克隆总结

克隆总结

注意：1、以下所有操作尽量在无菌操作台进行，除非有特别说明。

2、该说明暂时只适合PMD-18（19）T-载体。

3、本总结仅供参考。

1、准备PCR回收产物，PCR产物回收时尽量做割胶回收。（可不使用超净台）

第一天：

2、加样量，跟DL2000Marker相比较，目的产物在1000bp左右，一样亮，加3uL，

比Marker亮的加2.5uL，要弱一点的加3.5，要是基本上看不见，但还是有的话，加5uL，最多不超过5.5（6）uL。

3、连接。SolutionⅠ加2.5uL，载体0.5uL,模板量按照步骤2来加，用枪头吸打混匀，

离心，在16o C连接过夜。（连接时间要根据片段的大小来定，1000bp以上的至少要连接12小时以上，2000bp左右的要连接至少一天。）

4、配制LB培养基：

LB培养基的配方

第二天：

5、取感受态细胞（Takara）置于冰上溶解，每管可用于四个连接产物。

6、把感受态细胞直接加入到连接产物中，用枪慢慢吸打混匀，然后置于冰上30min，

7、准备工作：（1）把水浴锅调至42o C；（2）准备复苏培养基。（3）开摇床，调节温

度至37o C。

8、再把加入了感受态细胞的连接产物放到42o C水浴锅中90sec，立即放置冰上5min

左右。

9、然后在全部转移至复苏培养基中，在摇床上200转，37o C，1h进行培养。(保证能

拿到阳性克隆)

10、涂板：每管取160-200uL加到事先准备好的平板上，用1.5mL的Eppendorf

管涂匀，放置37o C 30min之后，把培养平板翻过来，培养基那一面朝上，培养11-12h。

第三天：

（一）不提取质粒，只是得到基因的序列的可以采用菌落PCR的方法来做，具体做法如下：

11、PCR反应体系和条件：

(1)以下PCR反应体系是20uL体系。(2) PCR反应条件

12、用10uL的枪头在一个单菌落上蘸一下，放到已经配制好的PCR反应液里，插

在10uL的枪上，吸打几次，然后扔掉枪头，加油封或者不封，然后在PCR仪上进行扩增。

13、然后纯化，检测

纯化

1）从PCR仪上取出离心1500 RPM 2分钟

2）加入4-6倍遇冷的异丙醇，混匀一分钟，在—20度冰箱沉淀30分钟以上3）配平离心3800 30分钟，（打开烤箱60度）

4）叠纸倒置，在90停，加入4-6倍异丙醇，3800 15分钟叠纸倒置在100停5）放入烤箱一个半小时，待异丙醇全部挥发。

（二）提取质粒做法

（1）手工提取质粒按照下面的步骤进行

Plasmid DNA is manually isolated via standard alkaline lysis miniprep method. Solutions:

P1 Solution

Ingredient (without Rnase A):

Tris: 50mM (pH 8.0)

EDTA 10mM

Preparation (without RNase A, 500ml):

1 Tris 1M (pH8.0) 25ml

EDTA 0.5M (pH 8.0) 10ml

2 add autoclaved ddH2O to 500ml

3 autoclave, store at RT

4 add 0.1mg/ml RNase A when you start extraction

P2 Solution

Ingredient:

NaOH 0.2 N

SDS 1%

Preparation (20ml, for 56 sample miniprep, prepare just before you need it):

Autoclaved ddH2O 14ml

NaOH (1N) 4ml

SDS (10%) 2ml

P3 Solution

Ingredient:

Kalium Acetate 3M (pH 4.8-5.5)

Preparation (500 ml):

1 Weight Kalium Acetate (MW=98.14g/mol) 147.21 g

2 desolve it in 230ml autoclaved ddH2O

3 bring up the volume to 500ml with 100% glacial acetate acide

4 autoclave and store at 4 o C

Or

Potassium acetate (5M) 60ml

100% glacial acetic acid 11.5ml

ddH2O 28.5ml

Procedure:

ing a sterile toothpick, pick colonies into 2ml LB/CAM media. Use 13ml snap-cap

polypropylene tube. Grow overnight shaking at 250rmp at 370C.

2. Transfer cultures to 2ml eppendorf tubes and centrifuge at 16,000 x g for 30-60

seconds to pellet the bacteria.