果证实,与空白对 照组和阴性对照组相比, pDS_shCREG1表达载体转染细 胞中CREG的mRNA和蛋白表达均明显下降(> 70 %) , 提示设计的shRNA片段可以有效沉默小鼠NIH3T3细胞2019 18 16 17 14 15 13 12 6 7 8 9 10 11 1 2 3 4 5 Dave RS. RNAi and tumor angiogenesis:bridging the gap towards anti-cancer therapy? Leuk Res 2007;31(4):421-432 Grimm D,Kay MA. Therapeutic application of RNAi:is mRNA targeting finally ready for prime time? J Clin Invest 2007;117(12): 3633-3641 Mei L,Li XJ. The application of siRNA in therapeutics. 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