2第三章微生物的代谢调节和代谢工程++

酶可逆共价修饰的意义：
1） 因酶构型的转换是由酶催化的，故可在很短的时间内 经信号启动，触发生成大量有活性的酶； 2）这种修饰作用可更易控制酶的活性以响应代谢环境的 变化。
这一系统具有能随时响应的特性，因而经常在活化与 钝化状态之间来回变换。
需消耗能量，但只占细胞整个能量消耗的一小部分
2、变构控制
转 录
阻遏蛋白
转录
cAMP-CAP 复合物
cAMP
磷酸二酯酶
葡萄糖 分解
诱导物
腺苷酰 环化酶
乳糖操纵子(lac operon) ——分解代谢阻遏
无乳糖
关
无葡萄糖 有乳糖 开 有乳糖
开 ？
三、分支生物合成途径的调节
1、同工酶（isoenzyme）调节
某一分支途径中的第一步反应可由多种酶催化，但这些酶 受不同的终产物的反馈调节. (酶的分子结构不同)
调节蛋白）相结合，以此来决定结构基因的转录能否进行 结构基因为一组功能相关的基因 只有当存在诱导物时其转录水平才最高,
并随之转译出诱导酶 只有当缺乏辅阻遏物时其转录频率才最高， 负责基质分解 （inducible operon） 即只有通过去阻遏作用才能启动所编码酶的 合成 如 乳糖操纵子 阻遏型操纵子 诱导型操纵子
E
5、顺序反馈调节 (sequential feedback regulation)
分支途径中几个末端产物抑制分支点后面第一个酶，使分 支点产物积累，结果分支点产物又反馈抑制共同途径中的第一 个酶，最后使整个代谢途径停止。
6、联合激活或抑制调节
由一种生物合成的中间产物参与两个完全独立的、不交叉 的合成途径的控制。这种中间体物质浓度的变化会影响这两 个独立代谢途径的代谢速率。
如：大肠杆菌的天门冬氨酸族氨基酸的合成途径中，有 三个同工酶：天门冬氨酸激酶Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ，分别受赖氨 酸、苏氨酸和甲硫氨酸的反馈调节
2、协同反馈调节(concerted feedback regulation)
需有一种以上终产物的过量存在方有明显的效果
单个终产物过量，不产生或只产生很小的影响
E D A B C F G
1、降低末端产物浓度 1）营养缺陷型的利用
营养缺陷型是指原菌株因基因突变致使合成途径中断，丧 失了合成某种必须物质的能力，而必须在培养基中加入相应物 质才能正常生长的突变菌株。 营养缺陷型突变株的代谢流受阻，末端产物减少，解除了末 端产物参与的反馈调节，可使代谢途径中的某一中间产物积累。
利用营养缺陷型积累
根据产物性质分为：末端产物阻遏和分解代谢产物阻遏
末端产物阻遏 (end-product repression) 指由某代谢途径末端产物过量积累而引起的阻遏。
如：甲硫氨酸的生物合成
在大肠杆菌培养基中含有甲硫氨酸，则检测不到同型丝氨酸转移酶、 胱硫醚合成酶和同型半胱氨酸甲基化酶，而不含有甲硫氨酸，则可以检 测到这些酶的活性，表明这些酶均受甲硫氨酸的阻遏。
2、酶合成的阻遏(repression)
末端产物阻遏 (end-product repression) 分解代谢物阻遏 (catabolite repression)
特点：细胞内产物积累到一定程度产生的反馈调节作用 1）反馈抑制该产物合成途径中前面某种酶的活性，属于酶活性调节
2）反馈阻遏某些酶的继续合成，属于酶合成调节
直链代谢途径中间代谢产物
反馈抑制
Ea
Eb
Ec缺陷 Ec
Ed
A
B
C C
D
E
反馈阻遏
若要积累C，首先要获得缺失酶c 的营养缺陷型。
酶c缺失后，物质C便不再转变成物质D，不再合成物质E。
由于这种突变体已不能合成末端产物E，所以就解除了E对 酶a和酶b的反馈调节。
但是，完全不能合成产物E的突变体，因为不能利用E去 进一步合成必须的细胞物质，所以无法正常生长。为了保 证突变体的正常生长，培养时须提供低浓度的、不足以引 起反馈调节的物质E。这样高浓度的中间产物C就能积累起 来了。 例如：
酶的诱导可分两种：
1）同时诱导
当诱导物加入后，同时或几乎同时诱导几种酶的合成；主 要存在于短的代谢途径中。
如将乳糖加入到E.coli培养基后，可同时诱导出-半乳糖苷 透性酶、 -半乳糖苷酶、半乳糖苷转乙酰基酶；不管诱导 强度如何，这三种蛋白以同一比例合成。 （因为三者的基因组成同一操纵子） 2）顺序诱导 先合成能分解底物的酶，再依次合成分解各中间代谢物的 酶，以达到对较复杂代谢途径的分段调节。
◆ 天冬氨酸半醛生成高丝氨酸的途径受阻之后，苏氨酸的生 成减少。 ◆ 苏氨酸与赖氨酸合作进行的反馈抑制便被打破，于是赖氨 酸能够大量积累。
2、抗反馈调节突变株的利用
在以积累末端产物为目的的发酵生产中，如果代谢途径 单一无分枝，往往不能选用营养缺陷型突变株。 要提高产量，最好采用抗反馈调节突变株。 抗反馈调节突变株是一种解除合成代谢反馈调节机制的突 变型菌株。其特点是所需产物不断积累，不会因其浓度超量 而终止生产。
把大肠杆菌培养在含有葡 萄糖和乳糖的培养基中， 可明显看到大肠杆菌经历 了两个对数期。
葡萄糖在第一个周期中被 利用。在葡萄糖代谢初期， -半乳糖苷酶和半乳糖苷 透性酶的合成受阻遏，使 乳糖不被利用。 葡萄糖被消耗完后，乳糖代谢所需的酶开始合成，于是出 现了利用乳糖的第二个生长周期。
这种抑制青霉素合成及乳糖利用的现象，起初认为 只有葡萄糖才会产生，故称为葡萄糖效应。
乳糖操纵子(lac operon)
两种效应物的共同调节
需要两种效应物共同调控，缺一不可。
这种调节方式常出现在分解酶的合成调节上。 如:大肠杆菌中乳糖操纵子的调节与胞内cAMP浓度以及乳 糖(或其他结构类似物)相关。
调节基因 lacI
RNA P 聚合 酶
控制部分 结构基因 O lacZ lacY lacA
3、累加反馈调节 (cumulative feedback regulation)
每一种末端产物过量只能部分抑制或阻遏，总的效果 是累加的
30% D A B 40% 58% C F
E
G
4、增效反馈调节 (cooperative feedback regulation)
代谢途径中任一末端产物过量时，仅部分抑制共同反应中 第一个酶的活性，但两个末端产物同时过量时，其抑制作用 可超过各末端产物产生的抑制作用的总和。 15% D A B 20% 90% C F G
J1缺陷 J
1
又由于酶J2还受到N的调节，只有 少量的J能转变成N，于是中间产物 J大量积累。
J J
J2
K
M
L
N
利用营养缺陷型积累 分支代谢途径末端产物
在分支途径中，如果减少某一末端产物的浓度，常常 可以积累另一末端产物。 工业上应用的重要例子是赖氨酸发酵
C. glutamicum 的代谢调节与赖氨酸生产
（repressible operon） 负责某些物质合成
色氨酸操纵子
调节基因 lacI
RNA P 聚合 酶
控制部分 结构基因 O lacZ lacY lacA mRNA
阻遏蛋白
-半乳糖苷酶
透过酶
转乙酰基酶
效应物
诱导物
利用乳糖生长
单一效应物调节
酶合成的诱导或阻遏作用都是通过效应物与调节蛋白互相 作用形成复合物，导致调节蛋白构型变化，从而能够结合或 不能结合于操纵子的操纵基因上，从而控制结构基因的转录 表达的。这种调节方式又分为正调节和负调节。
利用枯草杆菌的精氨酸缺陷型生产瓜氨酸，利用大肠杆 菌的赖氨酸缺陷型生产苏氨酸，都是这个道理。
利用营养缺陷型积累
分支代谢途径中的中间产物
末端产物L和N共同对酶a施以反馈; 此外， L抑制酶J1，N抑制酶J2
A
B C
选用缺失酶J1的突变株，则L的合 成受阻。L和N共同对酶a的反馈被 解除。
D E F G H I
第三章 微生物的代谢调节与代谢工程

一、酶活性调节
共价修饰 酶活性的调节方式 变(别)构效应 缔合与解离

竞争性抑制
酶活性调节（continued）
1、共价修饰
指蛋白质分子中的一个或多个氨基酸残基与一化学基团 共价连接或解开，使其活性改变的作用。 化学基团：磷酸基、腺苷酰基、甲基、乙基等
蛋白质的共价结合部位一般为丝氨酸残基的-CH2OH 共价修饰分可逆和不可逆两种
所有可以迅速利用或代谢的能源，都能阻遏异化另 一种被缓慢利用能源所需酶的合成
阻遏作用并非快速利用的碳源（或氮源）本身作用的 结果；而是其分解代谢过程中所产生的中间代谢物引起；
分解代谢阻遏涉及到的是一些诱导酶
二）酶合成调节的分子机制
目前认为，由Monod和Jacob提出的操纵子假说能较好地 启动基因(promoter) RNA聚合酶结合部位 解释酶合成的诱导和阻遏 操纵子 操纵基因(operator) (operon) 结构基因(structural gene) 操纵基因位于启动基因和结构基因之间，能与阻遏物（一种
分解代谢产物阻遏
1、酶合成的诱导（induction）
组成酶 不依赖于酶底物或类似物的存在而合成 诱导酶 如葡萄糖转化为丙酮酸过程中的各种酶 依赖于某种底物或底物的结构类似物的存在而合成 如大肠杆菌乳糖利用酶
诱导剂可以是诱导酶的底物，也可是底物的结构类似物
如：乳糖是大肠杆菌-半乳糖苷酶合成的诱导剂，也是 此酶的底物
可否直接用产生反馈调节 的末端产物来进行筛选
？
末端产物类似物和末端产物结构类似，因而能够引 起反馈，但是它们不能参与生物合成。
在培养基中添加末端产物类似物后，未突变的细胞将 由于代谢途径受阻而不能获得生物合成 所需的该种末端 产物，从而导致细胞死亡。
那些对类似物不敏感的突变体，则由于原来受反馈控 制的酶的结构，或是酶的合成系统已经发生了改变，它 们不再受抑制或阻遏的影响，在类似物充斥的情况下照 常能合成该种末端产物。 例如，用类似物D-精氨酸选出的谷氨酸棒杆菌的抗反馈 突变株可使L-精氨酸的产量得到提高。
最典型的例子是细胞通过最易利用的碳源（如葡萄糖） 的分解产物来抑制一些酶的合成。 这个现象最早在青霉素的生产中发现，可快速利用的 葡萄糖致使青霉素产量特别低，而缓慢利用的乳糖却能 较好地生产青霉素。 进一步的研究表明，乳糖并不是青霉素合成的特殊前 体，它的价值仅在于缓慢利用。被快速利用的葡萄糖的 分解产物阻遏了青霉素合成酶的合成。
末端产物阻遏在代谢调节中有重要作用，保证细胞内各种 物质维持适当的浓度；普遍存在于氨基酸核苷酸生物合成途 径中。
分解代谢物阻遏 (catabolite repression)
——是指两种碳源（或氮源）分解底物同时存在时，细胞 利用快的那种分解底物会阻遏利用慢的底物的有关分解酶 合成的现象。
or ——当培养基中同时存在有多种可供利用的底物时，某些 酶的合成往往被容易利用的底物所阻遏，这就是分解代谢 阻遏。
变构或别构(allosterism)效应
酶活性调节（continued）
是指一种小分子物质与一种蛋白质分子发生可逆的 相互作用，导致这种蛋白质的构象发生改变，从而改变 这种蛋白质与第三种分子的相互作用。
变构蛋白是表现变构效应的蛋白 具有变构作用的酶称作变构酶
一）酶合成调节的类型
诱导
末端产物阻遏 阻遏
[实际上乳糖不是真正的诱导物，它必须先转化为别乳糖才能起诱导剂的 作用]
诱导剂也可以不是该酶的作用底物
如异丙基- -D-硫代半乳糖苷（IPTG）是-半乳糖苷酶合 成的极佳诱导剂，但不是作用底物；
酶的作用底物不一定有诱导作用 如对硝基苯--L-阿拉伯糖苷是-半乳糖苷酶的底物，但不 能诱导该酶的合成。
如果效应物是激活剂，则与调节蛋白的结合导致结构基因 转录启动，从而表达有关的酶或蛋白，如果效应物是抑制剂， 则结果相反。
调节基因 lacI
RNA P 聚合 酶
控制部分 结构基因 O lacZ lacY lacA mRNA
转录
阻遏蛋白
无活性
-半乳பைடு நூலகம்苷酶
透过酶
转乙酰基酶
诱导物
利用乳糖生长 —— 酶的诱导机制（负调节）
抗反馈突变株由于基因突变，它们的酶或无活性的原 阻遏物不再与末端产物结合，从而不再发生酶的变构及 阻遏物的活化，或者活性阻遏物不能再与发生了突变的 操纵基因结合，因此反馈调节被打破，即使在末端产物 过量的情况下，也同样可以积累高浓度的末端产物。
抗反馈调节突变株的获得：
抗反馈突变株通常可以用添加末端产物类似物的方法来 筛选获得。