第一课执业药师复习资料6

三、各种色谱法
色谱法分类
按两相状态分:
气相色谱法 气—固色谱法 气—液色谱法
液相色谱法 液—固色谱法 液—液色谱法
按操作形式分： 柱色谱法 平面色谱法 电泳法
按分离机制分: 分配色谱法 吸附色谱法 离子交换色谱法 空间排阻色谱法 亲合色谱法等
（一）薄层色谱法
薄层色谱法（thin layer chromatography， TLC）是将固定相铺于平板上，利用流动相 的毛细现象推动组分迁移，由于不同组分在 两相间分配特性或吸附作用的差异，而得以 分离的色谱方法。与其他色谱方法相比，薄 层色谱法具有操作简便、分析快速、应用广 泛等特点 。
（二）保留参数
色谱图（chromatogram）是由组分在柱中的浓度与 流出时间作图形成的曲线。描述曲线特征的各种保 留参数（retention parameter），反映了组分在色 谱柱中的作用和分离特性。
1．保留时间 组分从进样开始到柱后该组分出现峰 值浓度时，所需的时间称为保留时间（retention time，tR）。而不保留组分从进样开始到出柱时， 所需的时间称为死时间（void time，t0 ）。
4.仪器: 高效液相色谱仪由输液泵、进样器、色谱柱、检测器 及色谱工作站等组成。
检测器：常用的有紫外检测器、荧光检测器 和电化学检测器等。由于要求在线检测，检 测池的体积（1μL ~ 8μL）很小，并能耐一定 压强。
5.应用
(1)定性鉴别:用保留值鉴别 ; (2)检查: 同GC.
内标法加校正因子测定供试品中某个杂质的含量; 外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量; 加校正因子的主成分自身对照法; 不加校正因子的主成分自身对照法; 峰面积归一化法 ; (3)含量测定:同GC.内标法、外标法
(2)液–液分配色谱法
固定相和流动相为两种互不相溶的液体构成的 分离体系，不同组分在两相间的分配作用大小是其 分离的基础。
化学键合固定相: 通过化学键合反应合成的、 表面键合有不同有机基团的刚性颗粒。根据化学键 合固定相和流动相的极性，将液–液分配色谱法分 为正相色谱法和反相色谱法两类，而后者是最常用 的高效液相色谱方法。
１．原理：分配系数的不同，引起差速迁移．
２．比移值：
组分原点中心至展开后 斑点中心的距离 Rf 组分原点中心至展开剂 前沿的距离
３．色谱展开 在流动相的作用下，组分在铺有固定 相的平板上进行差速迁移而逐步被分离的过程称为 色谱展开。通常将铺有固定相的平板称为薄层板， 将流动相称为展开剂。对展开后的薄层板，组分斑 点在薄层板中的位置是其定性分析的依据，而组分 斑点的面积或吸收光强度则是其定量测定的依据。
色谱图
1．保留时间：保留时间；死时间；调整保留时间。
2．容量因子：由于保留体积的大小与柱的尺寸有关， 不能完全反映组分的保留特性，所以引入容量因子 （capacity factor，k′）的概念。根据分配平衡定义的容 量因子为：在一定温度下，组分在两相间的分配达到平 衡时，其在两相中的绝对量之比。
4.拖尾因子(T): 除另有规定外，T应在0.95～ 1.05之间。
在给定色谱条件下，相邻的两个色谱峰被分 离的程度用分离度来表示。tR1，tR2，W b1和 W b2分别表示第一个和第二个色谱峰保留时 间和峰宽。一般Rs > 1.5，认为两峰完全基 线分离。
Rs

2(tR2 tR1) Wb1 Wb2
k'

组分在固定相的量（qs） 组分在流动相的量（qm）
tR = t0（k′ + 1）
（三）理论塔板（theoretical plate ）
两个组分被分离的条件首先是它们有不同的K 值或 k′值，但也与峰的形状和宽度有关。为 了描述色谱峰的宽度，引入理论塔板数（n） 的概念。
2
n

5.54
泳法的基本原理。
第六章 色谱法
色谱法(chromatography)是建立在被分 离组分在两相间具有不同分配特性基础上的 分析方法。
静止不动的一相称为固定相（stationary phase），参与运动的另一相称为流动相 （mobile phase）。
一、分离原理
（一）分配平衡
在色谱分离过程中，当温度一定时，认为组分在两相间 的分配可以达到热力学平衡，此时组分在固定相中的浓度 （Cs）与在流动相中的浓度（Cm）之比为一个常数，表示为：
K= Cs / Cm K为平衡常数（equilibrium constant）。当色谱体系的固 定相和流动相一定时，K是反映组分保留特性的参数，K值 大，表明组分与固定相的作用强，易于保留；反之，则组分 与固定相的作用弱，易于进入流动相而被洗脱。由于不同组 分其化学性质各异，就具有不同的保留特性或不同的K值， 从而通过色谱方法得以分离。
常用固定液: 甲基硅油 甲基硅橡胶 苯基甲基聚硅氧烷 聚乙二醇
3.仪器
检测器的输出信号强度与进入检测器组分的量成 比例关系。对检测器的基本要求是灵敏度高，稳 定性好，线性范围宽，噪音低。
浓度型检测器 :热导检测器（TCD）; （2）电子 捕获检测器（ECD）.
质量型检测器 :氢火焰离子化检测器（FID）
2．分子扩散项（B / u）： 与组分在柱中的浓度梯度 和分子的扩散运动有关，增加流速有利于克服由B / u项 引起的色谱峰展宽。气相色谱中，B / u项是色谱峰展宽 的主要因素；而液相色谱中，由于液态分子的扩散运动 较低，B / u项可以忽略不计。
3．传质阻力项（Cu） ：与固定相的液层厚度和柱中 流动相的迁移速度有关。组分进入固定相和从固定相返 回流动相均需要一定的时间，所以增加流速将会造成分 子质量迁移速度的差异，而引起色谱峰展宽。液相色谱 中，Cu项是色谱峰展宽的主要因素。
检测器的种类; 固定液品种及特殊的色谱材料;
其余条件可以改变.
（三）高效液相色谱法
以液体为流动相的色谱法通称为液相色谱法。 利用小粒径（3~10μm）固定相和压力泵输送流 动相，使分离效率和分析速度明显提高的液相色 谱法称为高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）。与气相色谱法 比较，HPLC法不受被测样品挥发性和热稳定性 的限制，适用于大部分的有机毒物的分析检测； 另外，HPLC法中的流动相的选择范围较大，可 以更有效地控制和改善分离条件，提高分离效率。
１．原理： KA≠KB差速迁移。 ２．固定液与载体：
色谱柱一般分为：填充柱和毛细管柱两大类型。
填充柱 在气–液色谱法中，应用的是填装了固定 相的色谱柱。通常柱长1m~3m，内径3mm~6mm，一 般短柱用玻璃管，长柱用不锈钢管。固定相为液体称 为固定液，支撑固定液的惰性多孔固体称为载体。
tR W1 2

理论塔板数与柱长（column lengthen，L） 成正比。所以，柱的性能还可用塔板高度 （plate height, H）来表示。理论塔板概念被 广泛用来描述色谱柱的特性，性能良好的色 谱柱，其理论塔板数高，塔板高度值小，峰 形窄而对称。
HL n
（四）范氏方程（Van Deemter equation）
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(四) 电泳法
1．分离原理 υ=μE 影响电泳分离的条件有：缓冲液的pH值和离子
强度、电场强度、样品浓度。 2．各类电泳法包括：纸电泳法、醋酸纤维素电泳 法、琼脂糖凝胶电泳法、聚丙烯酰胺凝胶电泳法、 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳法。 3．毛细管电泳法 以弹性石英毛细管为分离通道， 以高压直流电场为驱动力，依据样品中各组分之间 淌度和分配行为上的差异而实现分离的分析方法。 其分离模式主要有毛细管区带电泳（CZE）等。
4.应用:
(1)定性鉴别:用保留值鉴别 ; (2)检查:
内标法加校正因子测定供试品中某个杂质的含量; 外标法测定供试品中某个杂质或主成分含量; 加校正因子的主成分自身对照法; 不加校正因子的主成分自身对照法; 峰面积归一化法 ; (3)含量测定:内标法、外标法
小结:
中国药典中各品种项下规定的色谱条件不得 改变的有:
吸附剂： 最常用的吸附剂包括：硅胶、氧化铝、 硅藻土、粉末纤维素和聚酰胺等。
展开剂 ： 由混合溶剂组成的展开剂是推动组分迁 移的原始动力，展开剂的推动力、吸附剂的吸附力 与组分的作用力三者之间相互制约又相互竞争。所 以，薄层吸附色谱的分离过程是一个“吸附、解离， 再吸附、再解离”的往复循环过程。在此过程中， 当组分和吸附剂一定时，展开剂的极性增加，组分 的Rf值增大，反之Rf值减小。一般组分的Rf值在０. ３～０.５的范围内为宜。
1.原理: 差速迁移;塔板理论同GC;速率理论 H=A+Cu
2.固定相: 硅胶；化学键合相（ODS、氨基氰 基键合相等）；键合型离子交换剂（强酸性 磺酸型阳离子键合相、强碱性季铵型阴离子 键合相）。
3.流动相:正相色谱用极性小的有机溶剂；反 相色谱常用甲醇－水或乙腈－水。
4.分类:
Van Deemter方程说明了填充均匀程度、载体 粒度、载气种类、载气流速、柱温、固定液层 厚度对柱效的影响，对色谱条件的选择具有重 要意义。
二、色谱系统适用性试验方法
1.色谱柱的理论塔板数（n）:达到规定要求；
2.分离度(R): 除另有规定外R应大于1.5；
3. 重复性(RSD): 取对照品溶液,连续进样5次 其峰面积测量值的相对标准偏差不大于2.0%；
(1)吸附色谱法: 一般固定相为吸附剂（如硅 胶），流动相为极性较小的有机溶剂（如烷 烃类）构成的分离体系，不同组分与吸附剂 之间的“吸附与解吸附”作用大小是其分离 的基础。例如，当被测组分一定时，硅胶的 吸附作用大，则容量因子大，保留时间增长； 同时流动相的极性大，则解吸附作用强，保 留时间缩短。
第六章 色谱法
考试大纲要求 掌握薄层色谱法的基本原理、操作方法以及在药物鉴别、
检查中的应用。 掌握气相和高效液相色谱法的基本原理及其在药物鉴别、
检查和含量测定中的应用。 掌握气相色谱和高效液相色谱系统适用性试验的主要内容。 熟悉电泳法的基本原理和常用的电泳方法。 了解气相色谱仪和高效液mter提出了色谱中塔板 高度受三方面的因素影响，并总结出了与流 动相线速（u）有关的经验表达式称为范氏方 程:
H A B Cu u
1．涡流扩散项（A）：与固定相的粒度大小和均匀 度有关，与流动相的性质无关。气相色谱中使用空心毛 细管柱时，由于无填充颗粒，A项为零。
４．操作方法： （１）吸附剂与展开剂的选择； （２）薄层板的制备； （３）点样与展开； （４）斑点的定位．
（二）ＧＣ
气相色谱法（gas chromatography，GC）是以气 体为流动相的色谱法。主要有两类：气–固色谱法 （gas–solid chromatography，GSC）和气–液色谱 法（gas–liquid chromatography，GLC）。其中最 常用的是气–液色谱法，被测样品组分在气液两相 之间通过多次分配而得以分离。气相色谱法具有分 离效率高、分析速度快、样品用量少、检测灵敏度 高、应用范围广等特点，可用于微量或痕量药物的 分离、检测。但对于挥发性小、热稳定性差和极性 过大的毒物，该方法的应用受到一定限制。