猪苓多糖卡介苗诱导的热休克蛋白对巨噬细胞表面分子的影响

猪苓多糖/卡介苗诱导的热休克蛋白对巨噬细胞表面

分子的影响1

黄羽，曾星，张娴，周丹

广州中医药大学附属广东省中医院中心实验室，广东广州 (510120)

E-mail: zengxing-china@, yhuang_789@

摘要：目的：观察猪苓多糖/卡介苗诱导T24膀胱癌细胞产生的细胞外热休克蛋白对J774A.1巨噬细胞TLR、共刺激分子、黏附分子、活化分子表达的影响，探讨猪苓多糖/卡介苗灌注治疗膀胱癌的天然免疫启动机制。方法：1. ELISA检测猪苓多糖/卡介苗与T24膀胱癌细胞共培养上清中HSP90、HSP70、HSP60、HSP27的表达 2.流式细胞术检测含HSP共

ⅠⅡ；活化分子CD25；培养上清对小鼠J774A.1巨噬细胞表面分子CD14、TLR2/4、MHC/

共刺激分子CD80、CD86、CD40；黏附分子CD44、CD62L、CD11b、CD18表达的影响。

3. TLR4/MD2抗体复合物阻断J774A.1巨噬细胞表面TLR4的表达后，含HSP共培养上清

ⅠⅡ、CD25、CD80、CD86、CD40、CD44、CD62L、CD11b、CD18对其表面分子MHC/

表达的影响。结果：1. 猪苓多糖/卡介苗诱导T24膀胱癌细胞产生的热休克蛋白呈剂量和时间依赖性，猪苓多糖（2mg/mL）和卡介苗（250ug/mL）作用48h时HSP的表达至峰值，其中HSP70呈优势表达 2. 含HSP的共培养上清可上调J774A.1巨噬细胞TLR4、MHCⅠ、CD86、CD40、CD25分子的表达，增强黏附分子CD44、CD62L荧光强度 3. 含HSP的共培养上清作用于用TLR4/MD2阻断后的巨噬细胞，其表面分子 CD86、MHCⅠ、CD40、CD25的表达降低。结论：猪苓多糖/卡介苗诱导的细胞外热休克蛋白可通过激活小鼠J774A.1巨噬细胞TLR4信号通路，上调其表面分子的表达，启动抗膀胱癌天然免疫应答。

关键词：猪苓多糖；卡介苗；热休克蛋白；膀胱癌；TOLL样受体；表面分子

中图分类号： R392-33 文献标识码： A

TOLL样受体是天然免疫中的模式识别受体，大部分表达在抗原提呈细胞表面，包括巨噬细胞、单核细胞、树突状细胞。它的配体按来源可分为内源性和外源性的配体，外源性的配体主要是微生物的保守成分，内源性配体主要来自宿主的自身成分如HSP等，有研究报道[1]，HSP通过巨噬细胞表面的TLR4/2结合，启动一系列的胞内信号传导途径，最终导致细胞因子、趋化因子、黏附分子和共刺激分子等效应分子的表达。

膀胱内灌注卡介苗（bovis bacilli calmette guerin,BCG）是公认的治疗浅表性膀胱癌的首选疗法，也是术后最有效的预防复发的措施 [2]，但其作用机制尚未阐明。深入了解BCG的作用机制有助于进一步提高BCG灌注疗效,减少副作用。已有的研究表明，BCG激活的免疫反应和TOLL样受体有关， BCG的刺激能上调J774.1巨噬细胞TLR4的表达[3]。

中药猪苓汤证实能够减轻BCG灌注治疗引起的膀胱炎、血尿等副作用[4]，并且已有的研究表明[5][6]，从猪苓中提取的活性成分猪苓多糖（PPS）能够协同BCG增加小鼠腹腔巨噬细胞NO的合成释放和J77A.1巨噬细胞细胞因子IL-8、IL-1β、TNF-α的表达。

肿瘤免疫逃逸的重要机制之一是共刺激分子及HLA抗原的缺乏，有效的抗原递呈和共刺激分子的表达是诱导抗肿瘤免疫应答的始动环节，在抗原递呈及T细胞激活过程中，MHC 分子及共刺激分子起着关键作用。各种内外源性抗原必须经过APC处理后与MHCI/Ⅱ类分子结合成复合物才能被T细胞受体(TCR)识别。共刺激分子提供了T细胞活化必须的第二信号。在TCR特异识别抗原过程中若缺乏协同刺激信号则T细胞被诱导为无能状态。因此，无论在免疫应答的起始阶段还是在效应T细胞对肿瘤细胞的特异杀伤过程中，巨噬细胞表面的HLA 1基金项目：广东省中医药管理局基金（No：303002）； 教育部高等学校博士学科点专项科研基金（No：20040572009）资助

抗原及协同刺激分子的表达都很重要。

本文主要观察猪苓多糖/卡介苗诱导的细胞外热休克蛋白（eHSP）对巨噬细胞表面分子标志TLR2、TLR4、CD14、MHCⅠ、MHCⅡ、CD25、CD80、CD86、CD40、CD44、CD62L、CD11b、CD18的作用。并且用抗体阻断的方法，观察eHSP激活的巨噬TLR4信号通路对细胞表面分子表达的影响。

1.材料与方法

1.1 材料

人T24膀胱癌细胞株（武汉中国典型培养物保藏中心）,小鼠J774A.1细胞株（武汉中国典型培养物保藏中心），卡介苗（BCG）（上海微生物制品研究所）猪苓多糖（江苏正大天晴药业股份有限公司），DMEM培养基（美国GIBICO公司），7H9培养基（美国BD公司），0.25%胰酶消化液（美国GIBICO公司），胎牛血清（美国GIBICO公司），HSP90 ELISA 试剂盒（美国ADL公司），HSP70 ELISA 试剂盒（美国R﹠D公司），HSP60 ELISA 试剂盒（美国R﹠D公司），HSP27 ELISA 试剂盒（美国R﹠D公司），Anti-mouse TLR4/MD2（美国eBioscience公司）Anti-mouse CD14-FITC、Anti-mouse CD14-PE、Anti-mouse TLR2-PE、Anti-mouse TLR4-PE、 Anti-mouse TLR4/MD2、Anti-mouse CD80-FITC、Anti-mouse CD86- FITC 、Anti-mouse MHC II-PE 、Anti-mouse MHC I-PE 、Anti-mouse CD44-PECY5、Anti-mouse CD40-PE、Anti-mouse CD25-PE、Anti-mouse CD62L-PECY5、Anti-mouse CD11b-FITC、Anti-mouse CD18-PE； Rat IgG2b-PE 、Rat IgG2b-FITC 、Rat IgG2a-PE、Mouse IgG2a,κ-PE Armenian Hamster IgG-FITC、Rat IgG2b-PE 以上单克隆抗体及同型对照试剂均为美国eBioscience公司产品；酶标仪（芬兰DRAGON公司），流式细胞仪（美国贝克曼-库尔特公司，ELITE-ESP型），倒置显微镜（日本NIKON 公司）

2.方法

2.1 含HSP培养上清的检测

用BCG（250µg/ml）和PPS（2mg/L）联合刺激T24细胞，48h时收集其培养上清，用ELISA的方法检测其上清中HSP90、HSP70、HSP60、HSP27的表达，0.22µm过滤除菌， -20℃保存备用。

2.2 J774A.1细胞的传代培养

将冻存的J774A.1细胞从液氮罐中取出，37℃迅速溶解，加PBS洗细胞1-2次，接种于75cm2培养瓶，加入含20%胎牛血清的DMEM培养液，置37℃，含5% CO2培养箱培养，待细胞铺至瓶底80%-90%时，用吸管吹打至细胞脱落，离心洗涤1-2次，再将细胞接种于150 cm2培养瓶中，接种浓度为1×107/mL，待细胞铺置板底60%-70%时，弃去培养上清。实验分为两组，一组加入含HSP的共培养上清，对照组加入无血清的普通DMEM培养液，置37℃，含5% CO2培养箱48h后，收集细胞，备用。