PCR

做Real Time PCR时，用于SYBR Green I/Eva Green 法时的一对引物与一般PCR的引物，在引物设计上所要求的参数是不同的。引物设计的要求：

① Tm=55-65℃

② GC=30-80%

③ PCR扩增产物长度：引物的产物大小不要太大，一般在80-300bp之间都可。

④引物的退火温度要高，一般要在60℃以上。

要特别注意避免引物二聚体和非特异性扩增的存在。而且引物设计时应该考虑到引物要有不受基因组DNA污染影响的能力，即引物应该跨外显子，最好是引物能跨外显子的接头区，这样可以更有效的不受基因组DNA污染的影响。

由于RNA纯化后得率不同、RNA反转录为cDNA的效率不同等客观因素，用于定量分析的初始样品浓度不同，因此，在进行基因表达调控研究中都会用一些看家基因来标准化，以校正因样品初始浓度不同而造成的差异。常用的看家基因有beta-actin，GAPDH，18SrRNA等。因此，在做基因表达调控分析时至少要做两个基因，目的基因和一个看家基因。

一般而言，荧光扩增曲线可以分成三个阶段：荧光背景信

号阶段，荧光信号指数扩增阶段和平台期，其形状是一条平滑的S型曲线。

如果在荧光背景信号阶段出现很多拐点，可能的原因是体系未混匀或者存在固态杂质;

如果向下探头后又很快抬头然后又向下探头，可能原因是体系中模板量太高，建议模板稀释后再用。

如果引物二聚体存在则阴性对照会出现抬头现象，这在Real-Time PCR中很难避免;

若是阴性对照的溶解曲线出现和样品中同样的峰，说明体系配置中存在污染，则实验结果不可用。

在溶解曲线中出现双峰有三种可能：

①引物峰，引物峰通常是两峰中的前面一个，消除的办法是降低体系中的引物量或重新设计引物;

②在做基因表达差异时容易出现DNA被扩增峰(只在引物跨内含子时存在)，出现原因是提取RNA时存在DNA污染，可以通过电泳验证，这时要重新消化RNA样品中的DNA;

③扩增非特异，这时要重新摸扩增条件或重新设计并验

证引物。

1. Real-time QPCR常见参数

基线(baseline)

通常是3-15个循环的荧光信号

同一次反应中针对不同的基因需单独设置基线

阈值(threshold)

自动设置是3-15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍

手动设置：置于指数扩增期，刚好可以清楚地看到荧光信号明显增强。

同一次反应中针对不同的基因可单独设置阈值，但对于同一个基因扩增一定要用同一个阈值。

Ct值:与起始浓度的对数成线性关系。

分析定量时候一般取Ct:15-35。太大或者太小都会导致定量的不准确。

Rn(Normalized reporter)是荧光报告基团的荧光发射强

度与参比染料的荧光发射强度的比值。

△Rn：△Rn是Rn扣除基线后得到的标准化结果(△Rn=Rn-基线)。

2.影响Ct值的关键因素

模板浓度

模板浓度是决定Ct的最主要因素。控制在一个合适范围内，使Ct在15-35之间。

反应液成分的影响

任何分子的荧光发射都受环境因素影响----比如溶液的pH值和盐浓度。

pcr反应的效率

PCR反应的效率也会影响Ct值。在pcr扩增效率低的条件下进行连续梯度稀释扩增，与PCR扩增效率高的条件下相比，可能会所产生斜率不同的标准曲线。PCR效率取决于实验、反应混合液性能和样品质量。一般说来，反应效率在90-110%之间都是可以接受的。

3. 如何评估实时定量PCR反应的效果

PCR扩增效率：为了正确地评估PCR扩增效率，至少需要做3次平行重复，至少做5个数量级倍数(5logs)连续梯度稀释模板浓度。

How to design primer

简并引物设计的方法(包括实际操作步骤)

简并引物是指用来编码一段短肽序列的不同碱基序列的混合物。主要用来同源克隆未知的基因，或用来分析某一种基因多态性的一种方法。

简并引物设计的常见程序如下：

1. 利用NCBI搜索不同物种中同一目的基因的蛋白或cDNA编码的氨基酸序列。

因为密码子的关系，不同的核酸序列可能表达的氨基酸序列是相同的，所以氨基酸序列才是真正保守的。首先利用NCBI的Entrez检索系统，查找到一条相关序列即可。随后利用这一序列使用BLASTp(通过蛋白查蛋白)，在整个Nr数据库中中查找与之相似的氨基酸序列。

2. 对所找到的序列进行多序列比对。

将搜索到的同一基因的不同氨基酸序列进行多序列比对，最好采用局部比对程序如BLOCK，也可选工具Clustal W，也可在线分析/clustalw.

其结果如下图所示，所有序列的共有部分将会显示出来。“*”表示保守，“：”表示次保守。

3. 确定合适的保守区域。

设计简并引物至少需要上下游各有一个保守区域，且两个保守区域相距50~400个氨基酸为宜，使得pcr产物在

150~1200bp之间，最重要的是每一个保守区域至少有6个氨基酸，因为每条引物至少18bp左右。

若比对结果保守性不是很强很可能找不到6个氨基酸的保守区域，这时可以根据物种的亲缘关系，选择亲缘相近的物种进行二次比对，若保守性仍达不到要求，则需进行三次比对。总之，究竟要选多少序列来比对，要根据前一次比对的结果反复调整。最终目的就是至少有两个6个氨基酸且两者间距离合适的保守区域。

4. 利用软件设计引物。

当得到保守区域后，就可以利用专业的软件来设计引物了，如利用pp5进行简并引物的设计。将参与多序列比对的序列中的任一条导入pp5中，再将其翻译成核苷酸序列，有密码子简并性，其结果是有n多条彼此只相差一个核苷酸的序列群，该群可用一条有简并性的核苷酸链来表示(其中

R=A/G，Y=C/T，M=A/C，K=G/T，S=C/G，W=A/T，H=A/C/T，