样品稀释对毛细管电泳分离检测DNA片段的影响
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样品稀释对毛细管电泳分离检测 Ｄ Ａ片段的影响＊ Ｎ
宋立 国
陈 洪
（ 武汉大学化学系
张
武汉
乐
４０７） ３０２
程介克 ＊
Hale Waihona Puke 提 要 通过理论推导和实验验证表明： 适当稀释 Ｄ Ａ样品溶液， Ｎ 采用流体力学进样或电 动进样都不会较大
地减低峰高， Ｄ Ａ片段毛 细管电泳的分离效率和分离度还能有所提高 。 而 Ｎ 采用稀释样 品的方 法可提高 Ｄ Ａ样 Ｎ 品的使用效率 。 采用羟 乙基纤维 素无 胶筛分介质分离 了Ｄ Ａ片段 。 激光诱 导荧 光（ Ｎ 用 氩离子激光器 ，８ ｎ ） ４８ ｍ 电 荷耦合器件检测。 用低浓 度的筛分介质 （． ％） ０４ ィ分离 了分子质量较大 的 Ｄ Ａ Ｈｉ Ｎ－ ｎ ｄ 全部 ８ 个片段 （２ ｂ ～ １５ ｐ
Ｆｇ１ ｎｌｅｃ ｏ ｓｍ ｌ ｄ ｕｉ ｏ ｓｐｒｔ ｎ ｉ． Ｉｆ ｎｅ ａ ｐ ｉ ｔ ｎ ｅａａｉ ｕ ｆ ｅ ｏ ｎ ｌ ｏ
离电压 ： ２ Ｖ， －１ ｋ 电流 ２ Ａ； ０ 氩离子激光器 （ 激发波 长为 ４８ ；Ｃ ８ ｎ Ｃ Ｄ检测器 （ ｍ） 发射 波长为 ５０ ）样品稀释倍数 ：ａ１ ２ｎ ； ｍ （） ，
（ ） ，（） ，（ ） 。 ｈ２ ｃ４ ｄ８
Ｃ ｎｉｏ ：ａｉａ Ｄ － ｃｌ ， ０ ｍ（ ｄ ） ３５ ｏｄ ） ｃａｎ ｔｉ ｎｓ ０１ ，ｏａ ｌ ｇｈ ｃ ｅ ｅｔ ｅ ｏｄｔｎＣ ｐ ｌｙ １ ｕ ｉ ｌｒ Ｂ ｏ ｍｎ １０ ｉ ． ， ６ ｍ（．． ， ｏｔ ｇ ｃ ｅ ． ｐ ｔｔ ｅ ｔ ６ ｍ， ｆｃｉ ． ｉ ｈ ｋ ｓ ｉ ｎ ｌ ｎ ０ ｆ ｖ
ｅ ｉｔｎ ｔ ４８ ｍ ； Ｃ ｄｔ ｔ （ａ ｌ ｇ ｏｅ ｉｉ ｌｈ， ２ ｎ ）ｒｉ ｏｓ ｐ ｄｕｏ， ），ｂ２ （ ｘ ｔｉ ｌｈ， ８ ｎ ） Ｃ Ｄ ｅｏ ｗｖ ｅ ｔ ｆ ｓｏ ｉ ｔ ５０ ｍ ；ｔｓ ａ ｌ ｉｔｎ（ １ （），ｃ ｃａｏ ｉ ｇ ｅ ｃ ｒ ｅ ｎ ｈ ｍ ｓ ｎ ｇ ａｏ ｆ ｅ ｉ ａ ｍ ｌ ）
离 中可保 证被分 离离子 的浓度 保持 不变 ， 即在 电泳 谱 图 中相 对应 的峰高保 持不 变 ， 而样 品稀 释可 以较 大地 节约样品 。 ３２ ． 流体 力学进 样时样品稀释对 Ｄ Ａ片段分 离的 Ｎ 影响
式（） 明将 样品稀释后进样 ， ３表 进样完 成后在分
Ｄ Ａ Ｈｎ Ｎ －ｉ ｄ 的分 离采 用 ０４ ． ％羟 乙基 纤 维 素作为筛分介 质。 由于筛分介质粘度较低 ， 于考 察 适 样 品稀 释对于 流体动力学 进样后 Ｄ Ａ 片段 分离 的 Ｎ 影响， 结果如 图 １ 示。从 图 １ ～ｃ 所 － 玞 中可 以看 出 ａ
２ １０ 。 ３ ｂ） 用高浓度的筛分介质（．％ 分离分子质量较小的ｐＲ ２－ａ ３ ｐ １６ィ ） Ｂ ３２ ｅ ２ 个片段（ ｂ～ ８ ｂ） 将 Ｈ ２ １ ｐ ５７ ｐ。 ８
ｐ Ｒ ２－ ａ Ｂ ３２Ｈ ｅ Ｄ Ａ样 品溶液稀释 １ 倍时 ，２ ｐ １４ｂ 两个片段得到了分离。 Ｎ ０ １３ｂ 和 ２ ｐ
－ ｖ） ２ ０ 等部分组成［ ７
２ ２ 剂 ． 试
三 羟 甲基氨 基 甲烷 （ ｒ ）硼 酸 、 二胺 四、 Ｔｉ ， ｓ 乙 乙 酸二钠 （Ｄ Ａ） 为 国产 分析 纯 试剂 ； 乙基纤维 ＥＴ 均 羟
素为Ｓ 公司产品 ２ ｅ ％的水溶液２℃时的粘度为 ５
４Ｐ ｓ ； 唑 橙 （ Ｏ） Ａ ｄｉ ａ・ ） 噻 Ｔ 为 ｌｒｈ产 品； Ｄ Ａ ｃ Ｎ － Ｈｎ ｉ ｄ 及 ｐ Ｒ ２－ ａ Ｂ ３２ ｅ 购 自华美 生物工 程公 司， Ｈ 二 者 都 保 存 于 １ ｍ ｏ／ Ｔ ｉ Ｈ １１ ｍ ｌ ０ ｌ ｍ Ｌ ｒ － Ｃ ，０ｍ ｏ Ｌ ｓ ／ Ｎ Ｃ ， ｍ ｏ Ｌ Ｔ ｐ ７８的缓 冲溶液 中。 ａ ｌｌ ｌ Ｅ Ａ（Ｈ ． ） ｍ ／ Ｄ
关键词 毛 细管电泳， 激光诱导荧光， 荷耦合器 样品 电 件， 稀释，Ｎ Ｄ Ａ片段
分类号 Ｏ６８ ５
１ 前言
用毛细 管电泳分 离 Ｄ Ａ 片段具 有 高效 、 Ｎ 高速 、
进样量少和 耗用试 剂低 等优点 ， 成 为分子 生物 学 正
样品的使用效率 ， 有重要的实际 意义。 具
２ 实验部分
２ １ ． 实验装置
自行组装的激光诱导荧光电荷耦合器件毛细管
电泳装 置 ， 由高压 电源（ 中理工 大学研 制）毛细管 华 、 （ Ｂ１ Ｊ Ｗ ｃ ｎｉｃ ｌ ｍ， Ａ， Ｓ 总 长 度 Ｄ －， ＆ Ｓｉ ｔｉ Ｆ ｓ ｅ ｆ ｏ ｏ Ｃ Ｕ Ａ， ６ ｃ 有效分 离长 度 ５ ｍ）氩 离子 激 光器 （ 海 ０ ｍ， ５ｃ ， 上
Ｈｎ ｉ ｄ （ ｇ Ｌ ； ｙｒｄ ｎｍｉｉｅｔ ｎ ｓ８ｍ； ｅａａｏ ｖｌ ｇ－１ｋ ｃｒｅｔ Ａ； ｉ ｌ ｅ （ ａｅ ｎｔ ｏ １ ／ ） ｈ ｄｏｙａ ｃ ｃｏ ４ ／ｃ ｓｐｒｔ ｎ ｔ ｅ ２Ｖ， ｕｒｎ ２ ｎ ｉ ０ ｊ ｉ ｏａ ０ Ａ ｉ ａ ｒ ｖｌ ｇｈ ｏ ｓ ｗ ｅ ｎ ｆ
ｏ ＤＮＡ ａｍｅ ｔ ｂ ｈ ｄ ｏ ｙ ａ ｃ ｅｔ ｎ ｆ ｆ ｇ ｎｓ ｙ ｒｄ ｎ ｍｉ ｉｊｃｉ ｒ ｙ ｎ ｏ
实验条件： 毛细管 Ｄ －柱， 径 １ ｍ 外径 ３５ ｍ 涂 Ｂ１ 内 ０ ， ０ ６ ， 层厚度 ０１ ｍ， ． 总长度 ６ｃ 分离长度 ５ ｃ 载体电解质溶液： ０ｍ， ５ｍ； １ × Ｂ 缓冲溶液； ４ 羟乙 ＴＥ ０ ％ ． 基纤维素， ｍ ｌ 噻唑橙；Ｎ １ ｏＬ ／ Ｄ Ａ片段：Ｄ ＡＨｎ １ｇＬ ； Ｎ －ｉ ｄ ／ ）流体动 力学进样，０ ８ 分 ４ｓ ｃ ／ ｍ；
组成。 筛分介质溶液的配制和Ｄ Ａ片段毛细管电 Ｎ
泳分离步骤见 文献 ８。 ］ 将荧光插入试剂加入筛分介 质缓 冲溶液 中 ， 用无菌 的双 蒸水 稀释 Ｄ Ａ样 品。 Ｎ
３ 结果与讨论
３ １ ． 样品稀 释对毛 细管 电泳分 离检 测的影 响的理
论推 导
＊ 国家自然科学基金资助项 目 ＊＊ 通讯联系人 本文收稿 日 ：９８０－９修 回日期 ：９８０－２ 期 １９－５１ ， １９－７１
ｍｍｏ／ Ｔ ｉ， ９ｍｍｏ／ 硼 酸 和 ２ｍｍｏ／ Ｅ Ａ ｌＬ ｒ ８ ｓ ｌＬ ｌＬ ＤＴ
体力学进样（ 电堆积富集） 或电动进样（ ［ ５ 场增强进
样） 来实现 的。 ［ ６ 本文依 据这一原 理通过理论推 导和 实验验证表 明 ： 当稀释 样 品并将 其分 装成 若干 份 适 后分别使用 ， 峰高没有 降低 或者降低 得较少 ， 分离效 率和分辨率还有所 提高 。 在分 子生 物学研究 中 ， 采用 毛细管电泳分离检测 Ｄ Ａ 片段 ， Ｎ 能节 约样 品， 提高
式 （） １中假定 样品溶 液与载 体 电解 质溶 液的 离子强 度 由相同的某一 电解 质控制 ， 而其浓度分 别为 Ｃ 与 ｓ
Ｃ。 ｂ
由于被 分离离子在样 品溶 液与载体 电解 质溶液 的边 沿前后 流量须保持平衡 ， 因此有 Ｃｓｉ Ｃ Ｖｂ ｉ ｓ ｉｉ Ｖ ＝ ｂ ， 与式 （） １ 结合可得
ｐＲ ２－ａ Ｂ ３２Ｈ ｅ Ｄ Ａ的分离采用１６ Ｎ ．％羟乙基
当样 品溶液 与载体 电解质 溶液的离 子强度不 同 时 ， 品溶液与载体 电解 质溶液的 电阻率不 同 ， 样 由此 可导致进样前后在 外加 电压作 用下分配在样 品区带 内的电场强度 与充满 电解质溶 液的毛细管柱 的其它 部分不 同 ， 品离 子 的迁移 速度也 不相 同。如果 以 样 Ｃ， Ｖ分别 代 表样 品溶液 和 载体 电解 质溶 液 中离 Ｅ， 子的浓度 、 电场强度 、 样品溶液 中被分 离离子 的迁 移 速度 ， ｓ ｂ分别 代表样 品溶 液和 载体 电解质 溶 以 和 液 ， ｉ 表被 分 离的样 品离 子 ， 在理 想条 件下 ， 以 代 则 以上关系可近似表达 为
裂。
Ｄ ＡＨｎ 样品在稀释倍数小于４时， Ｎ －ｉ ｄ 尽管峰高
和分离度都发生一定 的变化 ， 但总体来 说变化不 大 。 而 当稀释倍数 为 ８ ， 时 峰高 的降低 及分离 度 的提高 已相 当明显 。 ３３ 电动进样 时样 品稀释对 Ｄ Ａ片段分 离的影响 ． Ｎ
以上分 离结果表 明， 样品稀释进样应 用于 Ｄ Ａ Ｎ 片段 的分 离 中效果 显著 ， 离 时取少 量 Ｄ Ａ样 品 分 Ｎ 稀释后进样 ， 可保证检测灵敏度不 降低 或降低较小 ，
ｌ ｇ ５ｃ ；ａ ｉ ｅｃ ｏ ｔ； Ｔ Ｅ ０４ ｈｄｏｙ ｈｌ ｕ ｓ， ｍ ｌ ｔｉｏｏ ｎｅ Ｄ Ａ ｇ ｅｔ Ｎ － ｅ ｔ ５ｍ ｃｒｅ ｌ ｔ ｌｅ １ Ｂ ；．％ ｙｒ ｅ ｙ ｃｌｏｅ １ ｏ Ｌ ｚ ｒ ｇ； Ｎ ｆ ｍ ｎ：Ｄ Ａ ｎ ｈ ｒｒ ｒ ｙ ｅ ｘｔ ｅ ｌ ｌ ／ ｈ ｌ ａ ａ ｒ ａ
埃恩激光技术有限公司）单色仪（ Ｒ ２， ｓ ｕ 、 Ｈ ３０Ｉ ｔ － ｎｒ
ｍ ｎ Ｓ Ｉｃ， Ｓ ） 电荷耦 合 器件 （ Ｃ ５２ ｅｔ ｎ． Ｕ Ａ 、 Ａ， Ｃ Ｄ，１ × ５２ ＆ Ｐ Ｒ， Ｓ 、 １ Ｅ Ｇ Ｇ Ａ Ｕ Ａ）计算 机 （ ａ ｗ ｙ ０ ４ Ｘ Ｇ ｔ ａ ２ ０ ｅ ０ Ｄ
中重要的研究手段 ， 在生物医学 、 医学 等领域发挥 法 着越来越重要的作用［ 。在分子 生物学 实际 的研究 １ 工作 中 ，Ｎ Ｄ Ａ样 品溶 液体积极 小 ， 一般 只有 Ｌ级 ， 而毛细管 电泳仪 ， 无论 是商 品仪器 还是 实验 室组 装 的仪器 ， 都要求样 品溶 液最少 要有 数微 升到数 十微 升 ， 样才能使 毛细管 的进样 端 和电极插 入 到样 品 这 溶液中 ， 完成进样操作 。由于 Ｄ Ａ样 品较容易被污 Ｎ 染降解 ， 与毛细管或 电极 接触 后 ， 般仅在一 天左 右 一 Ｄ Ａ片段就会基本 完全降解 。在需要使用 Ｄ Ａ 分 Ｎ Ｎ 子质 量标准物 （ Ｎ Ｍａｋｒ作毛 细管 电泳条件实 Ｄ Ａ ｒｅ） 验时 ， 往往需要 大量的 Ｄ Ａ样 品试 剂 ， Ｎ 而这些 Ｄ Ａ Ｎ 试剂一般价 格都较 昂贵 。 实验 中有时 由 Ｐ Ｒ扩增 在 的 Ｄ Ａ样 品溶 液 的离 子强度 较 高 ， 导 致 毛细 管 Ｎ 会 电泳分 离效率降低 ， 分离度不 能满足要求 ［。 品堆 ２样
的影 响 ， 们 用 它 考 察 了样 品稀 释对 电动 进 样 后 我 Ｄ Ａ 片段分离 的影 响 ， 如图 ２ Ｎ 结果 所示 。从 图 ２ 可
以看出，Ｂ ３２Ｈ ｅ Ｄ Ａ样品稀释 １倍后， ｐＲ ２－ａ Ｎ ０ 峰
高变化 不明显 ， 线噪声明显增大 ， 分离度有 所 虽基 但 改 善 ， 现 在 ８９ 即 １３ ４ 峰发 生 了明 显 的分 表 ／ （ ２／２ ）
４ ｄ ８ １ ２ ，．５ ４ ３ ０ ７ ４ ３ ２ ５ ３ １ ．６ ５ ，７ ４ ６ ．２ １ ０ ，（ ）． ．１ ５ ２ ６ ，．２ ２ ， ．２ ２ ，．４ ６ ，６ ５ ７ ．９ １ ，８ ３ ３ ．
如果将样 品稀 释
得
倍 后进 样 ， 则其 中各 离子 的
浓度降低 倍， ｉ ｓ Ｃ＝Ｃ／， 即Ｃ ＝Ｃ ／， ｓ 代入式（） ２
积（ａ ｐ ｓ ｒｉ ） ｓｍ ｌ ｔ ｋ ｇ作为一种提高毛细管电泳检测 ｅ ｎ ａ
灵敏度的柱上浓缩方法 ， 由于其 简便易行 ， 得到 近来
了 越来越广泛的应用［４ 样品堆积是通过将分析样 ３。 ，
品溶 于离子强度低于 电泳载 体缓 冲溶 液后再进行 流
载体电解质溶液采用 １ Ｔ Ｅ缓冲溶液， ９ Ｂ 由８
宋立 国
陈 洪
（ 武汉大学化学系
张
武汉
乐
４０７） ３０２
程介克 ＊
Hale Waihona Puke 提 要 通过理论推导和实验验证表明： 适当稀释 Ｄ Ａ样品溶液， Ｎ 采用流体力学进样或电 动进样都不会较大
地减低峰高， Ｄ Ａ片段毛 细管电泳的分离效率和分离度还能有所提高 。 而 Ｎ 采用稀释样 品的方 法可提高 Ｄ Ａ样 Ｎ 品的使用效率 。 采用羟 乙基纤维 素无 胶筛分介质分离 了Ｄ Ａ片段 。 激光诱 导荧 光（ Ｎ 用 氩离子激光器 ，８ ｎ ） ４８ ｍ 电 荷耦合器件检测。 用低浓 度的筛分介质 （． ％） ０４ ィ分离 了分子质量较大 的 Ｄ Ａ Ｈｉ Ｎ－ ｎ ｄ 全部 ８ 个片段 （２ ｂ ～ １５ ｐ
Ｆｇ１ ｎｌｅｃ ｏ ｓｍ ｌ ｄ ｕｉ ｏ ｓｐｒｔ ｎ ｉ． Ｉｆ ｎｅ ａ ｐ ｉ ｔ ｎ ｅａａｉ ｕ ｆ ｅ ｏ ｎ ｌ ｏ
离电压 ： ２ Ｖ， －１ ｋ 电流 ２ Ａ； ０ 氩离子激光器 （ 激发波 长为 ４８ ；Ｃ ８ ｎ Ｃ Ｄ检测器 （ ｍ） 发射 波长为 ５０ ）样品稀释倍数 ：ａ１ ２ｎ ； ｍ （） ，
（ ） ，（） ，（ ） 。 ｈ２ ｃ４ ｄ８
Ｃ ｎｉｏ ：ａｉａ Ｄ － ｃｌ ， ０ ｍ（ ｄ ） ３５ ｏｄ ） ｃａｎ ｔｉ ｎｓ ０１ ，ｏａ ｌ ｇｈ ｃ ｅ ｅｔ ｅ ｏｄｔｎＣ ｐ ｌｙ １ ｕ ｉ ｌｒ Ｂ ｏ ｍｎ １０ ｉ ． ， ６ ｍ（．． ， ｏｔ ｇ ｃ ｅ ． ｐ ｔｔ ｅ ｔ ６ ｍ， ｆｃｉ ． ｉ ｈ ｋ ｓ ｉ ｎ ｌ ｎ ０ ｆ ｖ
ｅ ｉｔｎ ｔ ４８ ｍ ； Ｃ ｄｔ ｔ （ａ ｌ ｇ ｏｅ ｉｉ ｌｈ， ２ ｎ ）ｒｉ ｏｓ ｐ ｄｕｏ， ），ｂ２ （ ｘ ｔｉ ｌｈ， ８ ｎ ） Ｃ Ｄ ｅｏ ｗｖ ｅ ｔ ｆ ｓｏ ｉ ｔ ５０ ｍ ；ｔｓ ａ ｌ ｉｔｎ（ １ （），ｃ ｃａｏ ｉ ｇ ｅ ｃ ｒ ｅ ｎ ｈ ｍ ｓ ｎ ｇ ａｏ ｆ ｅ ｉ ａ ｍ ｌ ）
离 中可保 证被分 离离子 的浓度 保持 不变 ， 即在 电泳 谱 图 中相 对应 的峰高保 持不 变 ， 而样 品稀 释可 以较 大地 节约样品 。 ３２ ． 流体 力学进 样时样品稀释对 Ｄ Ａ片段分 离的 Ｎ 影响
式（） 明将 样品稀释后进样 ， ３表 进样完 成后在分
Ｄ Ａ Ｈｎ Ｎ －ｉ ｄ 的分 离采 用 ０４ ． ％羟 乙基 纤 维 素作为筛分介 质。 由于筛分介质粘度较低 ， 于考 察 适 样 品稀 释对于 流体动力学 进样后 Ｄ Ａ 片段 分离 的 Ｎ 影响， 结果如 图 １ 示。从 图 １ ～ｃ 所 － 玞 中可 以看 出 ａ
２ １０ 。 ３ ｂ） 用高浓度的筛分介质（．％ 分离分子质量较小的ｐＲ ２－ａ ３ ｐ １６ィ ） Ｂ ３２ ｅ ２ 个片段（ ｂ～ ８ ｂ） 将 Ｈ ２ １ ｐ ５７ ｐ。 ８
ｐ Ｒ ２－ ａ Ｂ ３２Ｈ ｅ Ｄ Ａ样 品溶液稀释 １ 倍时 ，２ ｐ １４ｂ 两个片段得到了分离。 Ｎ ０ １３ｂ 和 ２ ｐ
－ ｖ） ２ ０ 等部分组成［ ７
２ ２ 剂 ． 试
三 羟 甲基氨 基 甲烷 （ ｒ ）硼 酸 、 二胺 四、 Ｔｉ ， ｓ 乙 乙 酸二钠 （Ｄ Ａ） 为 国产 分析 纯 试剂 ； 乙基纤维 ＥＴ 均 羟
素为Ｓ 公司产品 ２ ｅ ％的水溶液２℃时的粘度为 ５
４Ｐ ｓ ； 唑 橙 （ Ｏ） Ａ ｄｉ ａ・ ） 噻 Ｔ 为 ｌｒｈ产 品； Ｄ Ａ ｃ Ｎ － Ｈｎ ｉ ｄ 及 ｐ Ｒ ２－ ａ Ｂ ３２ ｅ 购 自华美 生物工 程公 司， Ｈ 二 者 都 保 存 于 １ ｍ ｏ／ Ｔ ｉ Ｈ １１ ｍ ｌ ０ ｌ ｍ Ｌ ｒ － Ｃ ，０ｍ ｏ Ｌ ｓ ／ Ｎ Ｃ ， ｍ ｏ Ｌ Ｔ ｐ ７８的缓 冲溶液 中。 ａ ｌｌ ｌ Ｅ Ａ（Ｈ ． ） ｍ ／ Ｄ
关键词 毛 细管电泳， 激光诱导荧光， 荷耦合器 样品 电 件， 稀释，Ｎ Ｄ Ａ片段
分类号 Ｏ６８ ５
１ 前言
用毛细 管电泳分 离 Ｄ Ａ 片段具 有 高效 、 Ｎ 高速 、
进样量少和 耗用试 剂低 等优点 ， 成 为分子 生物 学 正
样品的使用效率 ， 有重要的实际 意义。 具
２ 实验部分
２ １ ． 实验装置
自行组装的激光诱导荧光电荷耦合器件毛细管
电泳装 置 ， 由高压 电源（ 中理工 大学研 制）毛细管 华 、 （ Ｂ１ Ｊ Ｗ ｃ ｎｉｃ ｌ ｍ， Ａ， Ｓ 总 长 度 Ｄ －， ＆ Ｓｉ ｔｉ Ｆ ｓ ｅ ｆ ｏ ｏ Ｃ Ｕ Ａ， ６ ｃ 有效分 离长 度 ５ ｍ）氩 离子 激 光器 （ 海 ０ ｍ， ５ｃ ， 上
Ｈｎ ｉ ｄ （ ｇ Ｌ ； ｙｒｄ ｎｍｉｉｅｔ ｎ ｓ８ｍ； ｅａａｏ ｖｌ ｇ－１ｋ ｃｒｅｔ Ａ； ｉ ｌ ｅ （ ａｅ ｎｔ ｏ １ ／ ） ｈ ｄｏｙａ ｃ ｃｏ ４ ／ｃ ｓｐｒｔ ｎ ｔ ｅ ２Ｖ， ｕｒｎ ２ ｎ ｉ ０ ｊ ｉ ｏａ ０ Ａ ｉ ａ ｒ ｖｌ ｇｈ ｏ ｓ ｗ ｅ ｎ ｆ
ｏ ＤＮＡ ａｍｅ ｔ ｂ ｈ ｄ ｏ ｙ ａ ｃ ｅｔ ｎ ｆ ｆ ｇ ｎｓ ｙ ｒｄ ｎ ｍｉ ｉｊｃｉ ｒ ｙ ｎ ｏ
实验条件： 毛细管 Ｄ －柱， 径 １ ｍ 外径 ３５ ｍ 涂 Ｂ１ 内 ０ ， ０ ６ ， 层厚度 ０１ ｍ， ． 总长度 ６ｃ 分离长度 ５ ｃ 载体电解质溶液： ０ｍ， ５ｍ； １ × Ｂ 缓冲溶液； ４ 羟乙 ＴＥ ０ ％ ． 基纤维素， ｍ ｌ 噻唑橙；Ｎ １ ｏＬ ／ Ｄ Ａ片段：Ｄ ＡＨｎ １ｇＬ ； Ｎ －ｉ ｄ ／ ）流体动 力学进样，０ ８ 分 ４ｓ ｃ ／ ｍ；
组成。 筛分介质溶液的配制和Ｄ Ａ片段毛细管电 Ｎ
泳分离步骤见 文献 ８。 ］ 将荧光插入试剂加入筛分介 质缓 冲溶液 中 ， 用无菌 的双 蒸水 稀释 Ｄ Ａ样 品。 Ｎ
３ 结果与讨论
３ １ ． 样品稀 释对毛 细管 电泳分 离检 测的影 响的理
论推 导
＊ 国家自然科学基金资助项 目 ＊＊ 通讯联系人 本文收稿 日 ：９８０－９修 回日期 ：９８０－２ 期 １９－５１ ， １９－７１
ｍｍｏ／ Ｔ ｉ， ９ｍｍｏ／ 硼 酸 和 ２ｍｍｏ／ Ｅ Ａ ｌＬ ｒ ８ ｓ ｌＬ ｌＬ ＤＴ
体力学进样（ 电堆积富集） 或电动进样（ ［ ５ 场增强进
样） 来实现 的。 ［ ６ 本文依 据这一原 理通过理论推 导和 实验验证表 明 ： 当稀释 样 品并将 其分 装成 若干 份 适 后分别使用 ， 峰高没有 降低 或者降低 得较少 ， 分离效 率和分辨率还有所 提高 。 在分 子生 物学研究 中 ， 采用 毛细管电泳分离检测 Ｄ Ａ 片段 ， Ｎ 能节 约样 品， 提高
式 （） １中假定 样品溶 液与载 体 电解 质溶 液的 离子强 度 由相同的某一 电解 质控制 ， 而其浓度分 别为 Ｃ 与 ｓ
Ｃ。 ｂ
由于被 分离离子在样 品溶 液与载体 电解 质溶液 的边 沿前后 流量须保持平衡 ， 因此有 Ｃｓｉ Ｃ Ｖｂ ｉ ｓ ｉｉ Ｖ ＝ ｂ ， 与式 （） １ 结合可得
ｐＲ ２－ａ Ｂ ３２Ｈ ｅ Ｄ Ａ的分离采用１６ Ｎ ．％羟乙基
当样 品溶液 与载体 电解质 溶液的离 子强度不 同 时 ， 品溶液与载体 电解 质溶液的 电阻率不 同 ， 样 由此 可导致进样前后在 外加 电压作 用下分配在样 品区带 内的电场强度 与充满 电解质溶 液的毛细管柱 的其它 部分不 同 ， 品离 子 的迁移 速度也 不相 同。如果 以 样 Ｃ， Ｖ分别 代 表样 品溶液 和 载体 电解 质溶 液 中离 Ｅ， 子的浓度 、 电场强度 、 样品溶液 中被分 离离子 的迁 移 速度 ， ｓ ｂ分别 代表样 品溶 液和 载体 电解质 溶 以 和 液 ， ｉ 表被 分 离的样 品离 子 ， 在理 想条 件下 ， 以 代 则 以上关系可近似表达 为
裂。
Ｄ ＡＨｎ 样品在稀释倍数小于４时， Ｎ －ｉ ｄ 尽管峰高
和分离度都发生一定 的变化 ， 但总体来 说变化不 大 。 而 当稀释倍数 为 ８ ， 时 峰高 的降低 及分离 度 的提高 已相 当明显 。 ３３ 电动进样 时样 品稀释对 Ｄ Ａ片段分 离的影响 ． Ｎ
以上分 离结果表 明， 样品稀释进样应 用于 Ｄ Ａ Ｎ 片段 的分 离 中效果 显著 ， 离 时取少 量 Ｄ Ａ样 品 分 Ｎ 稀释后进样 ， 可保证检测灵敏度不 降低 或降低较小 ，
ｌ ｇ ５ｃ ；ａ ｉ ｅｃ ｏ ｔ； Ｔ Ｅ ０４ ｈｄｏｙ ｈｌ ｕ ｓ， ｍ ｌ ｔｉｏｏ ｎｅ Ｄ Ａ ｇ ｅｔ Ｎ － ｅ ｔ ５ｍ ｃｒｅ ｌ ｔ ｌｅ １ Ｂ ；．％ ｙｒ ｅ ｙ ｃｌｏｅ １ ｏ Ｌ ｚ ｒ ｇ； Ｎ ｆ ｍ ｎ：Ｄ Ａ ｎ ｈ ｒｒ ｒ ｙ ｅ ｘｔ ｅ ｌ ｌ ／ ｈ ｌ ａ ａ ｒ ａ
埃恩激光技术有限公司）单色仪（ Ｒ ２， ｓ ｕ 、 Ｈ ３０Ｉ ｔ － ｎｒ
ｍ ｎ Ｓ Ｉｃ， Ｓ ） 电荷耦 合 器件 （ Ｃ ５２ ｅｔ ｎ． Ｕ Ａ 、 Ａ， Ｃ Ｄ，１ × ５２ ＆ Ｐ Ｒ， Ｓ 、 １ Ｅ Ｇ Ｇ Ａ Ｕ Ａ）计算 机 （ ａ ｗ ｙ ０ ４ Ｘ Ｇ ｔ ａ ２ ０ ｅ ０ Ｄ
中重要的研究手段 ， 在生物医学 、 医学 等领域发挥 法 着越来越重要的作用［ 。在分子 生物学 实际 的研究 １ 工作 中 ，Ｎ Ｄ Ａ样 品溶 液体积极 小 ， 一般 只有 Ｌ级 ， 而毛细管 电泳仪 ， 无论 是商 品仪器 还是 实验 室组 装 的仪器 ， 都要求样 品溶 液最少 要有 数微 升到数 十微 升 ， 样才能使 毛细管 的进样 端 和电极插 入 到样 品 这 溶液中 ， 完成进样操作 。由于 Ｄ Ａ样 品较容易被污 Ｎ 染降解 ， 与毛细管或 电极 接触 后 ， 般仅在一 天左 右 一 Ｄ Ａ片段就会基本 完全降解 。在需要使用 Ｄ Ａ 分 Ｎ Ｎ 子质 量标准物 （ Ｎ Ｍａｋｒ作毛 细管 电泳条件实 Ｄ Ａ ｒｅ） 验时 ， 往往需要 大量的 Ｄ Ａ样 品试 剂 ， Ｎ 而这些 Ｄ Ａ Ｎ 试剂一般价 格都较 昂贵 。 实验 中有时 由 Ｐ Ｒ扩增 在 的 Ｄ Ａ样 品溶 液 的离 子强度 较 高 ， 导 致 毛细 管 Ｎ 会 电泳分 离效率降低 ， 分离度不 能满足要求 ［。 品堆 ２样
的影 响 ， 们 用 它 考 察 了样 品稀 释对 电动 进 样 后 我 Ｄ Ａ 片段分离 的影 响 ， 如图 ２ Ｎ 结果 所示 。从 图 ２ 可
以看出，Ｂ ３２Ｈ ｅ Ｄ Ａ样品稀释 １倍后， ｐＲ ２－ａ Ｎ ０ 峰
高变化 不明显 ， 线噪声明显增大 ， 分离度有 所 虽基 但 改 善 ， 现 在 ８９ 即 １３ ４ 峰发 生 了明 显 的分 表 ／ （ ２／２ ）
４ ｄ ８ １ ２ ，．５ ４ ３ ０ ７ ４ ３ ２ ５ ３ １ ．６ ５ ，７ ４ ６ ．２ １ ０ ，（ ）． ．１ ５ ２ ６ ，．２ ２ ， ．２ ２ ，．４ ６ ，６ ５ ７ ．９ １ ，８ ３ ３ ．
如果将样 品稀 释
得
倍 后进 样 ， 则其 中各 离子 的
浓度降低 倍， ｉ ｓ Ｃ＝Ｃ／， 即Ｃ ＝Ｃ ／， ｓ 代入式（） ２
积（ａ ｐ ｓ ｒｉ ） ｓｍ ｌ ｔ ｋ ｇ作为一种提高毛细管电泳检测 ｅ ｎ ａ
灵敏度的柱上浓缩方法 ， 由于其 简便易行 ， 得到 近来
了 越来越广泛的应用［４ 样品堆积是通过将分析样 ３。 ，
品溶 于离子强度低于 电泳载 体缓 冲溶 液后再进行 流
载体电解质溶液采用 １ Ｔ Ｅ缓冲溶液， ９ Ｂ 由８