胡芦巴水溶性甾体皂苷的提取分离工艺研究

天然产物研究与开发　
2005　V ol 117　N o 11
NAT URA L PRODUCT RESE ARCH AND DE VE LOPME NT
收稿日期:2004205225 接受日期:2004207223 基金项目:天津市高等学校科技发展基金项目(20031210)1　3通讯作者T el :86222260270043;Email :zhanglmd @yahoo 1com 1cn
胡芦巴水溶性甾体皂苷的提取分离工艺研究
张黎明3,徐　玮,杜连祥
(天津科技大学生物工程学院,天津300222)
摘　要:以薯蓣皂苷元的提取率为指标,应用L 9(34)正交试验设计优化了从脱多糖、脱脂胡芦巴豆粉中提取甾体皂苷的工艺条件,并且筛选了ZT C 澄清剂对胡芦巴甾体皂苷水提取液的澄清条件。

实验结果表明,影响水提取的主次因素为:提取次数>提取温度>固液比>提取时间;最佳水提取条件为:固液比为1:10,在70℃下提取3次,每次120min 。

得出胡芦巴种子水提取液的澄清条件如下:ZT C1+1澄清剂的加入次序是先加B 组分再加入
A 组分;澄清剂
B 和A 的最佳用量分别为110g/L 和015g/L ;加入组分A 或B 后在80℃下作用30min 即可达到
澄清目的。

关键词:胡芦巴种子;水提取;甾体皂苷;ZT C1+1澄清剂中图分类号:R284.2;Q946.83
Studies on Extracting Technology of W ater 2soluble
Steroidal Saponins from Fenugreek Seeds
ZH ANGLi 2ming 3,X U Wei ,DU Lian 2xiang
(School o f Bioengineeringm ,Tianjin Univer sity o f Science and Technology ,T ianjin 300222,China )
Abstract :Using the remainder of fenugreek seeds with separated endosperm as the raw material ,the optimum extraction condi 2tions of steroidal saponins were investigated by orthog onal design and with the extracting rate of diosgenin as index 1The clarify 2ing conditions of steroidal saponins aqueous s olution was als o selected by using ZT C flocculating method 1The results show that the factors in fluencing extraction efficiency were as follows :extraction times >temperature >ratio of feeding stock weight to the v olume of s olvent >duration of extraction 1The optimum extraction condition obtained was :adding 10times of water v olume as much as that of sample and extracting for 120min at 70℃(totally extracting for 3times )1The adding sequence of ZT C1+1natural clarifying agent was clarifier B before clarifier A 1The optimum am ount of ZT C clarifier was 110g/L for clarifier B ,and 015g/L for clarifier A 1The clarifying time after adding clarifier B and A was 30min 1Under these conditions ,the steroidal saponins aqueous s olution w ould become clarify and stability 1
K ey w ords :Fenugreek seeds ;water 2extracting ;steroidal saponins ;ZT C 1+1natural clarifying agent
胡芦巴系豆科植物胡芦巴(Trigonella foenum 2graecum L 1)的种子,又名香豆子、芦巴子等。

该中药味苦、性温,具有温肾、祛寒、止痛之功效。

胡芦巴种子所含化学成分复杂,药理作用广泛。

主要成分为甾体皂苷类、黄酮类、生物碱类、三萜类和香豆素类等[123]。

从胡芦巴种子中分离得到的胡芦巴豆胶(主要是半乳甘露聚糖)可降低非胰岛素依赖型糖尿病患者的血糖水平[4,5];其提取物可使血清极低密度
脂蛋白和低密度脂蛋白降低,初步认为该种子降血脂的主要成分为甾体皂苷。

实验表明[6],胡芦巴种子所含甾体皂苷可明显增加正常大鼠对食物的摄入与转化,稳定链脲佐菌素诱导的糖尿病大鼠的食物消耗,降低血清总胆固醇含量;精制的胡芦巴种子醇提物给高胆固醇大鼠喂饲,以30g/kg 或50g/kg 剂量连续4周,血清总胆固醇从26%降低到18%,肝胆固醇也有降低的趋势。

已经有文献报道[7,8],胡芦巴总皂苷具有抗脑缺血作用,总甾体皂苷中所含的薯蓣、替告皂苷等均是治疗心脑缺血性疾病的有效成分。

由胡芦巴总皂苷开发的中药制剂降糖安胶
7
4
囊已被SFDA批准临床研究,具有显著降低血糖、甘油三酯、胆固醇及低密度脂蛋白的作用。

因此,以胡芦巴种子为原料分离纯化甾体皂苷,极具有开发应用价值。

胡芦巴种子存在大量的多糖、蛋白质及粘液质而不易用水分离纯化甾体皂苷,用有机溶剂提取需要三、四种溶剂轮番使用,耗溶剂量大,生产成本较高。

目前国内已有人[9]用物理方法成功地将多糖从胡芦巴种子中剥离出来,而且借助于现代吸附澄清技术,使得用水提取胡芦巴甾体皂苷变得容易,本文将就胡芦巴甾体皂苷的水提取和澄清工艺进行探讨。

1　仪器和试剂
UV22550PC紫外可见分光光度计(日本岛津公司);AR2140百万分之一天平(美国奥豪斯公司);40目脱多糖胡芦巴豆粉(天津药业集团有限公司提供),在提取甾体皂苷之前,置于索氏萃取器中,用石油醚(bp160～90℃)作溶剂提取8h,回收石油醚得胡芦巴油及脱脂胡芦巴豆粉;标准薯蓣皂苷元(天津药典标准仪器药品开发公司);ZTC2II型天然澄清剂(天津正天成澄清技术有限公司):A组分用蒸馏水配制成1%的水溶液,预溶胀24h;B组分用1%醋酸溶液配制成1%的溶液,预溶胀24h。

其它试剂均为分析纯。

2　方法和结果
211　水提取工艺的正交试验设计及结果
通过分析脱多糖胡芦巴豆粉的物理性能,并针对胡芦巴豆粉的水提液粘度较大,其甾体皂苷不容易扩散的特点,故选定提取温度(A)、固液比(B)、提取次数(C)和提取时间(D)作为考察因素。

以薯蓣皂苷元的提取率为指标,应用L9(34)正交试验设计进行试验。

因素水平安排见表1。

21111　试验方法　各称取胡芦巴豆粉2510g,按L9 (34)组合试验条件进行提取,室温下纱布过滤至无固形物,合并多次提取液,真空浓缩至100m L。

21112　甾体皂苷元的含量测定　胡芦巴豆粉中皂苷元的含量按文献[10]的方法测定。

皂苷元的提取率为水浸提法所得薯蓣皂苷元占胡芦巴豆粉中皂苷元含量的百分数。

21113　对照品溶液的制备　精确称取在60℃真空干燥4h的薯蓣皂苷元对照品25100mg,用少量石油醚溶解,然后用石油醚定容至100m L。

表1　因素水平表
T able1　Levels of experiment factors
水平
Levels
因素factors
提取温度(℃)
T em perature
A
固液比(W/V)
Fenugreek seeds
—s olvent ratio
B
提取次数(次)
Extraction
times
C
提取时间(min)
Extraction
time
D 1501:10160
2601:122120
3701:143180 21114　供试品溶液的制备　按文献[11]所述方法,加浓硫酸211m L,石油醚100m L,于电热套中回流4 h水解薯蓣皂苷,倾出、冷却、分层,取石油醚层,先用碳酸钠溶液洗至中性,再用蒸馏水洗,得薯蓣皂苷元的石油醚溶液,定容于25010m L容量瓶。

供测定薯蓣皂苷元的含量用。

21115　测定法　分别准确吸取0110,0120,0130, 0140,0150,0160m L于磨口具塞试管中,水浴挥干溶剂。

分别加入新配制的5%香荚兰醛冰醋酸溶液0120m L,高氯酸0180m L,在70℃水浴中加热15 min,冰水冷却,加冰醋酸使其定容至10100m L,放置30min后,以不含皂苷元的随行试剂作参比,用分光光度计在波长530nm处测定其吸光值A,结果薯蓣皂苷元浓度在1100mg/L～20100mg/L范围内呈良好线性关系。

得回归直线方程为:A=010169C2 010082,R=019960。

准确吸取供试品溶液5100m L,水浴挥干溶剂后按上述方法测定吸光度,根据标准曲线计算,然后换算成2510g胡芦巴豆粉中皂苷元的提取量。

21116　甾体皂苷水提取条件筛选结果　正交试验设计筛选甾体皂苷水提取条件结果表2。

从表2可以看出,以甾体皂苷元提取率作为考察指标,不同的水提取条件对胡芦巴甾体皂苷的提取率影响较明显,且影响因素主次顺序为C>A>B>D。

直观分析表明最佳提取条件组成为A3B1C3D2。

即胡芦巴甾体皂苷最佳水提取条件为:称取脱多糖和脱脂的胡芦巴豆粉2510g,固液比为1:10(每克原料加入10 m L蒸馏水),在70℃下提取3次,每次120min。

据此条件验证三次,结果薯蓣皂苷元的提取率为6711%(n=3)。

验证试验结果与正交试验结果基本一致,说明提取工艺条件基本稳定,重现性好。

212　ZTC2II型天然澄清剂澄清条件的选择
21211　待澄清液的制备　以最佳水提取条件
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A3B1C3D2下得到的水溶性甾体皂苷提取液为澄清对表2　水提工艺条件的正交试验结果
T able2　Results of orthog onal test of extraction
procedure conditions
试验号
N o1A B C D 甾体皂苷元提取率(%) The percent of extraction of steroidal sapogenins
111113416
212224516
313335516
421235316
522316312
623124310
731326512
832134218
933215612
K113518153141201415410
K215918151161551415318
K316412154181841015210
R28143126316210
象,加入澄清剂前先以3600rpm转速离心15min除去不溶物,然后浓缩至1:6(相当于每克脱多糖和脂胡芦巴豆粉得6m L提取液)。

21212　澄清剂A、B组分加入顺序的选择　ZTC系列天然澄清剂,不需要调节待处理液的pH值,但要根据不同性质的待处理液选择不同的添加次序。

胡芦巴甾体皂苷水溶液的pH接近7,其添加顺序需要根据实验而定。

加入A后于80℃澄清2h,再加入B继续作用2h,或者按先加B后加A的顺序,考察溶液是否有明显絮状沉淀,结果先加入A组分再加B组分的处理液没有出现明显的絮状物,溶液的澄清度与原来情况相差不大;而按先B后A的顺序加入待处理液时,加入第二种组分5min即可见出现明显的絮状物,上清液比原来变得透明。

因此,澄清剂的加入顺序选择先加入B组分后加入A的方式。

21213　澄清剂A、B组分用量的选择　澄清剂A、B 的加入量以加入澄清剂后所产生的絮状物的重量为指标进行选择,即组分A、B的用量比为1:2,按先加入B组分后加入A的次序,每加入一种组分后在80℃下保温2h,然后以3600rpm转速离心15min,倒出上清液,于50℃下干燥24h称重。

表3给出了10010m L待处理液中加入不同量的B和A组分后所得絮状物的质量,从该表可知,当胡芦巴甾体皂苷水提取液中加入B组分110g/L,A组分的用量为015g/L时,所得絮状物的重量最多,即澄清剂的澄清效果最好。

表3　添加不同量的澄清剂组分B和A于水提液所产生的絮状物的重量
T able3　The weight of flocculate produced by adding different am ount of clarifier B and A to
steroidal saponins aqueous s olution1
试验号N o1组分B的加入量(g/L)
The am ount of B
组分A的加入量(g/L)
The am ount of A
絮状物的重量(g)
The weight of flocculate
101201101142 201401201507 301601301789 401801401777 511001511027 611201601686 711401701532 811601801401 911801901222 1021011001240
21214　澄清剂澄清时间的选择　澄清剂A、B的澄清时间以加入澄清剂后所产生的絮状物的重量为指标进行选择。

根据表3选择B组分用量为110g/L, A组分的用量为015g/L,加入B组分后在80℃下保温不同的时间,然后加入A组分继续保温与B同样的时间。

按与澄清剂A、B组分用量的选择的方法测定加入澄清剂于10010m L胡芦巴水提液后产生的絮状物的重量,不同的澄清时间与絮状物重量之间的的关系见图1。

从该图可以看出,加入B组分后在80℃下保温30min,再加入A组分继续保温30min即可达到澄清的效果。

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2005　V ol117　N o11张黎明等:胡芦巴水溶性甾体皂苷的提取分离工艺研究　
图1　澄清剂A、B的作用时间对所产生的絮状物的重量的影响
Fig11　E ffect of clarifying time after adding B and A to steroidal saponins aqueous s olution on the weight of flocculate
3　讨论
胡芦巴甾体皂苷水提液的杂质主要是蛋白质,如果用调节等电点的方法除去这些杂质,需要将溶液pH调到415左右,在此酸度下会使甾体皂苷有不同程度的水解,变成次生甾体皂苷。

而采用ZTC天然澄清剂可以得到原始甾体皂苷,更有利于胡芦巴甾体皂苷的结构和活性研究。

用上述澄清方法得到的澄清液可以直接进行喷雾干燥得到较纯的水溶性甾体总皂苷,如果要进一步提高甾体皂苷的纯度,可以再通过大孔吸附树脂进行分离。

利用称重法确定待处理液的澄清条件,虽然所得絮状物有一定的水分,但此法是一种简便、快速和适用的方法,对于研究其它物料的澄清有一定的参考价值。

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