冷冻禽畜肉类沙门氏菌快速分型检验中实时荧光PCR检测技术的应用

冷冻禽畜肉类沙门氏菌快速分型
检验中实时荧光PCR检测技术的应用 李丹妮 延安市食品质量安全检验检测中心
目的：探讨冷冻禽畜肉类沙门氏菌快速分型检验中实时荧光PCR（Quantitative Real-time PCR）检测技术的应用价值。

方法：抽取2018年3月-2018年7月冷冻禽畜肉类样品2000份，采取传统标准方法与实时荧光PCR快速检测技术进行检验，统计其检验结果。

结果：通过实时荧光PCR检测显示，本组样品中检出沙门氏菌76份（阳性率3.80%）明显高于传统标准方法38份（1.90%），差异具有统计学意义（P＜0.05）；进一步对检出沙门氏菌血清分型鉴定显示以海德堡血清型、肯塔基血清型、鼠伤寒血清型、肠炎血清型为主。

结论：实时荧光PCR检测技术应用于冷冻禽畜肉类沙门氏菌快速分型检验中具有较好效果，有助于提升沙门氏菌检出率，可快速分型，弥补了传统标准检验耗时长、操作繁琐等不足之处，具有更高临床应用价值。

沙门氏菌（salmonella）是一种常见的食源性致病菌，广泛分布于自然界内，随着现代临床检验技术的不断进步，临床发现的沙门氏菌超过1000余种，对人类以及动物健康均可造成严重影响。

沙门氏菌的传统鉴定方法依据形态学特征、生理生化体征、培养特征、抗原特征、噬菌体特征等展开，不够该检验鉴定程度相对复杂，耗时长，不利于推广应用。

荧光定量PCR( realtime fluorescence quantitative PCR，RTFQ PCR)是1996年由美国Applied Biosystems公司推出的一种新定量试验技术，通过探针荧光染料或荧光标记的特异性，对PCR产物进行标记跟踪，实时在线监控反应过程，结合相应的软件可以对产物进行分析，计算待测样品模板的初始浓度。

现有研究将该项技术引入冷冻禽畜肉类沙门氏菌快速分型检验中具有较好效果，鉴于此观点，本文抽取2018年3月-2018年7月冷冻禽畜肉类样品2000份展开分析，评价实时荧光PCR检验技术的应用价值，现报道如下。

资料与方法
一般资料。

抽取2018年3月～2018年7月冷冻禽畜肉类样品2000份展开分析，其中冷冻禽类897份，冷冻畜类1103份。

方法。

（1）试剂。

选择北京路桥公司提供的生化试剂以及泰国S&A公司提供的分型鉴定血清、分离培养基、前增菌、后增菌。

（2）仪器。

采用全自动核酸提取工作站，以及南京贝登电子商务有限公司提供的实时荧光PCR仪、全自动微生物鉴定、药敏分析仪。

（3）检测方法。

检测内容均依据国家标准沙门氏菌检验方法展开增菌培养，随后采用全自动核酸提取工作站进行核酸的提取工作（磁珠法），待细胞裂解后，将细胞中核酸分子吸附于磁性颗粒上，待其反应一定时间后，利用磁场作用将液体与磁性颗粒进行分离，回收颗粒（磁珠-DNA混合物），并进行脱洗。

待各项程序完成后采取PCR检测试剂盒展开实时荧光PCR反应检测，检验沙门氏菌灵敏度与特异度。

待检验完毕后对PCR检测为阳性样品者进行增殖液接种、培养；生化反应检测通过挑取无色半透明H25菌株与可疑菌落，将其置放于营养琼脂平板，在适量温度环境内（37℃）逐渐扩大培养，最后采用全自动微生物、药敏反应进行鉴定与分析，各项操作均依据说明书完成。

血清学分型鉴定中将生化鉴定检验阳性菌种，将其点种于琼脂量低的琼脂平板内，在湿润环境下诱导等操作内容，随后依据按照单因子血清、多价血清展开血清学实验。

统计学方法。

研究所得数据由SPSS21.0统计学软件处理，正态分布的计量资料由“s
x±”表示，以t检验；非正态分布的计数资料，由“,%
n”表示，以x2检验。

样本数据比较，以P＜0.05表示差异具有统计学意义。

结果
通过实时荧光PCR检测显示，本组样品中检出沙门氏菌76份（阳性率3.80%）明显高于传统标准方法38份（1.90%），差异具有统计学意义（P＜0.05）；进一步对检出沙门氏菌血清分型鉴定显示以海德堡血清型、肯塔基血清型、鼠伤寒血清型、肠炎血清型为主。

讨论
近年来我国正处于经济快速发展阶段，随着人们生活水平的改善，对于禽类、畜类等肉制品需求愈发增高。

而与此同时冷冻禽畜肉类批次增多、数量增大，这便对多批次巨量冷冻禽畜肉类检验工作提出更高要求。

若检验周期延长不仅可影响整个冷冻肉类供应的产业链及时性，同时对冷库储存、周转等运作效率形成限制，增加了冷库储存周转压力。

沙氏门菌沙门氏菌病是指由各种类型沙门氏菌所引起的对人类、家畜以及野生禽兽不同形式的总称。

感染沙门氏菌的人或带菌者的粪便污染食品，可使人发生食物中毒。

据统计在世界各国的种类细菌性食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒常列榜首，我国内陆地区也以沙门氏菌为首位，具有菌型多样化、分布广泛、检验复杂等特点。

沙氏门菌的传统检
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提高标准物质、试剂的管控力度。

标准物质是食品检验中待测物质的度量标尺，是检验结果的判定准绳；化学试剂直接参与食品检验中的化学反应，是检验结果的直接主导者。

两者对于检验结果的准确性有着非常重要的影响，在日常食品检验工作中，检验机构应当严格遵循相关标准物质及化学试剂采购验收程序。

购买使用有证标准物质，建立标准物质档案，并由专人记录保管，每次使用做好记录。

标准滴定溶液每隔3个月复标一次。

同时做好标准物质及化学试剂的保管和储存工作，定期清理过期及性状发生改变的标准物质和化学试剂。

完善检验方法。

从检验方法上来看，为了提高检验结果的准确性，可以在做好方法学验证的前提下对检验方法进行适当的改进，从技术层面上提高检验结果的可靠性。

现阶段，我国食品工业中不断采用的新技术新方法，使得食品的销售形式、种类、销售群体以及食物的营养成分发生了很大的变化。

在这种新形势下，如果依然使用旧的检验方法，肯定无法满足食品安全检验的相关要求，导致严重的检验误差，影响食品安全。

所以，为了完善食品检验，可以从以下几点考虑：在食品检验中，根据食品的生产方法，对其状况进行陈述，强化食品综合指标的评价和分析，对检验结果进行分析，对比与预期结果之间的差别，向消费者提供最权威的报告；其次，由于餐饮企业中新产品的推出，在食品检验中要根据食材、保质期、储存方法等做好相关的检测分析，对食品检验结果的准确性进行分析，要求满足国家要求。

另外，新的检测标准颁布后，相关检测机构要进行宣贯，并做评估。

检测标准要按照规定的频次定期查新。

切实提高检验人员个人素质水平。

首先，在食品检测过程中，检测人员必须严格遵照标准规范进行操作，避免由于人为失误而造成的结果不准确的情况；其次，定期对检验人员进行知识培训，使其了解最新的检验技术及相关知识，提高检验人员的专业水平，提高食品检测结果的准确性。

最后，对食品检验人员的操作进行监督，避免个人操作的不规范性，提高检验结果的准确性。

总之，从多个角度提高检验人员的综合素质水平，提高检验结果的准确性。

综上所述，食品的检验工作关系着食品安全问题，影响到人们的生命安全，必须加以重视。

所以，在进行食品检验的工作中，工作人员要全面分析可能对检验结果造成影响的因素，然后在此基础上，采取有针对性的控制措施。

提高检测结果的可信度，并对公民的生命和健康负责。

验主要包括分离培养、前后增菌的检测、生化鉴定以及分型检验等程序，郭丹桂的研究中
指出，传统检验时间需要耗费4-10d左右，由此可见其耗时表现费力，在现实工作中难以满足需求。

实时荧光PCR检测技术主要利用DNA 扩增反应，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法，在扩增期间，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。

由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以可成为定量的依据。

在本次研究中通过实时荧光PCR检测显示，本组样品中检出沙门氏菌76份（阳性率3.80%）明显高于传统标准方法38份（1.90%），差异具有统计学意义（P＜0.05）；由此可见实时荧光PCR检测技术确有较高检出率。

进一步分型可见显示以海德堡血清型、肯塔基血清型、鼠伤寒血清型、肠炎血清型为主，这与赵建梅等人的研究结果表现一致性。

综上所述，实时荧光PCR检测技术应用于冷冻禽畜肉类沙门氏菌快速分型检验中具有较好效果，有助于提升沙门氏菌检出率，可快速分型，弥补了传统标准检验耗时长、操作繁琐等不足之处，具有更高临床应用价值。

血清分型
检出株数
（株）
检出率
（%）海德堡血清型1823.68%肯塔基血清型1722.37%鼠伤寒血清型1621.05%肠炎血清型1215.79%巴基斯坦血清型3 3.95%
婴儿血清型2 2.63%
鸭血清型1 1.32%姆班达卡血清型1 1.32%汤卜逊血清型1 1.32%胥伐成格隆血清型1 1.32%粗糙型菌株血清型1 1.32%蒙的维亚血清型1 1.32%德尔卑血清型1 1.32%哈达尔血清型1 1.32%总计76100.00%表1 实时荧光PCR血清分型鉴定结果（n，%）
（上接第75页）。