山羊瘤胃中固氮细菌的分离与初步鉴定_冀德君

第27卷第3期家畜生态学报Vol.27No.3 2006年5月Acta Ecologiae Animalis Domastici May.2006山羊瘤胃中固氮细菌的分离与初步鉴定冀德君,周为琴,严宏翔,赵国琦＊(扬州大学动物科技学院,江苏扬州　225009)[摘　要]　通过瘤胃瘘管采集山羊瘤胃液,分离瘤胃优势菌,并在不同气体环境(纯N2、纯CO2、氩气或空气)下应用无氮培养基培养,考察瘤胃优势菌对氮气的利用情况,并初步进行了微生物学鉴定。

结果表明,纯N2条件下,菌株YUAN63和菌株YUAN100在无氮培养基上能生长,与空气条件下相当,但在C O2条件下未有可见菌落,在氩气条件下仅有少数小菌落。

研究结果说明了瘤胃细菌中存在一类能利用氮气的细菌,但仍需进一步确定。

[关键词]　瘤胃细菌;固氮细菌;氮素[中图分类号]　S811.5 [文献标识码]　A [文章编号]　1004-5228(2006)03-0074-04 早期对固氮细菌的研究集中在根瘤菌方面,近年来,分子遗传学研究表明,固氮作用有关的固氮酶基因可能通过垂直和水平传播方式进化,并且在水体[1]、白蚁肠道细菌中发现固氮酶基因的存在[2], Kirby J等发现瘤胃厌氧菌Ruminococcus flavefaciens 17纤维素酶基因的下游片段的基因产物与固氮细菌的固氮酶基因(nifS)有40%～50%的序列同源性[3]。

在山羊瘤胃中曾有研究者分离了瘤胃脱硫肠状菌菌株(Dm.Ruminis),但未进一步研究。

反刍动物的小肠内被消化吸收的蛋白质主要由过瘤胃饲料蛋白质和来自瘤胃的微生物体蛋白质组成。

瘤胃微生物提供奶牛产奶所需蛋白质的50%～100%,瘤胃微生物的产量一直为众多的研究者所重视。

赵国琦等研究了不同日粮条件下与氮素有关的生理生化指标和瘤胃细菌、纤毛虫体蛋白质在小肠内的利用率,分离了瘤胃优势菌并进行了体外人工唾液消化试验,初步阐释了瘤胃对氮素利用的规律[4]。

本研究在此基础上,针对瘤胃细菌固定氮气的可能性进行试验,并初步进行了微生物学鉴定。

1　材料与方法1.1　瘤胃细菌的分离通过瘤胃瘘管在无菌条件下用真空负压装置采集徐淮白山羊瘤胃液,滤去食糜残渣,置于充满CO2的灭菌生理盐水瓶中,分别于厌氧和有氧超净台中快速操作,经倍比稀释后涂布于普通固体营养琼脂培养基,39℃培养24h后挑取不同优势菌的单个典型菌落分别进行纯培养直至菌落形态一致。

1.2　固氮细菌的筛选与分离应用无氮培养基(Na2MoO40.5g、KH2PO41.36 g、Na2HPO42.13g、MgSO4·7H2O0.2g、CaCl20.1g、Na Cl0.2g、FeCl30.01g、纯化琼脂粉1.8%和重蒸蒸馏水1000mL)与普通固体营养琼脂培养基制作培养皿,将获得的瘤胃细菌在两种培养皿上分别划线接种,普通培养基与无氮培养基分别置于纯N2、氩气和C O2中,39℃培养48h,观察并记录结果。

1.3　微生物学鉴定用细菌生化微量鉴定管(杭州天和微生物试剂有限公司,2001-6),进行生化鉴定,根据生化鉴定结果初步将菌株进行微生物学分类,根据菌种的各种性质,对照伯杰氏细菌鉴定手册初步确定相应种属,并对菌株形态进行电镜观察与摄影(H-300透射电子显微镜),获得菌株的电镜照片。

[收稿日期]　2005-05-24,修回日期:2005-11-14[基金项目]　国家自然科学基金资助项目(30371039)。

[作者简介]　冀德君(1973-),男,江苏盐城人,讲师,在读博士生,主要从事家畜生态的教学与研究工作。

　＊　[通讯作者]　赵国琦(1964-),教授,硕士生导师。

2　结果与分析2.1　瘤胃优势菌的种类经过重复几次分离培养,获得了26株瘤胃优势菌的纯培养,以斜面接种法保种。

此26个优势菌株为兼性厌氧菌。

2.2　不同气体环境培养结果各菌株在无氮培养基和普通营养琼脂培养基上生长性能差异较大;各菌株在相同培养基上但在不同气体环境(纯N 2、纯CO 2、氩气或空气)中生长性能差异也较大(见表1)。

纯N 2条件下,两菌株(YUAN63和YUAN100)在无氮培养基上能生长,与空气条件下相当,但在C O 2条件下未有可见菌落,在氩气条件下仅有少数小菌落。

表1　不同气体环境分离菌株在两种培养基上生长性能Table 1　Growth of two strains on two culture plates under different gas conditionsYUAN63YUAN100普通培养基Ordinary无氮培养基Nitrogen -free 普通培养基Ordinary 无氮培养基Nitrogen -free 氮气N 2++++++++++++++CO 2+++-++-氩气Ar 2++++++++++空气air+++++++++++++　注:“+”代表生长状况,“+”越多表示生长越旺盛。

　Note :“+”means growth condition ;more “+”mean the better growth .表2　菌珠YUAN63和YUAN100培养体系的总蛋白量的增加Table 2　Nitrogen increase in t wo culture systems of two strainsg菌珠Strain 培养组总蛋白量Total protein of culture group对照组总蛋白量Total protein of control group总蛋白增加量Increase of total proteinYUAN630.0130.008320.00468YUAN1000.005720.003870.00185表3　菌株YUAN63和YUAN100的生化微量反应管结果Table 3　Effects of t wo strains growing in biochemical micro -tubeYUNA63YUAN100YUNA63YUAN100氧化酶Oxidase--糊精Dextrin+-葡萄糖Glucose ++阿拉伯糖Arabinose +-乳糖Lactose ++七叶苷Aesculin +-木糖苷Xylose +-SIM--甘露醇Manitol -+明胶Gelatin +-蔗糖Sucrose ++封口Sealed ++甘露醇Manitol -+不封口unsealed ++果糖Fructose ++尿素urea++半乳糖Galactose +-硫化氢Hydrogen sulphide --棉子糖Melitose ++/-葡磷胨Glucose phosphate Gel --淀粉Starch ++苯丙氨酸Phenylalanine +-水扬素Salicin+-葡萄糖酸盐Gluconate--纤维二糖Cellobiose +-西蒙氏枸橼盐Simmonds citrate --ONPG+-醋酸盐Acetate --紫牛乳Purple Milk ++丙二酸盐Malonate --麦芽糖Maltose--硝酸盐还原Nitrate redaction--75第3期 冀德君等:山羊瘤胃中固氮细菌的分离与初步鉴定2.3　固氮能力测定在15g 无氮培养基上生长72h 后,两培养体系总蛋白分别增加0.00468g 和0.00185g (表2),说明体系从外部获得了氮,与此两培养体系发生物质交换的只有空气,而空气已经过稀硫酸吸收除氨,因此初步认为两菌珠利用了空气中的氮气。

2.4　固氮细菌的微生物学鉴定结果2.4.1　培养特性　菌株YUAN63的菌落白色,圆形,不透明,表面湿润,中间微突,G -,有运动力;菌株YUAN100的菌落黄白色,圆形,表面粗糙,中间凹陷,G +,无运动力。

2.4.2　生化微量鉴定管鉴定结果　见表3。

2.4.3　电镜结果　电镜照片显示(见图1、图2):菌株YUAN63具单极生鞭毛,大小为1um ×2um ;电镜照片显示:菌株YUAN100为短杆菌,大小为0.5um ×1um。

3　讨论与结论3.1　就细菌生长繁殖而言,氮素是不可替代的,利用不同气体环境条件下细菌生长性能差异可以推断气体成分产生的作用。

纯N 2、氩气和纯C O 2环境下所产生的细菌生长性能差异应归结于N 2对生长的促进作用,就此推断细菌生长过程中利用了气体环境中的氮素,即直接利用N 2或者说,具有固定N 2的能力。

但这是一个间接推断,存在一些可疑因素。

对细菌的固氮作用可以根据总氮测定法直接确定,但体系中NH3-N 及化合态氮的存在使得结果并非可靠。

乙炔还原法可以间接证明固氮作用的存在,目前所有的已知固氮细菌均能还原乙炔,不过对固氮作用的最终确定应采用15N 标记法。

本研究根据分离培养试验,发现多种瘤胃细菌能在无氮培养基上生长。

因此,初步认为,固氮细菌在反刍动物瘤胃中可能存在,固氮效率可能高于固氮根瘤菌,将进一步采用15N 标记法对本研究分离细菌的固氮作用进行最终确定。

3.2　纯CO 2环境下,即使普通营养琼脂培养基上,上述两菌株也显示出生长受到一定程度的抑制,重复三次的结果一致。

而N 2、氩气和空气环境条件下细菌生长较旺盛。

导致抑制的机理尚待进一步研究。

3.3　固氮作用有关的固氮酶基因仅存在于原核生物(细菌和古细菌)中,由于固氮作用受多种环境因素影响,利用PCR 技术检测固氮酶基因的存在而确定具有固氮作用是当前应用较多的手段。

Jon P .Zehr 等和B .B .Ward 等已采用功能基因芯片研究氮循环中固氮酶基因的多样性,具有广阔的前景,并可引导发现新的固氮细菌。

在本研究基础上,将进一步采用功能基因PCR 技术,检测固氮酶基因在瘤胃中的存在与分布。

3.4　生态系统中食物链的营养级理论从宏观上阐释了能量与物质的循环与流动,而微生物与动物的共生补充了原先不存在食物链中的特殊物质的供应。

这一供应中是否包括氮的输入?白蚁肠道细菌中发现固氮酶基因的存在,自然界中部分产甲烷细菌中具有固氮作用,这些都不应是偶然现象,可能具有一定的普遍性。

参考文献:[1]　Steward GF et al .Vertical dis tribution of nitrogen -fi xing phylot ypesin a meromictic ,hypers al ine lake .Microb Ecol ,2004,47(1):30-40.[2]　Kirby J .et al .A cysteine desulphuras e gene from the cellul ol ytic ru -men anaerobe Ruminococcus flavefaciens .Biochi m Bi ophys Acta ,1998,1386(1):233-237.[3]　Moriya Ohkuma et al .Phylogenetic Diversit y of Nitrogen Fixation Genesin the Symbiotic Microbial Community in the Gut of Diverse Termites [J ].Appl .Envir .Microb ,1999,65(11):4926-4934.[4]　赵国琦,等.碳水化合物对绵羊小肠内瘤胃微生物氨基酸利用的影响[J ].扬州大学学报(自然科学版),2001,4(42):35-38.76家畜生态学报第27卷Isolation and Preliminary Identification ofNitrogen -fixing Bacteria in RumenJI De -jun ,ZHOU Wei -qin ,YAN Hong -xiang ,ZHAO Guo -qi＊(C ollege of Animal Sc ienc e and T echnol ogy ,Yangzhou Uni vers ity ,Yangzhou 225009)A bstract :By collecting rumen fluid via rumen fistula ,dominant bacteria were isolated and cultured under different gas conditions ,including pur e N 2,pure CO 2,pure Ar2and air ,to detect the utilization of N 2in these bacteria strainsand these isolates were then microbiologically identified .The results showed YUAN63strain and strain YUAN100c ould grow under pure N 2and air c ondition ,ho wever ,both could not gr ow under pure C O 2and pure Ar2condition .The find -ings indicated that some nitrogen -fixing bacteria could possibly survive in the rumen .Key words :Rumen bacterium ;Nitrogen fixing bacterium ;Nitrogen科技期刊常用单位符号单位名称标准符号单位名称标准符号米m 厘米cm 立方米m 3毫米mm 平方米m 2千米[公里]km 平方米每千克m 2/kg 公顷hm 2[小]时h 千克[公斤]kg 分[钟]min 摄氏度℃秒s 微升μL 微[米]μm 毫升mL 升L 克每升g /L 千克每升kg /L [细胞]个每升L -1焦[耳]J 千克每米kg /m 摩[尔]每千克mol /kg 勒[克斯]lx 摩[尔]mol 立方米摩[耳]m 3/mol 平方米摩[尔]m 2/mol 千瓦k w 立方米每摩尔m 3/mol 千瓦小时kw ·h 千克每米k g /m 千克每平方米kg /m 2兆焦每千克MJ /kg 立方米每千克m 3/kg 克每毫升g /mL 千米每小时Km /h 千克每米k g /m 焦[耳]每千克J /kg 度°焦[耳]每平方米J /m 2[角]分′焦[耳]每立方米J /m 3[角]秒″焦[耳]每摩尔J /mol77第3期 冀德君等:山羊瘤胃中固氮细菌的分离与初步鉴定。