绵羊羊膜上皮细胞分离培养及鉴定
遗传性疾病检验技术—标本采集技术
遗传性疾病检验技术—标本采集技术对遗传性疾病的诊断常常需要通过检验患者的遗传物质变异，来确定疾病的病因。
常用的检验技术包括染色体或染色质检查、DNA及RNA变异的检验等。
因此，采集的标本往往是含有遗传物质的组织细胞。
在通常情况下，外周血标本即可满足多种检验需要。
此外，在产前诊断中常需要对胎儿的组织进行取材，如胎儿绒毛细胞、羊水中胎儿脱落的细胞、脐带血等。
胸腹水中的脱落细胞、骨髓细胞常是肿瘤或白血病患者诊断中采用的标本。
一、一般采集技术（一）外周血标本采集1.常规消毒受检者取坐位，取前臂水平伸直置于枕垫上，在肘部选择前静脉，幼儿可选颈外静脉或股静脉采血。
在穿刺点上方约6cm处系紧压脉带，嘱受检者握紧拳，使静脉充盈显露。
用75%酒精棉签从内向外擦拭消毒皮肤2～3次（勿用碘酒）。
2.采血75%酒精消毒含肝素溶液的瓶盖，在酒精灯下用无菌的5ml注射器吸取肝素液湿润内壁至3ml刻度处，然后将多余肝素推弃，抽静脉血3～5ml，盖上无菌盖，转动注射器，防止血液凝固，标本送实验室。
（二）羊水细胞标本采集1.适应证（1）孕妇年龄大于或等于35岁。
（2）孕妇有曾生育过染色体异常患儿史。
（3）夫妇一方有染色体结构异常者。
（4）孕妇曾生育过单基因病患儿或遗传性代谢病患儿史。
（5）产前筛查具有高风险的孕妇。
（6）其他需要抽取羊水标本检查的情形。
2.禁忌证（1）先兆流产。
（2）术前2次测量体温（腋温）高于37.2℃。
（3）有出血倾向（血小板≤70×109/L，凝血功能检查有异常）。
（4）有盆腔或宫腔感染征象。
（5）非医学需要的胎儿性别鉴定。
3.术前准备（1）穿刺前认真核对适应证、妊娠周数、子宫大小、有无穿刺禁忌证。
（2）孕妇签署知情同意书。
（3）术前查血常规，血型和Rh因子，白细胞及血小板计数正常者方可手术，如Rh（-），查间接Coombs试验，告知胎母输血的风险，建议准备抗D球蛋白。
（4）术前检查HIV抗体、HBsAg、抗梅毒抗体。
动物细胞培养基本技术与原理备课讲稿
二、动物细胞特性
动物细胞在活体内的特性 培养条件下动物细胞生长特性 培养条件下动物细胞生理特性
1. 动物细胞在活体内的特性
在活体内，动物细胞:
增殖 分化
分化的动物细胞在功能上具有明确的分工，并具有 明显的形态学特征。
如肌肉细胞为纺锤形，以便于行使收缩伸展功能； 神经细胞具有很长的分支，很多的纤维，以便接受和传递刺激； 红细胞呈园盘状，有利于和周围环境交换气体和在血管内流动； 上皮细胞由于它要覆盖于表面，常常相互挤压成不规则形状。
二、取材、分离和组织消化 (to draw the materials from tissue，separation ，digestion )
（一）取材——获取组织
原则上各种动物组织都可进行体外培养，而实际上幼龄组织（尤其 是胚胎组织）比老龄组织容易培养、分化程度低的比分化程度高的 容易培养、肿瘤组织比正常组织容易培养。 取材前要对所取组织的各种情况进行详细记录；
“代”：继代次数和存活时间的长短因细胞来源的年 龄和种族不同而有差异。年龄越大继代次数越少。人胚 成纤维细胞约可以培养50代，而成年人的成纤维细胞则 不能继代50次，同样是成纤维细胞，取自鸡胚的成纤维 细胞可继代培养30代，而小鼠的只能培养8代。
大多数细胞系在有限的代数内以不变的形式增殖，当超 过有限世代后，它们可能有两种情况：一是衰老死亡，二是 发育成永久细胞系或称连续细胞系。有限细胞系转换成永久 细胞系的过度期称为转换期(crisis)，其转换过程在动物细 胞培养中称为体外转化(in vitro transformation)。
用特点及组织成分不同适当选用 （4）EDTA：最适于消化传代细胞时，常与胰蛋白酶配合使用。
2、组织消化操作方法(tissue digestion method of operation)
高中生物遗传专题：生物的生殖和发育专题 专题辅导
高中生物遗传专题：生物的生殖和发育专题专题辅导考纲要求：无性生殖属A级，有性生殖属A级；减数分裂的概念属B级，精子卵细胞的形成属C级；受精作用属A级；被子植物的个体发育和高等动物的个体发育均属B级。
二、高考分析：本专题考查的重点是减数分裂和有性生殖细胞的形成、植物胚的发育过程、动物个体发育、植物组织培养及细胞的全能性等。
在复习中，我们应注重对以下几个方面知识的掌握：减数分裂各个时期细胞图像的识别、减数分裂中DNA、染色体的变化规律、胚及胚乳的基因型和染色体的组成、羊膜及羊水的意义等。
同时，在复习中还要注意与其他章节的联系，如减数分裂与有丝分裂的区别与联系、减数分裂与基因的分离规律和自由组合规律的联系、植物个体发育与遗传物质的变化等。
2006年江苏考了两道选择题，占5分，一道是关于有性生殖和无性生殖的比较；一道是关于动植物个体发育的比较。
减数分裂部分2006年未考。
2005年也考了两道选择题，一道是关于羊膜的意义，一道是关于精子形成过程的，共5分；2004年也考了三道选择题，两道是关于减数分裂和有丝分裂比较的，4分；一道是关于细胞全能性的，2分，共6分。
（2006年江苏卷22题）与无性生殖相比，有性生殖的后代具有较强的适应性，下列说法不正确的是A后代继承了双亲的遗传物质B减数分裂过程中，DNA复制更容易发生差错C减数分裂过程中，由于基因重组产生了不同类型的配子D更容易产生新的基因型【答案】B（2006年江苏卷31题）被子植物种子形成过程的某一阶段，乙为脊椎动物个体发育过程的某一时期。
下列叙述正确的是A甲中l部位的细胞继续分裂和分化，发育成胚B被子植物在达到开花年龄后，其营养器官的生长就会停止C．乙中的细胞继续分裂、移动和分化，可发育成原肠胚D卵裂期胚的细胞数目增多、体积增大【答案】AC回归课本：1．有性生殖与无性生殖的比较乙项目无性生殖 有性生殖 不同点生殖细胞 可产生生殖细胞（如孢子），但不经过生殖细胞的结合 产生生殖细胞，一般要经过两性生殖细胞的结合过程亲代性状保持子代基本保持母体的性状，变异小，是保持亲本优良性状的生殖方法子代具有双亲的遗传性，变异性强，不利于亲本性状的保持 后代适应能力弱强 相同点 都能产生新个体，繁殖后代，使种族得以延续2．几种特殊的生殖方式（1）试管婴儿一般过程：体外受精，受精卵在体外发育一段时间后，将胚胎移植到子宫内继续发育。
《医学微生物学》动物接种实验与病毒培养技术实验
《医学微生物学》动物接种实验与病毒培养技术实验实验动物在病原微生物中的研究上占有重要地位。
利用实验动物可以进行病原菌的分离鉴定、毒力的检测、制备免疫血清等生物制品；进行各种皮肤试验；建立人工感染的动物模型；进行发病机制、疾病防治以及免疫机制的研究等。
一、实验动物的管理1．实验室常用的动物：家兔、豚鼠、小白鼠、大白鼠、地鼠、绵羊、鸡等，根据实验的目的选择最适宜的动物。
2．实验动物必须与正常动物分开饲养，动物室内要经常保持清洁和空气畅通，并应有防蚊、防蝇、防逃跑及保暖设备。
3．实验动物要精心饲养，喂以适当的饲料并给以充足的水，任何动物也不要断水。
4．实验动物要有详细的记录，包括性别、体重、体表特征(如毛色等)、接种材料、接种日期、接种途径、剂量、次数以及接种变化等。
5．实验动物应做好标记，对较大动物如家兔、豚鼠等可用金属号码牌固定于耳朵上，对较小动物如大白鼠、小白鼠等可用复红(或苦味酸等染料)涂于身体的不同部位，以资识别。
盛装动物的笼具等，也应付以标签。
6．接种后的动物应每天观察1～2次，注意动物的精神状态，活动能力、饮食和大小便情况，体温、注射部位的反应以及全身反应，如不安、耸毛、震颤、弓背、麻痹及死亡等，并应详细记录之。
7．感染动物死亡后，应立即剖检或暂时冻存。
动物的排泄物及使用的笼具等必须严格消毒。
任何用过的动物，不宜再做其他试验。
二、实验动物的选择选择实验动物应注意以下几点：1．易感性：是选择实验动物的首要条件。
2．动物健康：体质健康、发育正常、体重适宜；最好使用自己繁殖的动物，由市场购买的动物至少经过一周的隔离观察，证明无隐性感染方可使用；某些特殊实验应需选用专门喂养繁殖的无菌动物；实验动物应容易获得，便于喂养和管理。
3．动物大小：同一实验应选用大小一致的动物，通常以年龄或体重为标准。
4．性别：某些实验最好选用同一性别，特别是免疫的动物和需要观察较长时间的实验动物。
5．动物品系：某些实验要求使用纯系动物，纯系小鼠用于免疫学、杂交瘤及病毒感染等研究。
生物羊膜特点与应用
质量保证
瑞济羊膜理化性能检测： 外观：清洁、透明、无杂质、无破损 水份：水份＜ 10% 缝合拉力：应不小于1.0g，5分钟 酸碱度测定：羊膜浸出液与同批空白对
照液之间， PH值之差不超过1.5
瑞济冷冻干燥生物羊膜 --与新鲜羊膜的比较
生物羊膜组织的透射电镜检测
新鲜羊膜
冷冻干燥羊膜
冷冻干燥羊膜与新鲜羊膜的各层组织结构相同
但对于复发性胬肉或缺乏相对正常自体干细胞的患者，许多学者试用羊膜移
植治疗翼状胬肉，其术后复发率明显低于单纯切除组。这可能与羊膜本身没
有抗原性，不会诱发免疫反应；同时羊膜能抑制炎性反应，阻止新生血管长
入；羊膜有接触抑制，本身可以阻止变性结膜组织生长，防止胬肉复发。⑻
解决屈光手术引起的角膜混浊(Haze)。 多数人认为角膜混浊的产生与激光手术产生的局部炎症反应及新生上皮产生 的多种生长因子引起前基质细胞和胶原的异常增生有关，因此羊膜移植可以 减轻手术区域的炎症反应及局部刺激因素，有望减轻角膜混浊。 ⑼作为体 外细胞培养的载体：随着角膜缘干细胞理论与实验培养技术的发展羊膜作为 没有抗原性、有较好的生物相容性等，使其成为载体的最佳选择，但有关这 种上皮羊膜上培养后抗原性改变，移植上皮眼表的分化及功能的维持都需要 鸡长时间的探讨。
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1.上皮层：羊膜上皮可为单层立方形、在胎儿面上皮为柱状，有时 上皮呈假复层，其上皮层内可见退化细胞。上皮细胞内常含有脂 肪滴。该层是新鲜的羊膜组织抗原性所在的部位。
2.基底膜层：由狭窄的无细胞网状纤维构成，厚度不一。在胎盘处 羊膜的基底膜最厚，该层组织PAS染色呈阳性反应。
人羊膜上皮细胞和间质细胞的分离培养
人羊膜上皮细胞和间质细胞的分离培养刘 芳,漆洪波(重庆医科大学附属第一医院妇产科,重庆 400016)提要:目的:探讨人羊膜上皮细胞和羊膜间质细胞的分离、培养及鉴定。
方法:取足月妊娠剖宫产术中的羊膜组织剪成碎片,胰蛋白酶消化15min,共四次,取消化液1000rpm 离心5min 收集细胞。
剩余羊膜组织加入1.0g/L 的胶原酶和0.1g/L 的D NA 酶,39e 消化120min,消化液1000rpm 离心5min 收集细胞。
用含10%胎牛血清的D MEM /F12培养液培养、传代。
倒置显微镜下观察其细胞形态及细胞生长情况。
通过免疫细胞化学的方法对细胞进行细胞鉴定。
结果:通过不同的酶消化分离法可以将羊膜上皮细胞和间质细胞进行细胞分离培养,羊膜细胞体外一段时间内表现出良好的细胞增殖能力和传代能力。
胰蛋白酶消化的细胞角蛋白染色呈阳性,波形蛋白染色呈阴性。
胶原酶消化的细胞波形蛋白色阳性,角蛋白染色阴性。
结论:羊膜上皮细胞和间质细胞能够在体外分离、扩增。
这为羊膜细胞进行细胞治疗和组织工程技术奠定了实验基础。
关键词:羊膜上皮细胞;羊膜间质细胞;细胞培养;细胞鉴定中图分类号:TN248.1 文献标识码:A 文章编号:0253-2743(2008)02-0086-02The primary culture and isolation of human amnion epithelial and mesenchymalLIU Fang,QI Hong-bo(The Fi rs t Affili ated Hos pital of Chongqing Medical University,Chongqing 400016,Chi na)Abs tract:O bjective:To investigate the isolation,culture and identification of human amniotic epithelial cells and mesenchymal cells.Methods :Amnion tis -sues were collected i mmediately af ter elective cesarean s ection from term placentas.The harvested pieces of tis sue were mechanically mi nced and treated 4times with 0.25%trypsin for 15minutes.The cells obtained duri ng trypsin treat ments were collec ted by centrifugation at 1000rpm for 5minutes.The remaining tis sue were i ncubated with 1.0g/L collagenas e and 0.l g/L DNase at 37e for 120mi nutes.The cells were collected by centrifugation at 1000rpm for 5minutes.Both cell types were c ultured in a complete medium c onsisting of D MEM /FI2and 10%fetal bovine serum for pri mary c ulture and pas sage.The cultured cells were in -ves tigated morphol ogically under i nverted microscope and were identified by i mmunohistochemistry.Resu lts:Human amniotic cells can be successfully i solated by trypsi n and colagenase res pectively,and the cells can proliferate and pas saged in vitro.for a certain peri od.Cells dispersed with trypsin stained posi ti ve for cytok -eratin and negative for Vimentin.Cell dis pers ed with collagenase stained negati ve for c ytokerati n and positive for Vi mentin.Conclus ion:Human amniotic epithelial and mesenchymal cells can be is olated and proli ferated in vitro.These findings suggest that amnion cells may be a practical cell source for cell therapy and tis sue engi neering.K ey words :amniotic epi theli al cells;amniotic mesenchymal cells;cell cul ture;cell identificati on 收稿日期:2008-01-08基金项目:国家自然科学基金项目(30772336)作者简介:刘 芳,重庆医科大学附属第一医院妇产科。
细胞分离常用方法
细胞分离常用方法一、悬浮细胞的分离方法组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料，最简单的方法是采用1000r/min 的TD4A低速离心机离心10分钟，若悬液量大，可适当延长离心时间，但速度不能太高，延时也不能太长，以避免挤压或机械损伤细胞，离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次，用培养基洗一次后，调整适当细胞浓度后再分瓶培养，若选用悬液中某些细胞，常采用离心后的细胞分层液，因为，经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层，这样可根据需要收获目的细胞。
不同比重的分层液的配制和具体分离方法详见淋巴细胞分离培养的章节。
二、实体组织材料的细胞分离方法对于实体组织材料，由于细胞间结合紧密，为了使组织中的细胞充分分散，形成细胞悬液，可采用机械分散法(物理裂解)和消化分离法。
(一)机械分散法所取材料若纤维成分很少，如脑组织，部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针)，使细胞通过针头压出，或在不锈钢纱网内用钝物压挤 (常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。
此法分离细胞虽然简便、快速，但对组织机械损伤大，而且细胞分散效果差。
此法仅适用于处理纤维成分少的软组织。
(二)消化分离法组织消化法是把组织剪切成较小团块(或糊状)，应用酶的生化作用和非酶的化学作用进一步使细胞间的桥连结构松动，使团块膨松，由块状变成絮状，此时再采用机械法，用吸管吹打分散或电磁搅拌或在摇珠瓶中振荡，使细胞团块得以较充分的分散，制成少量细胞群团和大量单个细胞的细胞悬液，接种培养后，细胞容易贴壁生长。
1、酶消化分离法酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶，其分离方法如下：(1)胰蛋白酶分散技术胰蛋白酶(简称胰酶)是广泛应用的消化剂。
胰蛋白酶是一种胰脏制品，对蛋白质有水介作用，主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键，使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开，在常用的蛋白酶中由于产品的活力和纯度不同，对细胞的消化能力也不同，胰蛋白酶对细胞的作用，取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。
一种从脐带和胎盘羊膜组织同时提取上皮细胞和间充质干细胞的方法
(10)申请公布号(43)申请公布日 (21)申请号 201510963676.5(22)申请日 2015.12.17C12N 5/073(2010.01)C12N 5/0775(2010.01)(71)申请人斯坦姆（天津）生物技术研究有限公司地址300457 天津市滨海新区天津经济技术开发区洞庭路220号天津国际生物医药联合研究院会议楼C407(72)发明人阎军 肖敏 任峰(74)专利代理机构天津盛理知识产权代理有限公司 12209代理人韩晓梅(54)发明名称一种从脐带和胎盘羊膜组织同时提取上皮细胞和间充质干细胞的方法(57)摘要本发明涉及一种从脐带和胎盘羊膜组织同时提取上皮细胞和间充质干细胞的方法，步骤如下：⑴脐带和胎盘羊膜取材和接种；⑵间充质干细胞和羊膜上皮细胞在培养瓶中扩增和传代；⑶间充质干细胞和羊膜上皮细胞的鉴定：①细胞培养传到第三代时，胰酶消化后鉴定培养细胞的纯度：②验证细胞纯度达到90％以上，即是符合标准，即得上皮细胞和间充质干细胞的混合物。
本方法成本低、简单快速，使用组织剪碎机来将脐带和胎盘羊膜剪碎成极小的碎块，极为利于直接接种到培养瓶之后细胞向组织外游移；不使用任何蛋白酶试剂，从而大幅度地降低成本，减少制备时间，使得短时间大规模细胞制备成为现实；该方法使用添加生长因子及其它营养物的细胞培养基，节省了血清。
(51)Int.Cl.(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书2页 说明书5页CN 105420179 A 2016.03.23C N 105420179A1.一种从脐带和胎盘羊膜组织同时提取上皮细胞和间充质干细胞的方法，其特征在于：步骤如下：⑴脐带和胎盘羊膜取材和接种：①高温消毒手术器械和大玻璃皿，同时紫外线消毒超净工作台；②配制培养基：完全培养基的组成是：DMEM/F12加完全培养基总体积5％的胎牛血清、完全培养基总体积1％的胰岛素、铁传递蛋白和硒的混合添加物，完全培养基中终浓度为20毫微克/毫升的表皮生长因子和完全培养基中终浓度为20毫微克/毫升的碱性纤维母细胞生长因子，无菌过滤，4℃保存；所述DMEM/F12中DMEM：F12的体积比为1:1；所述混合添加物及在混合添加物中的终浓度为胰岛素5微克/毫升、铁传递蛋白10微克/毫升和亚硒酸钠5毫微克/毫升；③严格筛选供者，血液化验排除传染病；④低温冰盒中运送脐带和胎盘：机械剥离胎盘羊膜之后，将脐带和胎盘羊膜分别置于大玻璃皿中，以下步骤都在无菌条件下进行，将脐带剪成1cm长的小段，将胎盘羊膜剪成约5X5cm长的方块，用磷酸缓冲盐水+总体积1％的青霉素+总体积1％的链霉素清洗组织两次，洗干净脐带的血液；⑤将脐带和胎盘羊膜组织放在4℃的磷酸缓冲盐水中，以防止组织在机械剪碎时过热而影响到细胞存活，使用组织剪碎机来分别破碎成1-3mm的碎块，使用低速破碎组织，同时保持细胞活性，得到破碎的脐带和羊膜组织；⑥将破碎的脐带和羊膜组织分别转移到T175细胞培养瓶中，并用组织刮取器将其平铺于培养瓶底，小心加入少量完全培养基，使培养液既能覆盖破碎的脐带和羊膜组织块，又不至于使其漂浮起来，置于37℃、饱和湿度5％CO2培养箱中培养；⑵间充质干细胞和羊膜上皮细胞在培养瓶中扩增和传代：①培养过程中观察可见细胞从组织块逐渐游移出来，并进一步实现贴壁生长和增殖，在培养的第3-4天、当细胞生长融合成片时，用无菌磷酸缓冲盐水洗去残存的组织，全部换为新鲜完全培养基继续培养；②此后每4天换一次培养液直到细胞长满90-100％培养瓶底面积，便进行胰酶消化传代；③胰酶消化传代：倒弃培养液，用PBS洗细胞2次，每T175用10毫升质量百分数为0.25％的胰酶-EDTA在37℃消化10分钟，待细胞悬浮后每个T175加入1毫升胎牛血清以中和胰酶反应，1000转/分离心10分钟，再悬浮于完全培养基中，按1：4细胞数比例传代到新T175培养瓶中；⑶间充质干细胞和羊膜上皮细胞的鉴定：①胰酶消化传到第三代时，用流式细胞仪鉴定培养细胞的纯度：羊膜上皮细胞的标记物包括：角蛋白CK19，CD29，和CD34；胎盘和脐带间充质干细胞的标记物包括：CD73，CD90，和CD105；②流式细胞仪验证细胞纯度达到90％以上，化验排除常见的传染病，并排除细菌，支原体污染，即是符合标准，即得上皮细胞和间充质干细胞的混合物。
生产、运输、存储质量管理
血液及生物组织质量标准管理规范一、用于细胞制剂生产的羊膜及脐带所对应的脐带血、骨髓及胚胎对应的外周血必须由医院出具合格的检测报告。
血液检测项目至少包括表一所列检测项目。
表一血液全检标准二、羊膜组织评估及运输1）评估:无菌采集的羊膜组织，使用一次性无菌无热原的塑料管盛放。
盛放羊膜组织所用的塑料管必须管盖旋紧、包装完整，无破损，无液体泄漏;羊膜组织应为透明或半透明状态，略呈白色或粉红色，应无胎粪污染、颜色变化等异常情况。
2)运输：膜组织采集后选择合适的保温箱，放冰袋,冷藏运输,尽快与质量部进行交接，时间控制在5小时之内。
3）初检不合格的样品按《不合格品的标准管理规程》管理.4.)血液检测报告、羊膜合格后方可用于生产.质量部负责统计检验结果及整理报告，如遇结果不合格按《不合格品的标准管理规程》管理,及时通知相关部门。
羊膜上皮细胞采集管理规范为规范羊膜上皮细胞采集技术的临床应用,保证医疗质量和医疗安全，制定本规范。
本规范适用于羊膜上皮细胞的采集、培养、存储、运输.羊膜上皮细胞的采集（一）医疗机构基本要求：采集羊膜上皮细胞的医疗机构应当保证羊膜上皮细胞来源合法，须为三级甲等医院产科（二）采集环境：1）剖腹产手术室：有固定的羊膜采集工作区；有配备相应的羊膜上皮采集器械及耗材。
2)应急处理区：有相应的抢救设备，能够进行急症处理.3)有资料保存与传输设备。
(三)人员基本要求：负责羊膜上皮细胞采集工作的医师有副主任医师以上专业技术职务任职资格，有医院内2名以上符合羊膜采集技术人员要求的护士，并有满足工作需要的其他相关专业技术人员。
（四)羊膜组织的要求：1）羊膜供体的要求:产妇需为健康剖腹产者，如有传染病史（乙肝、丙肝、梅毒、艾滋病等）则不予采集。
2）羊膜的质量标准：要求提供与羊膜组织相对应的脐带血检验报告,报告内容及标准包括：①ABO血型、Rh血型需明确。
②乙型肝炎病毒表面抗原（HBsAg)应为阴性③乙型肝炎病毒表面抗体（HBsAb）需明确④乙型肝炎病毒e抗原（HBeAg）应为阴性⑤乙型肝炎病毒e抗体（HBeAb）应为阴性⑥乙型肝炎病毒核心抗体（HBcAb）应为阴性⑦丙型肝炎病毒抗体(HCV-Ab）应为阴性⑧人类免疫缺陷病毒抗体（HIV-Ab）应为阴性⑨梅毒血清抗体检测（TP—Ab)应为阴性⑩EB病毒抗原IgM抗体应为阴性⑪巨细胞病毒抗体IgM （CMV—IgM）应为阴性（五）技术基本要求1）采集脐血：以肝素抗凝管采集脐血(5ml/支采集2支，或10ml/支采集1支）,用于血型及传染病学检测.2）采集羊膜①戴上无菌手套，整个胎盘放置在无菌的区域。