利用SMART技术构建烟草茎全长cDNA文库

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SMART cDNA Library Construction Kit

SMART PCR cDNA Synthesis Kit可以用来与Clontech™ PCR-Select™ cDNA差减技术一起使用。总RNA不能直接用来做差减实验，但可以通过SMART PCR cDNA Synthesis Kit来扩增出高质量的cDNA，从而可以用作杂交实验。同样，少量的Poly A+ RNA也可以用SMART PCR cDNA Synthesis Kit来扩增。SMART cDNA也可以在你仅有有限的RNA样本时从来做虚拟的Northern杂交，用来代替标准的Northern杂交。SMART PCR cDNA Synthesis Kit含有SMARTⅡ寡苷酸和cDNA合成引物，两段序列都具有用来做Clontech™ PCR-Select差减所需的RsaⅠ位点。该RACE cDNA Amplification Kit结合了SMART cDNA合成技术和RACE的方法。该试剂盒优点在于可以构建全长cDNA,无需接头连接，灵敏度强，肌球蛋白cDNA。即使起初材料用的是总RNA，也几乎不会筛选到核糖体RNA。DNA Library Construction Kit是用r供体载体pDNR- PCR-Select™ cDNA差减杂交试剂盒不能配合使用。
表明没有核糖体RNA克隆。以50 ng总RNA或者25 ng poly A&#nd Hoffman方法以5 uDNA合成过程中rRNA可以被反转录，但这些序列在接下来的PCR过程中不会被扩增。这是因为多数情况下，rRNA序列是通过自身引导来反转录的，所以最终得到的cDNA片段不具备5'和3'SMART特异性序列，不能够进行指数PCR扩增。
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基因工程试卷2

华中农业大学本科课程考试评分标准考试课程与试卷类型：基因操作原理姓名：学年学期：学号：考试时间：班级：一、填空题（每小题2分，共30分）1.PCR技术应用广泛，以下不属于PCR应用的为 ___D_____：(A) 随机扩增多态性DNA(RAPD)； (B) 扩增片段长度多态性(AFLP)； (C) RACE； (D) S1 酶作图。

2.λ噬菌体线性 DNA 分子的两端各有一个____12_____个碱基组成的天然黏性末端。

3.PCR扩增有时会出现弥散的条带，以下原因阐述不正确的是___B______：(A) 退火温度过低； (B) 退火温度过高； (C) dNTP 浓度过高； (D) 循环次数过多。

4.下列哪一种酶作用时需要引物____B_____：(A) 末端转移酶； (B) 反转录酶；(C) DNA连接酶； (D) 限制酶。

5.Cosmid 实际上是由_λ噬菌体__和__质粒_____构成的杂合载体，也可以说是带有__cos__序列的质粒。

6.限制性内切酶的命名主要根据__来源菌株属名第一个字母，种名头两个字母以及菌株号、序号_____来确定，以下各种书写方式中哪种或哪几种是正确的____AC____：(A) Pst I;(B) KpnI； (C) Hin dIII; (D) Hind III; (E) T th111I; (F) Bsp1286I； (G) XbaI7.在分子克隆常用的E.coli菌株中Dam 和Dcm 甲基化酶都是有活性的，它们可在DNA的特定位点作甲基化修饰。

而许多限制性内切酶对甲基化是敏感的，一旦所识别的酶切位点被甲基化就不能切割该位点，如Cla I (AT/CGAT)。

请问Cla I不能切割以下哪个或哪些来自dam+ dcm+ E.coli菌株的DNA序列____C_____。

(A) ATCGATA； (B) ATCGATG；(C) ATCGATC； (D) ATCGATT。

cDNA文库试剂盒比较

Invitrogen的:
采用的是Gateway技术：利用λ噬菌体位点特异重组系统的BP和LR双向反应，首先将PCR产物用传统方法克隆到Gateway化的入门载体，这个目标基因就可以迅速方便而且定向地重组到任何Gateway化的表达载体上.
优点:
1无需限制酶切、无需连接，只要利用重组酶就可以穿梭于任何 Gateway化的表达载体间，典型的克隆效率高达95％以上，保证正确的方向和阅读框。
2特别适合研究一个基因在不同表达系统中的表达,对于后续的工作有利。
缺点:
1无论是Gateway还是Topo，封闭的系统仅适用于Invitrogen提供的表达载体，使得适用成本高。而且在启动子和目的基因间必需插入一段特定的噬菌体重组酶识别序列，对表达的影响不好估计。
2所得的并非都是全长cDNA
有不对之处忘大家指正
Clontech的:
采用的是SMART与Infusion技术：合成引物时两端对应加入任意一种线性化载体两端15个碱基，PCR扩增目标基因后就可以利用重组酶直接将目标基因定向重组到任意指定表达载体上的指定位点。
优点：
1采用SMART技术,可以方便的得到全长cDNA.
2开放的技术平台，任何质粒、任何目的基因都能适用。
3使得PCR产物克隆彻底摆脱了中间载体、重复亚克隆重复筛选的烦恼，一步到位，不受载体和酶切位点的限制，不用连接、补平、磷酸化，也不受PCR产物末端影响，而且速度快（30min），重组效率高达90%。
4在载体启动子和目的基因之间不会增加额外的碱基，真正精确定向克隆。
5Infusion试剂以冻干形式提供，可以在室温缺点：
不适用于一对多的克隆，目的基因无法在不同载体间穿梭。针对每个载体均要合成特定的引物进行PCR。

全长cDNA文库的构建—SMART技术

【共享】全长cDNA文库的构建—SMART技术全长cDNA文库的构建—SMART技术真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA 的末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。

但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA（即RACE），曾经是一个令人困扰的问题。

常见的做法是在合成cDNA的双链后在两端连上接头，利用已知的接头序列再进行扩增，或者是利用末端转移酶在双链cDNA的3'末端加上一连串的G或者C（或者A/T），再通过补齐粘末端，利用已知的两头序列进行扩增。

但是这些方法不同程度的存在一些问题，比如接头的连接效率非常有限，会导致部分信息的丢失，再加上这些方法需要多次用不同的酶处理有限的样品，需要经过反复的纯化，会损失很多有用的信息，特别是少量样品中的低丰度信息，很大程度上会影响结果的准确性。

另外由于mRNA容易部分降解，很难确定得到的cDNA是否就是全长的cDNA，还是cDNA的片断。

SMART技术的出现是一个新的里程碑。

这个称作Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript(SMART)，原理实际上非常简单：在合成cDNA的反应中事先加入的3'末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo（dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA 单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。

烟草腺毛全长cDNA文库的构建

烟草腺毛全长cDNA文库的构建
烟草腺毛全长cDNA文库的构建
冻刷法收集烟草品种K326腺毛组织,Trizol法提取总RNA,采用SMART技术构建了烟草腺毛的全长cDNA文库.经鉴定表明,文库滴度为1.01×106pfu/mL,重组率为99.5%.随机选择24个阳性克隆进行插入片段测序,结果显示,插入片段长度在800～1 000 bp之间,将测得的序列进行Unigene归并和序列全长分析,得到了23条Unigene,21条序列有相关同源信息,其中14条为全长,完整性比率达到66.7%.结果表明,文库质量较好,可用于下一步基因克隆及基因表达谱的研究.
作者：崔红冀浩张华陈亮CUI Hong JI Hao ZHANG Hua CHEN Liang 作者单位：崔红,冀浩,张华,CUI Hong,JI Hao,ZHANG Hua(河南农业大学,国家烟草栽培生理生化研究基地,河南,郑州,450002) 陈亮,CHEN Liang(厦门大学生命科学学院,福建,厦门,361005)
刊名：厦门大学学报(自然科学版) ISTIC PKU英文刊名：JOURNAL OF XIAMEN UNIVERSITY (NATURAL SCIENCE) 年，卷(期)：2006 45(6) 分类号：Q785 关键词：烟草腺毛 cDNA文库。

铁皮石斛均一化全长cDNA文库的构建与序列分析

铁皮石斛均一化全长cDNA文库的构建与序列分析目的：为了获得药用植物铁皮石斛功能基因的信息和筛选功能基因。

方法：以SMART（switching mechanism at 5′ end of RNA transcript）方式合成全长cDNA，结合DSN（duplex-specific nuclease）均一化技术，构建铁皮石斛茎组织的均一化全长cDNA 文库。

结果：该文库重组率为93.9%，文库滴度1.3×106 cfu·mL-1，插入片段平均大小1.5 kb 左右。

随机挑取163个阳性克隆进行单侧测序，通过生物信息学分析，获得150个单一序列，其中147个序列与相应的同源蛋白匹配，GO（gene ontology）分类表明这些序列参与各种生化途径。

8个序列包含了完整编码框，可判断为全长基因。

结论：成功构建了铁皮石斛茎组织均一化全长cDNA 文库，为满足铁皮石斛代谢途径等功能基因筛选和基因信息研究奠定了基础。

标签：铁皮石斛；均一化；cDNA 文库；序列分析铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo是兰科Orchidaceae石斛属多年生草本植物，具有独特的药用价值，为我国名贵中药材。

铁皮石斛以其茎入药，其主要药用成分是石斛多糖、石斛碱、石斛次碱及多种氨基酸及微量元素，有生津益胃、清热养阴及增强人体免疫活性等功效，主要分布于我国云南、广西、浙江、安徽、福建、四川等省区[1]。

铁皮石斛种子小无胚乳，自身繁殖力低，在自然条件下需与某些真菌共生才能萌发，加上人为的过度采挖，其自然资源濒临枯竭[2]。

近些年铁皮石斛的组织培养与栽培管理技术的突破性发展[3]，使得人工栽培铁皮石斛逐渐成为一个新兴产业。

由于对天然药物需求的不断增加，解决药物资源匮乏问题一直存在，从20世纪90 年代开始，药用植物功能基因的克隆呈现发展势头[4]。

通过确定药用植物的功能基因，发展药用植物的基因工程，获取药用植物的药用成分，这些都依赖药用植物的功能基因研究开发。

烟草腺毛全长cDNA文库的构建

第45卷　第6期厦门大学学报(自然科学版)Vol.45　No.6　2006年11月Journal of Xiamen University (Nat ural Science )Nov.2006　烟草腺毛全长cDNA 文库的构建崔　红1,冀　浩1,张　华1,陈　亮23(1.河南农业大学,国家烟草栽培生理生化研究基地,河南郑州450002;2.厦门大学生命科学学院,福建厦门361005)收稿日期:2006205219基金项目:国家烟草局资助(110200101005)作者简介:崔红(1966一),女,博士,副教授.3通讯作者:chenlg @摘要:冻刷法收集烟草品种K326腺毛组织,Trizol 法提取总RNA ,采用SMAR T 技术构建了烟草腺毛的全长cDNA 文库.经鉴定表明,文库滴度为1.01×106pf u/mL ,重组率为99.5%.随机选择24个阳性克隆进行插入片段测序,结果显示,插入片段长度在800～1000bp 之间,将测得的序列进行Unigene 归并和序列全长分析,得到了23条Unigene ,21条序列有相关同源信息,其中14条为全长,完整性比率达到66.7%.结果表明,文库质量较好,可用于下一步基因克隆及基因表达谱的研究.关键词:烟草;腺毛;cDNA 文库中图分类号:Q 785 文献标识码:A 文章编号:043820479(2006)0620859204 烟叶香气是评定烟叶品质的重要指标,长期以来依靠感官进行评价.随着色谱、质谱、核磁共振等分析技术的发展,使得对烟叶香气成分的分离和鉴定成为可能[1],但由于香气物质组成和代谢的复杂性,至今仍不能对香气形成的机理和香型的划分找到可靠的理论依据和指标体系,使得通过品种选育和农艺措施改进来提高烟叶香气品质的研究存在一定的盲目性.由于烟叶香气品质的形成,是诸多与香气物合成相关基因的特异性表达结果,因而只有从香气物合成相关基因的筛选、克隆,及其表达谱的研究入手,才可能从根本上阐明烟叶香型形成的分子机理,从而实现对烟叶香气质量及风格的有效调控.烟草叶片腺毛分泌物与烟叶香气品质和抗性之间的密切关系已被诸多的生产实践和科学研究所证实[2].同位素示踪实验表明,烟草叶面分泌物的主要成份双萜烯类化合物和糖酯,是在可分泌腺毛的腺头部分合成的[3].腺毛分泌细胞作为类萜代谢和糖酯代谢的主要场所,无疑是烟草香气物质合成的重要部位.由于腺毛分泌细胞中存在着特异的代谢途径,因而富集相关的表达序列,是进行香气相关基因克隆的首选材料.华盛顿大学Croteau [4]研究组通过构建薄荷分泌细胞的EST 文库,发现48%的序列与薄荷精油合成有关,并由此克隆了新基因脱氧木酮糖252磷酸还原异构酶(dxr ),并将其转化薄荷,转基因薄荷的精油产量可提高50%,而且成分稳定.这是利用EST 策略从腺毛中成功克隆新基因的实例,也开创了利用代谢途径工程富集目的化合物进行香精香料、医药用品以及农药生产和农作物品种改良研究的先河,为烟草香气品质的改良展示了极具诱惑力的应用前景.Kent ucky 大学的Wagner 研究小组建立了高分泌腺毛种质TI1068的腺毛cDNA 文库,并从中分离得到腺毛特异基因P450羟化酶基因,证明了该基因的表达与蚜虫抗性密切相关[5];同时该小组还首次克隆腺毛特异启动子,为烟草腺毛代谢途径调控奠定了基础[6].本实验中,我们成功构建了烟草腺毛全长cDNA 文库,为进一步对烟草香气物合成相关基因进行深入研究,探索烟叶香气品质形成的分子机理以及进行烟草香气基因工程育种奠定了基础.1　材料与方法1.1　材料收集烟草品种K326种植于河南农业大学科教园区实验地.根据Erming [7]所用方法进行改良.八月中下旬,挑选品种纯度高,成熟度好,叶片完整,健康未感病的烟草中部叶片,于收集前一天用清水冲洗选中的烟草叶片.叶片在液氮中冻存5min 后,选用硬度适中的刷子,沿主脉从叶基向叶尖方向刷,腺毛收集在冻存管里,于液氮罐中保存.1.2　腺毛总RNA 提取按照GIBCO BRL 公司的Trizol reagent 说明书上的操作规程进行.将0.56g 腺毛组织放入碾钵,在液氮中研磨至粉末状,转至匀浆管,加入5.5mL Tr 2izol 匀浆;氯仿抽提,异丙醇沉淀,75%乙醇洗涤沉淀晾干,Milli 2Q 水溶解沉淀,进行分析和检测.1.3　腺毛双链cD NA 合成取3μL 样品于灭菌离心管中,按照试剂盒说明加入相应的试剂和引物,合成cDNA 第一链.采用LD PCR 法合成双链cDNA ,按照试剂盒说明添加试剂和引物,反应在已预热到95℃的H Y BA ID PCR EX 2PRESS PCR 仪上进行,95℃变性15s ,68℃延长6min ,共30个循环.取反应产物5μL 在1.1%琼脂糖凝胶上进行电泳检测.1.4　双链cD NA 的酶切及分级分离取50μL 扩增的dscDNA (2～3μg )至0.5mL 灭菌的离心管中,加入蛋白酶K ,经酚:氯仿:异戊醇抽提、乙醇沉淀后,用限制性内切酶S f i I 酶切,然后通过C HROMA SPIN 2400柱子分离纯化,依次收集经分离纯化的cDNA 共10管,1.1%琼脂糖凝胶电泳检测cDNA 含量及片段大小.1.5　双链cD NA 与pB luescript ⅡSK 载体连接对pBluescript II S K 载体进行改造,将EcoR I 和N ot I 之间的序列改造为S f i I A 和S f i I B 接头序列.酶切以后,分离纯化后的cDNA 定向连接到该载体上(S f i I A →S f i I B ).连接反应按试剂盒说明进行,cDNA 与载体浓度比为3:1.1.6　重组质粒的转化取200μL 感受态宿主菌(D H 25α)至灭菌的50mL 离心管中,放置冰水浴融化,加入上述1μL 连接液,轻轻混匀后置于冰上45min ,42℃水浴热休克90s ,加入2mL LB 培养基(不含抗生素),37℃摇床,转速≤150r/min ,复苏45min 后,以3000r/min 离心10min 收集菌体,用250μL LB 重悬.1.7　文库质量评价取200μL 菌液涂布于15cm 培养皿上(Ap r 2IP T G/x 2gal LB 固体培养基),37℃过夜,计算菌落数及蓝白斑比例,并根据菌落数计算文库的重组率、库容量和文库滴度[8]:文库滴度=　转化噬菌斑数×稀释倍数×1000μL/mL 所用稀释文库的体积(μL ).随机选择24个克隆质粒进行5′末端测序,以检测插入载体cDNA 片段的大小,并将这24条序列进行Unigene 归并和全长分析,以确定文库的完整性比率.测序工作由上海生物工程技术服务有限公司完成.2　结果与分析在叶片进入成熟期时,腺毛也发育成熟.如图1所示,在显微镜观察下,腺头分泌细胞染色深,细胞质浓　图1　叶片表面腺毛显微图　Fig.1　The trichome of Nicotinan tabacium厚,代谢旺盛,是收集腺毛的最佳时期.收集腺毛时,既要避免病毒细菌的污染,也要避免叶片组织的混杂,更重要的是要防止RNA 的降解.我们选取健壮、发育良好、无病虫害的叶片,清洁后迅速浸泡在液氮中5min ,再用软毛刷沿中脉小心刷取腺毛,收集在冻存管中液氮保存.采用Trizol 法提取腺毛组织RNA ,共获得总RNA 约0.95μg ,经分光光度计测定,OD 260/OD 280=1.924,表明总RNA 无DNA 、蛋白质和小分子污染.DEPC 水稀释总RNA ,终浓度为0.095μg/μL.将总RNA 做两种处理,如图2所示,1和2分别为总RNA在70℃、4℃保温60min 后经1.1%琼脂糖电泳检测的结果,呈现清晰无拖尾的两条带:23sRNA 、18sR 2NA ,且23sRNA 为18sRNA 亮度的两倍,电泳结果进一步说明总RNA 质量较好,符合建库条件[9].采用LD 2PCR 法合成双链cDNA ,经1.1%琼脂糖电泳检测,整个条带呈弥散状态,且主要分布于1600bp 附近,说明经逆转录和PCR 后的cDNA 片段长度,符合建立全长cDNA 库要求(图3).　图2　总RNA 的电泳图谱1.70℃破坏条件下;2.4℃环境条件下　Fig.2　Electrophoresis of total RNA合成的双链cDNA 带有S f i I 的酶切位点,经蛋白酶消化和S f i I 酶切后,经Chroma spin 2400柱进行分离和纯化,共收集8管.经1.1%琼脂糖电泳检测,·068·厦门大学学报(自然科学版) 2006年　图3　双链cDNA 电泳图1.双链cDNA ;M.Marker　Fig.3　Electrophoresis of dscDNAcDNA 片段与酶切处理前cDNA 片段大小基本一致,主要分布于1600bp 附近,说明酶切正常,未引起cD 2NA 的降解(见图4).收集4～8号收集管,乙醇沉淀cDNA.按3:1的比例与载体pBluescript II S K 的改造体进行连接.连接产物转化感受态宿主菌(D H 25α),涂布在Ap r 2IP T G/x 2gal LB 固体培养基上,过夜后统计菌落数及蓝白斑比例.菌落数平均为1012/板;其中蓝斑数比例较低,大约为5/板,重组率约99.5%.这是由于改造后的pBluescript II S K 载体两臂上,分别带有S f i I 的不对称位点,避免了载体自连所至.所得库容量为1.01×106pf u/mL ,每管20μL 分装,-80℃冰箱保存.　图4　双链cDNA 限制性内切酶S f i I 消化,过CHRO 2MA SPIN 2400柱分离纯化电泳图谱1～8.分别为8个收集管;M.G ibco/BRL 公司的1kb DNA ladder (12216、11198、10180、9162、8144、7126、6108、5090、4072、3054、2036、1636、1018、506、396、344、298、220、201、154、134、75bp )　Fig.4　Electrophoresis of dscDNA of S f i I digestion andcDNA size f ractionation by CHROMA SPIN 2400为了对文库进行快速鉴定,随即选取24个克隆进行5’末端测序,并对测序结果进行Unigene 归并.在得到的24条有效序列中,有23条为Unigene ,Uni 2gene 比例为95.8%.同时对序列进行全长分析,在24条序列中有21条序列有相关同源信息,其中14条为全长,所以完整性比率:14/21×100%=66.7%.说明所建的烟草腺毛cDNA 文库具有较高的质量.3　讨　论烟草腺毛作为烟草香气物合成的主要场所,其cDNA 文库中富集香气物合成相关的特异表达序列,是目的基因克隆有效工具.但由于腺毛的分离与收集具有较大的难度,所以迄今为止,关于腺毛cDNA 构建和利用的报道并不多见[9].我们采用冻刷法,收集了足量未受叶片组织混杂的腺毛组织,采用Trizol 法提取了高质量的、未发生降解的总RNA ,并采用SMAR T 2cDNA 文库构建试剂盒进行文库构建.SMA R T 技术反转录的cDNA 包含mRNA 完整的5′端及SMAR T III 寡核苷酸的互补序列,在通过LD PCR 合成cDNA 第二链时,那些过早终止逆转录的非全长cDNA ,因没有SMAR T III 寡核苷酸而不能被扩增.扩增的双链cDNA 与改造后的pBluescript II S K 载体进行重组,该载体具有S f i I A和S f i I B 接头序列,便于cDNA 的简便、快速的定向克隆,重组分子转化D H 25α宿主菌,构建了完整的烟草腺毛全长cDNA 文库.该文库库容量为1.01×106cf u/mL ,重组率为99.5%,插入片段平均为800bp ,全长性比率为66.7%,文库质量达到预期要求.高质量烟草腺毛cDNA 文库的建立,将为烟草香气物合成相关基因的筛选和克隆奠定基础.在此基础上,利用芯片技术对不同类型烟叶、不同生态条件下香气物合成相关基因的表达模式,进行比较研究,有利于深入探索烟叶香气品质形成的分子机理,为栽培措施调控、品种选育和基因工程改良提供理论依据,促进烟草香气品质改良工程的发展.参考文献:[1]　史宏志,刘国顺.烟草香味学[M ].北京:中国农业出版社,1998.[2]　陈淑珍,高致明.烟草叶片腺毛发育及分泌活动对烟叶品质的影响[J ].烟草科技,1993,4:32-36.[3]　Wagner G.Leaf surface chemistry[M ]ΠΠDavis L ,NielsenT.Tobacco :Production ,Chemistry and Technology.Ox 2ford :Blackwell Science Limited ,1999.[4]　Lange M ,Croteau R.Isoprenoid biosynthesis via a Meval 2onate Pathway in plant :cloning and heterologous expressof 12deoxy 2D 2xylulose 252phosphate reductoisomerase f romPeppermint [J ].Archives of Biochemistry and Biophysics ,·168·第6期崔　红等:烟草腺毛全长cDNA 文库的构建1999,365:170-174.[5]　Erming W ,Joseph D P.Suppression of P450hydtoxylasegene in plant trichome glands enhances natural 2product 2based aphid resistance [J ].Nature Biotechnology ,2001,19:371-374.[6]　Mahmoud S ,Croteau R.Metabolic engineering of essentialoil yield and composition in mint by altering expression of deoxyxylulose phosphate reductoisomerase and menthof u 2ran synthase [J ]A ,2001,98(15):8915-8920.[7]　Wangner G J ,Wang E ,Shepherd R W.New approachesfor studying and exploiting an old protuberance ,the planttrichome[J ].Annals of Botany ,2004,93:3-11.[8]　曹亚.实用分子生物学操作指南[M ].北京:人民卫生出版社,2003.[9]　高健,许晓风.特异种质烟草全长cDNA 文库的构建及质量分析[J ].安徽农业大学学报,2004,31(1):22-25.Construction of Full 2length cD NA Library fromT richomes of Nicotinan T abaciumCU I Hong 1,J I Hao 1,ZHAN G Hua 1,C H EN Liang 23(1.National Tobacco Cultivate Physiology and Biochemistry Research Centre ,Henan Agricultural University ,Zhengzhou 450002,China ;2.School of Life Sciences ,Xiamen University ,Xiamen 361005,China )Abstract :A novel cold 2brushing method was used to isolate the trichomes f rom leaves of tobacco K326.Total RNA was extractedby Trizol method and the full 2length cDNA library was constructed using the SMAR T (switching mechanism at 5end of RNA tran 2script )technology.According to the results ,the recombination rates was 99.5%and the titer of the amplified library was 1.01×106pf u/mL.24positive clones were selected randomly and sequenced ,the results indicated that the size of inserts was about 800～1000bp.Merging the 24sequences and 23unigenes were obtained .Sequence analysis results indicated that 21sequences were found that they have significant similarity with data in GenBank and 14of them were the full 2length sequences.These results indicated thatthe library is of a high 2quality library for cloning target genes and for the f urther study in gene expression profile analysis.K ey w ords :nicotinan tabacium ;trichome ;cDNA library·268·厦门大学学报(自然科学版) 2006年。

利用DSN和SMARTTM技术构建绿僵菌产孢时期均一化全长cDNA文库

农业生物技术学报 Journal of Agricultural Biotechnology 2007,15(5):884~887*基金项目：国家自然科学基金（No.30170630）和重庆市重点自然科学基金(No.8564)资助。

**通讯作者。

Author for correspondence.教授，主要从事病原真菌与寄主昆虫之间相互作用的分子机理研究以及杀虫真菌农药研制。

EMail:<Yuxianxia@>. 收稿日期：20070109 接受日期： 20070315 ·研究论文· 利用 DSN 和 SMART TM技术构建金龟子绿僵菌产孢时期均一化全长cDNA 文库 *张石柱，王中康，彭国雄，曹月青，殷幼平，谢磊，刘静，夏玉先 **(重庆大学生物工程学院基因工程研究中心，重庆市杀虫真菌农药工程技术研究中心，功能基因及调控技术重庆市重点实验室，重庆 400030) 摘要：为高效获得与绿僵菌产孢相关的全长 cDNA ，采用 DSN （duplexspecific nuclease ）均一化技术与 SMARTTM(switching mechanism at 5忆 end of RNA transcript) 建库技术相结合的方法，构建了杀虫真菌金龟子绿僵菌（ var.)菌株 CQMa102产孢时期的均一化全长 cDNA 文库。

经检测，原始文库滴度为2.1伊 10 6 cfu/mL ，库容量超过6伊 10 6。

随机挑取 100个克隆，PCR 方法测得文库重组率大于95％,插入片段平均长度1500bp 。

小规模测序分析表明，全长基因的比例超过60％。

对组成性表达基因 3磷酸甘油醛脱氢酶和微管蛋白均一化前后丰度检测表明，其丰度均有大幅度的下降，基本满足节约筛库的要求。

cDNA文库构建知识

全长cDNA文库的构建—SMART技术真核细胞的mRNA在加工过程中有一个比喻为“穿鞋戴帽”的过程，因此mRNA的3'末端都带有一段Poly A，这是利用逆转录酶制备cDNA文库的基础。

但是由于cDNA的5'端的序列各不相同，如何获得全长的cDNA，如何扩增由微量的mRNA逆转录得到的cDNA 文库、如何利用已知片断序列得到全长的cDNA（即RACE），曾经是一个令人困扰的问题。

另外由于mRNA容易部分降解，很难确定得到的cDNA是否就是全长的cDNA，还是cDNA的片断。

SMART技术的出现是一个新的里程碑。

这个称作Switching Mechanism At 5' end of the RNA Transcript(SMART)，原理实际上非常简单：在合成cDNA的反应中事先加入的3'末端带Oligo（dG）的SMART引物，由于逆转录酶以mRNA为模板合成cDNA，在到达mRNA 的5'末端时碰到真核mRNA特有的“帽子结构”，即甲基化的G时会连续在合成的cDNA末端加上几个（dC），SMART引物的Oligo （dG）与合成cDNA末端突出的几个C配对后形成cDNA的延伸模板，逆转录酶会自动转换模板，以SMART引物作为延伸模板继续延伸cDNA单链直到引物的末端，这样得到的所有cDNA单链的一端有含Oligo（dT）的起始引物序列，另一端有已知的SMART引物序列，合成第二链后可以利用通用引物进行扩增。

SMARTer RACE-SEQ技术

SMARTer RACE-SEQ技术一、背景与原理（一）RACE概念RACE：Rapid-amplification of cDNA ends，是通过PCR进行cDNA末端快速克隆的技术。

它是由已知的一段cDNA片段，利用PCR，快速扩增cDNA末端，从而获得目的基因3’或5’端序列的技术。

（二）基本原理（1）本实验室采用商业化的SMARTer RACE 5’/3’试剂盒（TAKARA；634860）以及其提供的方法进行RACE-SEQ实验。

SMART技术提供了在逆转录反应中产生全长cDNA的方法。

（2）通过SMARTer II A寡核苷酸和SMARTScribe逆转录酶的联合作用实现。

（3）oligo（dT）可以与polyA互补配对，通过逆转录酶的活性进行逆转录；（4）SMART Scribe逆转录酶有逆转录酶活性和末端转移酶活性。

当SMART Scribe逆转录酶到达RNA 5’末端时，其末端转移酶活性在第一链的cDNA的末端添加上额外的dC，可以与RNA的5’末端帽子结构的dG配对。

（5）SMARTer II A寡核苷酸充当反转录的模板，SMARTScribe逆转录酶将模板从mRNA分子切换到SMARTer寡核苷酸，最后用额外的SMARTer序列产生原始RNA的完整cDNA拷贝。

由于逆转录酶的模板转换活性仅在酶到达RNA模板末端时才发生，SMARTer序列通常仅被整合到全长的第一链cDNA中。

（在逆转录之后，SMART技术允许第一链cDNA直接用于5'-和3'-RACE PCR反应。

在第一链cDNA合成期间在一步中掺入通用引物结合位点消除了繁琐的第二链合成和衔接子连接的需要。

这种简单高效的SMARTer cDNA合成方法可确保扩增目的cDNA更高的特异性。

抑制PCR和逐步PCR技术，结合SMARTer技术可以减少RACE PCR中的背景扩增。

）（三）基本要求与用途1.要求SMARTer RACE 从DNA扩增的唯一要求是知道目的基因上至少23-28 nt的序列信息，以用于基因特异性引物（GSP）的设计。

烟草基因组计划进展篇：1.烟草全长cDNA文库的构建及分析

分离分值，鉴定了大量的编码区ＳＮＰ（ｃｏｄｉｎｇＳＮＰ，ｃＳＮＰ）【９］。共
计３１７１７５条普通烟草ＥＳＴ拼接成至少包含４个读长的重叠群１５４２９个，鉴定出５３４７７个冗余度大于２的候选ＳＮＰ，烟草中出现ＳＮＰ的频率为Ｏ．３４％。其中ＳＮＰ的转换率大于颠换率，插入／删除表现出Ａ／Ｔ偏
中国烟草科学
ＣｈｉｎｅｓｅＴｏｂａｃｃｏＳｃｉｅｎｃｅ
烟草基因组计划进展篇：
１．烟草全长ｃＤＮＡ的构建及分析龚达平
（中国农业科学院烟草研究所，青岛２６６１能提供完整的基因编码区信息，揭示基因的表达水平，特别是基因组测序完成后对辅助基因注释和开展功能基因研究具有重要作用。普通烟草（Ｎｉｃｏｔｉａｎａ
（ｓｉｎｇｌｅｔｓ）４２９３条，共得到５７０１个非冗余基因，其中全长基因数量为１６１１条。对绒毛状烟草共测序１１２９３个克隆，获得长度大于１００ｂｐ的高质量序列１０４５０条，平均序列长度为６４１ｂｐ；通过组装得到重叠群１２０２条，单一序列３６０６条，共得到４８０８个非冗余基因，其中全长基因数量为１６３９条。
烟草材料因信息和筛选重要功能基因，同时还开展了绒毛状烟草、林烟草、耳状烟草
（ Ⅳｏｔｏｐｈｏｒａ）和栽培烟草的根、茎、叶、花等主要组织共１６个样品的转录组测序及分析。

烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定

烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定以《烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定》为标题，近年来以CDNA技术为主要研究技术的生物识别领域发展迅速，烟草，作为世界上最常见的特殊作物，是基因工程实验的重要模式植物。

因此，烟草优质品种的花全长cdna文库构建和质量鉴定是非常重要的。

本文基于现有技术和数据，综述了烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定的原理、方法和实践。

由于烟草作物具有特殊的结构和分子特性，烟草花蕊组织是花全长cdna文库构建的主要材料，其具有高等生命特性。

因此，构建烟草优质品种花全长cdna文库的技术原理主要有以下四点：（1）采集和筛选烟草花蕊组织;（2）烟草花蕊组织的破裂、抽提、纯化和检测;（3）烟草花蕊组织cdna的文库构建;（4）文库的质量检测和鉴定。

在烟草优质品种花全长cdna文库的构建方法中，采用烟草花蕊抽提cdna的方法来构建文库，这是一种新型的cdna文库构建方法。

该方法可以有效提高文库构建的效率，避免无效cdna的异常累积。

在质量鉴定方面，主要通过计算文库深度和宽度，鉴定全长文库的覆盖率，检测文库中的cDNA来进行鉴定，以保证烟草优质品种花全长cdna文库的质量。

目前，烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定技术已取得了较好的效果，成功构建了大量的花全长cdna文库，将用于今后烟草基因工程实验等研究。

然而，在构建和质量鉴定过程中，仍然存在着不少问题，比如文库构建效率低、文库覆盖率不足等，需要进一步改进和完善技术流程，以提高文库构建效率和质量鉴定的准确性。

综上所述，烟草优质品种花全长cdna文库的构建和质量鉴定是烟草基因工程实验的重要前提，也是进行后续研究的基础。

未来，研究者将开展更多的实验研究以改善文库构建和质量鉴定技术，更深入地研究烟草基因工程实验。

【推荐下载】SMART技术红曲霉全长cDNA文库构建

SMART技术红曲霉全长cDNA文库构建【编者按】医药论文是科技论文的一种是用来进行医药科学研究和描述研究成果的论说性文章。

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SMART技术红曲霉全长cDNA文库构建作者：朱碧云，高蓝，黄欣，李浩明【摘要】目的构建红曲霉cDNA文库，为红曲霉功能基因的研究以及筛选、克隆红曲霉次生代谢产物合成途径相关基因奠定基础。

方法采用SMART(switching mechanism at 5 end of RNA transcript)技术构建红曲霉全长cDNA文库，经涂平板和酶切反应测定文库的克隆数、重组率，PCR测定插入片断的大小。

结果原始文库的库容为2.03 105，重组率达94%。

插入片段大小多在0.7～2.0 kb，平均大小在1 kb左右。

结论所构建文库的代表性和重组片段的序列完整性达到了用于目的基因的分离筛选和克隆表达的建库要求。

【关键词】红曲霉菌cDNA文库SMART Abstract:Objective Construction of Monascus cDNA Library provide foundations for the research of Monascus functional genes and screening,cloning genes related to the synthesis pathway of secondary metabolites in Monascus.Methods A cDNA library was constructed based on SMART system. The number of the clones and the recombination rate of the library were determined by plate coating and restrictive digestion,and the size of inserted fragment was determined by PCR. Results The primary library capacity was 2.03 105，average inserted fragment size was about 1 000 bp and the percentage of recombination were 94%. Conclusion The library met the requirement for cloning target genes and expressing target proteins. Key words: Monascus; cDNA Library; SMART 红曲霉菌(Monascus)是我国重要的微生物资源，其应用已有上千年的历史。

烟草优质品种叶片全长cDNA文库的构建和质量分析

烟草优质品种叶片全长cDNA文库的构建和质量分析曾建斌;陈顺辉;陈华;贺小彦;姜宝杰;张冲;蔡铁城;庄伟建【期刊名称】《中国烟草学报》【年(卷),期】2012(018)001【摘要】为研究优质烟叶的分子基础,以翠碧一号不同生长时期的叶片为材料,CTAB法提取总RNA,利用SMART技术合成全长cDNA,之后按经修改的Clontech技术成功构建了烟草叶片全长cDNA文库.经鉴定,初级文库库容为3.85×106个克隆,重组率为100％,重组子插入片段集中在750-2000 bp之间.随机挑取25个克隆测序后,经生物信息学分析表明,烟草上已经报道的基因占10条,11条为全长基因序列；20条序列有功能注释.综合分析表明,所构建的文库质量较高,达到了基因的分离、筛选和克隆的建库目的.【总页数】7页(P85-91)【作者】曾建斌;陈顺辉;陈华;贺小彦;姜宝杰;张冲;蔡铁城;庄伟建【作者单位】福建省作物分子与细胞生物学重点实验室,福州市金山福建农林大学,350002;福建省烟草专卖局烟草农业科学研究所,福州市,350003;福建省作物分子与细胞生物学重点实验室,福州市金山福建农林大学,350002;福建省作物分子与细胞生物学重点实验室,福州市金山福建农林大学,350002;福建省作物分子与细胞生物学重点实验室,福州市金山福建农林大学,350002;福建省作物分子与细胞生物学重点实验室,福州市金山福建农林大学,350002;福建省作物分子与细胞生物学重点实验室,福州市金山福建农林大学,350002;福建省作物分子与细胞生物学重点实验室,福州市金山福建农林大学,350002【正文语种】中文【中图分类】S572;Q7【相关文献】1.烟草叶片全长cDNA文库构建及EST序列分析 [J], 龚达平;解敏敏;孙玉合2.烟草基因组计划进展篇：1.烟草全长cDNA文库的构建及分析 [J], 龚达平3.绒毛状烟草和林烟草全长cDNA文库构建及EST序列分析 [J], 孙榕;陈明丽;解敏敏;孙玉合;龚达平4.特异种质烟草全长cDNA文库的构建及质量分析 [J], 高健;许晓风;乌慧玲;陈学平;周家昊5.青枯菌诱导的烟草叶片全长cDNA文库的构建和初步分析 [J], 张冲;蔡铁城;陈华;曾建斌;庄伟建因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

中华卵索线虫cDNA文库构建及Sox-3基因部分片段的克隆的开题报告

中华卵索线虫cDNA文库构建及Sox-3基因部分片
段的克隆的开题报告
本文旨在介绍中华卵索线虫cDNA文库构建及Sox-3基因部分片段的克隆的相关工作。

一、研究背景和意义
中华卵索线虫是一种广泛分布于淡水中的寄生线虫，对于了解其生物学特性、分子机制及其与宿主之间的互作有着重要意义。

Sox基因家族是一类与调节细胞分化、增殖、生长和发育密切相关的转录因子，已被广泛研究和应用于许多生物体中。

因此，对中华卵索线虫进行Sox-3基因部分片段克隆工作，有望深入了解其与生命活动相关的分子机制，为相关领域的研究提供参考。

二、研究内容和方法
1.构建中华卵索线虫cDNA文库：根据线虫总RNA提取、纯化，采用SMART技术制备全长cDNA，并进行转录、开环、线性化等步骤，构建成约106个菌落的cDNA文库。

2.Sox-3基因部分片段的克隆：首先设计引物，进行PCR扩增，通过限制性内切酶切割并连接载体，将所得到的文库扩增产物经过转染到细菌中，最终筛选得到所需的Sox-3基因片段。

三、研究预期和意义
通过文库构建和基因片段克隆，可以获得中华卵索线虫的cDNA序列及其Sox-3基因部分片段，为相关领域研究提供了重要物质基础。

此外，可以从其中获取更多信息，如启动子区、翻译区等，有助于深入了解中华卵索线虫的遗传结构和分子机制，为其分类、驱虫药物的研发等方面的研究提供有益的帮助。

634901 SMART cDNA 文库构建实验流程(clontech)

操作一览(PT3000-2)本操作一览仅为实验流程，对于初用者，请在使用操作一览前仔细阅读SMART TM cDNA 文库构建试剂盒(Cat. No. 634901) 的说明书。

A. 第一链cDNA(fs cDNA)合成1. 在0.5-ml 离心管中混匀以下试剂：1–3 μl RNA 样本(对照反应，使用1 μl 的对照RNA)1 μl SMART™ IV Oligonucleotide1 μl CDS III/3' PCR Primer如果总体积<5 μl时，用水补齐至5 μl。

2. 混匀试剂并瞬时离心。

3. 72°C孵育2 min。

冰上冷却2 min。

4. 瞬时短暂离心。

5. 向每管反应中加入以下试剂：2.0 μl 5X First-Strand Buffer1.0 μl DTT (20 mM)1.0 μl dNTP Mix (10 mM)1.0 μl SMARTScribe MMLV Reverse Transcriptase10.0 μl 总体积6. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。

7. 42°C孵育1 hr。

之后的LD PCR（步骤B）操作需在冰上进行。

8.引物延伸合成ds cDNA分别向反应管中加入1 μl 氢氧化钠，68°C孵育30 min，然后进行步骤C。

B. LD PCR扩增合成cDNA1. 在一个新的0.5-ml 离心管中混匀以下试剂：2 μl First-Strand cDNA (from Step A.7)80 μl Deionized H2O10 μl 10X Advantage2 PCR Buffer2 μl 50X dNTP Mix2 μl5' PCR Primer2 μl CDS III/3' PCR Primer2 μl 50X Advantage2 Polymerase Mix100 μl总体积2. 使用枪轻柔地混匀试剂，并瞬时离心。

SMART技术构建红曲霉全长cDNA文库

SMART技术构建红曲霉全长cDNA文库【摘要】目的构建红曲霉cDNA文库，为红曲霉功能基因的研究以及筛选、克隆红曲霉次生代谢产物合成途径相关基因奠定基础。

方法采用SMART(switching mechanism at 5′end of RNA transcript)技术构建红曲霉全长cDNA文库，经涂平板和酶切反应测定文库的克隆数、重组率，PCR测定插入片断的大小。

结果原始文库的库容为2.03×105，重组率达94%。

插入片段大小多在0.7～2.0 kb，平均大小在1 kb左右。

结论所构建文库的代表性和重组片段的序列完整性达到了用于目的基因的分离筛选和克隆表达的建库要求。

【关键词】红曲霉菌 cDNA文库 SMARTAbstract:Objective Construction of Monascus cDNA Library provide foundations for the research of Monascus functional genes and screening，cloning genes related to the synthesis pathway of secondary metabolites in Monascus.Methods A cDNA library was constructed based on SMART system. The number of the clones and the recombination rate of the library were determined by plate coating and restrictive digestion，and the size of inserted fragment was determined by PCR. Results The primary library capacity was 2.03×105，average inserted fragment size was about 1 000 bp and the percentage of recombination were 94%. Conclusion The library met the requirement for cloning target genes and expressing target proteins.Key words: Monascus; cDNA Library; SMART红曲霉菌(Monascus)是我国重要的微生物资源，其应用已有上千年的历史。

刺参管足SMART cDNA文库构建及EST分析

刺参管足SMART cDNA文库构建及EST分析李栋;常亚青;王玉丹;丁君【期刊名称】《生物技术通报》【年(卷),期】2011(000)009【摘要】以大连广鹿岛野生刺参的管足mRNA为材料,利用SMART cDNA Construction Kit构建了表达型cDNA文库.初始文库的滴度为1.3 ×106PFU/mL,蓝白斑估测量组率合格.扩增后获得96 mL文库,滴度为1.8 × 1010PFU/mL,从扩增文库中随机挑取200个噬菌斑进行PCR检测,电泳检测结果表明重组率大于90％,片段大小在0.25 -2.0 kb之间的插入片段占80.4％,文库构建成功.随机选择122个噬菌斑转化为质拉pTriplEx2并测序,测序成功率83.6％,软件处理后100 bp以上的clean ESTs有72条,测通的为65条,占成功测序样品的63.7％.72条序列经SeqMan软件拼接,获得48条conting/singletons,在线Blast比对发现其中26条具有同源序列并获得注释,另外20条可能为新基因,其功能和结构有待进一步利用生物信息学的方法进行分析和研究.【总页数】6页(P193-198)【作者】李栋;常亚青;王玉丹;丁君【作者单位】大连海洋大学农业部海洋水产增养殖学重点开放实验室,大连116023;大连海洋大学农业部海洋水产增养殖学重点开放实验室,大连116023;大连海洋大学农业部海洋水产增养殖学重点开放实验室,大连116023;大连海洋大学农业部海洋水产增养殖学重点开放实验室,大连116023【正文语种】中文【相关文献】1.SMARTer技术构建辣椒黄绿苗突变体叶片全长cDNA文库 [J], 马志虎;孙国胜;张昌伟;杨玉霞;潘跃平2.刺参耐寒基因筛选cDNA文库的构建与分析 [J], 李成泽;王晓燕;丁君;常亚青;3.刺参耐寒基因筛选cDNA文库的构建与分析 [J], 李成泽;王晓燕;丁君;常亚青4.刺参(Apostichopus japonicus)高温胁迫消减cDNA文库的构建与分析 [J], 吉成龙;孙国华;杨建敏;宋志乐;刘相全;王卫军5.仿刺参体壁、肠和呼吸树全长cDNA文库的构建及部分ESTs初步分析 [J], 周遵春;赫崇波;杨爱馥;陈仲;高祥刚;姜北;胡景杰因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。