固定化辣根过氧化物酶在有机水混合溶液中的电化学

[Note]物理化学学报(Wuli Huaxue Xuebao )Acta Phys.鄄Chim.Sin .,2006,22(7)：868~872Received:November 16,2005;Revised:March 5,2006.∗Correspondent,E ⁃mail:liuhh@;Tel:0710⁃3590920;Fax:0710⁃3590964.中国博士后科学基金(2004035625),湖北省自然科学基金(2005ABA007)和湖北省教育厅(T20030718,G200525001)资助项目ⒸEditorial office of Acta Physico ⁃Chimica Sinica固定化辣根过氧化物酶在有机溶剂/水混合溶液中的电化学刘慧宏1,2,∗万永清1陈显堂1邹国林2(1襄樊学院化学与生物科学系,湖北襄樊441053;2武汉大学生命科学学院,武汉430072)摘要用魔芋多糖(KGM)将辣根过氧化物酶(HRP)固定在玻碳电极(GCE)表面,制备了HRP ⁃KGM 膜修饰电极.在乙醇等亲水性有机溶剂与水的混合溶液中,包埋在KGM 中的HRP 可以与电极发生直接电子传递,且能催化还原过氧化氢、氢过氧化异丙基苯、氢过氧化叔丁基、过氧化丁酮等过氧化物.HRP ⁃KGM 膜修饰电极具有较好的稳定性和重现性,可用于这些物质的定量检测.关键词：辣根过氧化物酶,电化学,过氧化物中图分类号：O646Electrochemistry of Immobilized Horseradish Peroxidasein Organic Solvents/Water MixtureLIU,Hui ⁃Hong 1,2,∗WAN,Yong ⁃Qing 1CHEN,Xian ⁃Tang 1ZOU,Guo ⁃Lin 2(1Department of Chemistry &Biology,Xiangfan University,Xiangfan441053,P.R.China ;2College of Life Sciences,Wuhan University,Wuhan430072,P.R.China )Abstract Horseradish peroxidase (HRP)was immobilized on glassy carbon electrode (GCE)surface by konjacglucomannan (KGM).HRP entrapped in the KGM film underwent fast direct transfer ⁃electron reactions in water ⁃organic solvent mixtures.The electrocatalysis of peroxides,such as hydrogen peroxide,cumene hydroperoxide,t ⁃butyl hydroperoxide,and 2⁃butanone peroxide,by the immobilized HRP was also explored.Stability and reproducibility of the modified electrode made it possible to determine the organic peroxides.Keywords ：Horseradish peroxidase,Electrochemistry,Peroxide有机过氧化物广泛用作纺织品、纸张、油脂、石蜡和淀粉的漂白剂;医药中的杀菌剂;食品和饮用水等的消毒剂;有机合成中的催化剂、氧化剂、环氧化剂等.但有机过氧化物在水中的溶解度较小,利用有机相酶电极催化还原过氧化物有较好的应用前景.有机相电化学酶电极的操作条件较高[1⁃2].一是有机溶剂会改变酶的构象,降低酶催化活性;二是有机溶剂的离子传导性能差,影响测定的灵敏度.使用有机/水混合溶剂,一方面为保持酶的活性提供水环境和溶解适宜的支持电解质;另一方面有机溶剂能增加疏水性物质的溶解度,提高酶催化转化疏水性物质的效率.因此研究酶电极在有机/水混合溶剂中的电化学和电催化性质,具有理论和实际应用价值[3].辣根过氧化物酶(HRP,E.C.1.11.1.7)是一种相对分子质量约为44000的含有铁卟啉(Ⅸ)作为强键合辅助因子的糖蛋白.HRP 在室温下很稳定,且容易制得,价格便宜,是商品化较早、应用较为广泛的一种酶制剂,被广泛地应用于酶联免疫分析和构筑生物传感器[4].利用HRP 修饰电极催化还原过氧化July868No.7刘慧宏等：固定化辣根过氧化物酶在有机溶剂/水混合溶液中的电化学物的研究主要集中在两个方面:一是利用媒介体,加速HRP与电极的电子传递,构筑第二代传感器.使用较多的媒介体有吩嗪类染料[5⁃6],二茂铁衍生物[7],锇、钌的聚合物[8⁃9]等.二是寻找合适的固定膜,实现HRP的直接电化学,构筑第三代传感器.使用较多的固定化材料有溶胶⁃凝胶[10],纳米材料[11⁃12],磷脂或类磷脂[13⁃14],水凝胶[15⁃16],聚合物[17⁃18]等.魔芋多糖(KGM)又称魔芋葡萄甘露聚糖,或简称为魔芋葡甘聚糖.它是由β⁃D甘露糖与β⁃D葡萄糖以β⁃1,4键结合起来的链状分子[19],具有特定的生物活性;在水中膨胀,粘度特高,加热再冷却后,形成水凝胶;KGM水凝胶呈网状结构,其中许多水腔,为蛋白质提供适宜的微水环境,而且KGM水凝胶在各种有机溶剂中很稳定.利用这一特点,我们研究了HRP⁃KGM膜修饰电极在乙醇/PBS混合溶液中的电化学性质及催化还原有机过氧化物性能.1实验部分1.1仪器与试剂电化学工作站(CHI660,USA),超声波清洗器(KQ2200,上海声源超声波仪器设备有限公司),酸度计(PHS⁃3C,上海大中分析仪器厂).辣根过氧化物酶(HRP,上海东风生物制品公司),取适量HRP溶于10mmol·L-1pH7.0的磷酸盐缓冲溶液中,制成HRP溶液(2.53×10-5mol·L-1).实验中使用的缓冲溶液为0.1mol·L-1酒石酸盐(pH=3.0~6.0),磷酸盐(PBS,pH=7.0~8.0,11.0),硼砂(pH=9.0~10.0).魔芋多糖(KGM)溶解于沸水中配成0.4%的水凝胶,与蛋白质溶液混合前,在KGM水凝胶中,加入N,N⁃二甲基乙酰胺(DMF),加速凝胶化过程.氢过氧化异丙基苯(Sigma,CHP)、氢过氧化叔丁基(Sigma,BHP)和过氧化丁酮(Sigma,BP)使用前配制成乙醇溶液.有机溶剂/水混合溶液为0.1mol·L-1的缓冲溶液与无水乙醇按体积比1∶1混合而成.其它试剂均为分析纯,实验用水为二次蒸馏水.1.2实验方法1.2.1HRP⁃KGM膜修饰电极的制备玻碳电极(GC,兰力科化学电子高技术有限公司,Ф=4mm)用6#砂纸细磨后,再用0.05μm粒度的α⁃Al2O3悬浊液在抛光布上抛光,洗去表面污物,在水中超声清洗三次,每次2~3min.先将KGM和DMF按体积比4∶1混合,再取其混合液与HRP溶液等体积混合,取10μL混合溶液均匀涂布在新处理的电极表面,罩上有孔的小管,室温干燥约4h.制备的修饰电极表示为HRP⁃KGM/GC,HRP的固载量约为2.53×10-10mol.取10μL KGM和DMF的混合液均匀涂布在新处理的电极表面,制备的修饰电极表示为KGM/GC.1.2.2电化学测量电化学池由参比电极腔和电化学反应腔两部分构成,其间由鲁金(Luggin)毛细管连接.参比电极为饱和甘汞电极(SCE).铂丝网为辅助电极,工作电极为HRP⁃KGM/GC.高纯氮除氧,并在测试中保持氮气氛.2结果与讨论2.1HRP的直接电化学行为在pH7.0的PBS和乙醇/PBS混合溶液(E⁃PBS)中,-0.8~0.2V电位范围内,裸电极和KGM/GC在HRP溶液中扫描并没有出现氧化还原峰.将HRP⁃KGM/GC置于pH7.0PBS和PBS/乙醇混合溶液中循环伏安扫描,发现有一对对称的氧化还原峰(图1),说明固定在KGM中的HRP能与电极直接传递电子.HRP⁃KGM/GC在pH7.0乙醇/PBS混合溶液和在pH7.0PBS中的式电位(E0′)分别为-0.407V和-0.373V,阳极峰电势与阴极峰电势差(ΔE p)分别为70mV和80mV.式电位表明电化学反应为HRP血红素辅基中氧化还原中心Fe(III)/Fe(II)的氧化还原[20].阴阳极峰图1HRP⁃KGM/GC在PBS/乙醇混合溶液(a),PBS(b)和KGM/GC在PBS(c)中的循环伏安图Fig.1Cyclic voltammograms of HRP⁃KGM/GC in(a)PBS/Ethanol,(b)PBS,and(c)KGM/GCin PBSHRP:horseradish peroxidase;KGM:konjac glucomannan;PBS:phosphate buffer solutionpH7.0scan rate:0.5V·s-1869Acta Phys.鄄Chim.Sin.(Wuli Huaxue Xuebao ),2006Vol.22图2(A)HRP ⁃KGM/GC 在不同pH 乙醇/PBS 溶液中的循环伏安图;(B)势电位E 0′与pH 的关系Fig.2(A)Cyclic voltammograms of HRP ⁃KGM/GC in ethanol/0.1mol ·L -1PBS at different pH;(B)plot of E 0′vs pH电流比约等于1,说明HRP 的氧化还原是准可逆的.HRP ⁃KGM/GC 在pH 7.0乙醇/PBS 混合溶液(E ⁃PBS)与在pH 7.0PBS 中的循环伏安图相比,电化学信号更强,峰电流明显增大(I E ⁃PBS /I PBS =1.84),峰电势差减小(ΔE E ⁃PBS =70mV,ΔE PBS =80mV),式电位负移(34mV).这些结果说明有机溶剂有利于HRP 与电极的电子传递.由于血红素蛋白质的氧化还原过程伴随着水分子与Fe(III)的结合和离解,表现为电化学⁃化学(EC)过程;另外,血红素周围的氨基酸残基形成的氢键,也使肌红蛋白处于稳定态,难与电极传递电子,从而制约了电子传递的速度[21].有机溶剂的加入,降低了溶液的极性,削弱了HRPFe(III)及HRPFe(II)的水合效应,也削弱了氨基酸残基与血红素形成的氢键作用,从而降低HRP 电子传递的重组能,促进电子的传递.使用其它常用有机溶剂,如乙腈、二甲亚砜、DMF 等,均得到相似结果.阴、阳极峰电流均随扫描速率的增大而增大,且在扫描速率0.05~1.0V ·s -1范围内均与扫描速率成线性关系,线性方程及相关系数分别为i pc =0.40+8.64υ,R =0.997;i pa =-0.30-8.72υ,R =0.998.说明电化学反应为表面电化学过程而非蛋白质的扩散控制.而蛋白质在表面活性剂膜中氧化还原反应是受扩散控制的[22].在表面活性膜中,疏水作用和分子间的作用力占主导地位,这种作用力比较小,因而蛋白质的氧化还原表现为扩散控制.而在聚多糖膜内,蛋白质被固定在其凝胶的网状结构中,蛋白质的氧化还原则表现为表面控制.在乙醇/PBS 中,HRP ⁃KGM 膜修饰电极在所研究的pH 范围(3.0~9.0)内,均能得到一对清晰的可逆氧化还原峰(图2A).E 0′随溶液pH 的增大而负移并呈线性关系(图2B),线性方程为E 0′=0.00042-0.062pH,R =0.996.说明溶液pH 影响蛋白质的氧化还原过程.E 0′随pH 增大而负移,说明氧化还原反应伴随有质子转移.实验所得的直线斜率值(62mV/pH)与理论值(59mV/pH,1个电子和1个质子的反应)接近.而在PBS 中,其直线斜率值为46mV/pH,比理论值要小.这也说明了HRPFe(II)的水合作用以及氨基酸残基与血红素形成的氢键影响HRP 的氧化还原电势.当pH 为3.0时,蛋白质循环伏安图变得有些不对称,主要表现是阴极峰电流增加而阳极峰电流减小,这可能是蛋白质在酸性溶液中构象发生变化的结果.但构象的变化是可逆的.即HRP ⁃KGM 膜修饰电极在pH 7.0溶液中扫描,得到对称的氧化还原峰(I pc /I pa =0.96),底液再更换为pH 3.0的溶液,其氧化还原峰变得有些不对称(I pc /I pa =1.12).将电极再放在pH 7.0的溶液中扫描,又重新得到对称的氧化还原峰.结果说明在一定的pH 内,蛋白质构象的改变是可逆的.将电极放置在更换的底液中扫描1~2min,便可得稳定的CV 图,也说明KGM 水凝胶的通透性较好.HR ⁃KGM/GC 比较稳定,一天内,每隔2h 循环扫描20圈,电流基本不变.将电极浸泡在10mmol ·L -1PBS(pH 7.0)的溶液中,在4℃保存7天,电流下降约10%.2.2催化还原过氧化物在乙醇/PBS 混合溶液(pH 7.0)中,HRP ⁃KGM/GC 的循环伏安图只出现了HRPFe(III)/Fe(II)电对的氧化还原峰.当加入过氧化物时,出现了一还原峰,其870No.7刘慧宏等：固定化辣根过氧化物酶在有机溶剂/水混合溶液中的电化学图3HRP⁃KGM/GC催化还原过氧化物的循环伏安图Fig.3Cyclic voltammograms of HRP⁃KGM/GC in ethanol/PBS(pH7.0)containing peroxides(μmol·L-1) scan rate:0.2V·s-1.(A)H2O2:(a)0,(b)0.14,(c)0.21,(d)0.28;(B)cumene hydroperoxide:(a)0,(b)0.046,(c)0.13,(d)0.18;(C)t⁃butyl hydroperoxide:(a)0,(b)0.045,(c)0.089,(d)0.13;(D)2⁃butanone peroxide:(a)0,(b)0.026,(c)0.045,(d)0.057峰电势比HRPFe(III)/Fe(II)的式电位正移.随着过氧化物浓度的增大,还原峰电流增加,同时伴随着氧化峰电流减小(图3).这是典型的电催化行为.在相同条件下,GC和KGM/GC在过氧化物溶液中均未得到还原电信号,说明还原峰是由HRP⁃KGM/GC催化还原过氧化物形成的.过氧化物酶催化还原过氧化物的反应速率及检测灵敏度,与过氧化物的结构有关系.过氧化物酶与氢过氧化物的反应速率比烷基过氧化物的要快,而且检测灵敏度要高,如氢过氧化异丙苯>过氧化丁酮>H2O2[23].而本实验得到的结果是过氧化丁酮>氢过氧化异丙苯>氢过氧化叔丁基>H2O2.这可能与HRP的微环境有关.因为酶的固定化材料及固定化过程影响过氧化物酶的活性[24],而且有机溶液会改变酶的构象,从而影响酶的选择性[25].从循环伏安图来看,HRP⁃KGM/GC催化还原过氧化物与催化还原氧气没有区别.但催化还原氧气时,使用同一支HRP⁃KGM/GC电极,重复除氧⁃循环扫描/通氧⁃循环扫描过程,HRP对氧气的催化还原电流几乎没有变化,说明氧气对HRP的催化活性没有影响.而HRP⁃KGM/GC与浓度较高的过氧化物反应后,重复使用时,催化电流下降,说明HRP的酶活性会降低.这是由于过氧化物能将HRP氧化成较稳定的HRPFe(IV)=O,会使HRP部分失去活性.其失活的程度与过氧化物的浓度及电极在其溶液中放置的时间有关[26].电催化还原过氧化物的机理可表示如下:HRPFe(II)+ROOR➝HRPFe(IV)=O+ROH(1)HRPFe(IV)=O+H++e-➝HRPFe(III)(2)HRPFe(III)+H++e-➝HRPFe(II)(3)催化电流随着过氧化物浓度增加而增大,在一定浓度范围内呈线性关系(表1).HRP⁃KGM膜修饰电极在PBS/乙醇混合溶液中具有良好的重现性和稳定性.在0.065μmol·L-1的CHP溶液中,平行测量9次,其电流的相对标准偏差仅为0.086%,重复测量5次,其电流的相对标准偏差为2.44%.871Acta Phys.鄄Chim.Sin.(Wuli Huaxue Xuebao ),2006Vol.22AnalytesConcentration rangeLinear regression equationsCorrelation coefficients (R )Number of measurementshydrogen peroxide (μmol ·L -1)0.14~0.51I p =1.01+91.36c 0.99418cumene hydroperoxide(μmol ·L -1)0.016~0.18I p =4.55+163.64c 0.99612t ⁃butyl hydroperoxide (μmol ·L -1)0.045~0.49I p =8.28+229.72c 0.998252⁃butanone peroxide(μmol ·L -1)0.013~0.097I p =5.40+416.92c0.99215表1催化电流与过氧化物浓度的关系Table 1Relationship between catalytic current and concentration of peroxides3结论用循环伏安法研究了HRP ⁃KGM 膜修饰电极在有机溶剂/水混合溶液中的电化学和催化还原过氧化物的性质.包埋在KGM 水凝胶膜中的HRP 能与电极之间直接传递电子.在有机溶剂与水的混合溶液中,蛋白质仍表现出直接电化学和催化活性,表明有机溶剂并没有较大地影响蛋白质的构象及其催化功能,说明KGM 水凝胶中含水空腔在保持蛋白质构象和活性诸方面起了重要的作用.HRP ⁃KGM 膜修饰电极能快速地催化还原过氧化物,可用于这些物质的定量检测.References1Saini,S.;Hall,G.F.;Downs,M.E.A.;Turner,A.P.F.Anal.Chim.Acta,1991,249:12Dong,S.;Wang,B.Electroanalysis,2002,14:73Brusova,Z.;Ferapontova,E.E.;Sakharov,I.Y.;Magner,E.;Gorton,L.Electroanalysis,2005,17:4604Ruzgas,T.;Csoregi,E.;Emneus,J.;Gorton,L.;Markovarga,G.Anal.Chim.Acta,1996,330:1235Liu,B.;Fang,Y.;Kong,J.;Deng,J.Anal.Chim.Acta,1999,386:316Liu,H.;Lu,J.;Zhang,M.;Pang,D.Anal Sci.,2002,18:13397Tatsuma,T.;Okawa,Y.;Watanabe,T.Anal.Chem.,1989,61:23528Li,W.J.;Song,L.Z.;Sun,C.Q.;Wang,Z.C.;Guo,Y.P.;Zhao,C.;Xu,Y.K.Chem.J.Chin.Univ.,2001,22:1601[李文江,宋利珠,孙长青,王子忱,郭玉鹏,赵纯,徐英凯.高等学校化学学报(Gaodeng Xuexiao Huaxue Xuebao ),2001,22:1601]9Frew,J.F.;Hamer,M.A.;Hill,H.A.O.;Libor,S.I.J.Electroanal.Chem.,1986,201:110Jia,J.;Wang,B.;Wu,A.;Cheng,G.;Li,Z.;Dong,S.Anal.Chem.,2002,74:221711Luo,X.L.;Xu,J.J.;Zhang,Q.;Yang,G.J.;Chen,H.Y.Biosens.Bioelectron.,2005,21:19012Cai,C.X.;Chen,J.Acta Chim.Sinica,2004,62:335[蔡称心,陈静,化学学报(Huaxue Xuebao ),2004,62:335]13Tang,J.;Wang,B.;Wu,Z.;Han,X.;Dong,S.;Wang,E.Biosens.Bioelectron.,2003,18:86714Liu,H.H.;Chen,X.T.;Li,J.;Hill,H.A.O.Chinese J.Anal.Chem.,2001,29:511[刘慧宏,陈显堂,李俊,Hill,H.A.O.分析化学(Fenxi Huaxue ),2001,29:511]15Guo,Y.;Dong,S.Anal.Chem.,1997,69:190416Liu,H.;Tian,Z.;Lu,Z.;Zhang,Z.;Zhang,M.;Pang,D.Biosens.Bioelectron.,2004,20:29417Huang,R.;Hu,N.Bioelectrochemistry,200154:7518Razola,S.S.;Ruiz,B.L.;Diez,N.M.;Mark,H.B.;Kauffmann,J.M.Biosens.Bioelectron.,2002,17:92119Xiao,C.;Lu,Y.;Zhang,L.J.Appl.Polym.Sci.,2001,81:88220Harbury,H.A.J.Biol.Chem.,1957,225:100921King,B.C.;Hawkridge,F.M.;Hoffman,B.M.J.Am.Chem.Soc.,1992,114:1060322Ordaz,A.A.;Bedioui,F.Sensors and Actuators B,1999,59:12823Csoregi,E.;Gorton,L.;Marko ⁃Varga,G.;Tudos,A.J.;Kok,W.T.Anal.Chem.,1994,66:360424Tsai,W.C.;Cass,A.E.G.Analyst,1995,120:,224925Popescu,I.C.;Csoregi,E.;Gorton,L.Electroanalysis,1996,8:101426Schmidt,A.;Schumacher,J.T.;Reichelt,J.;Hecht,H.J.;Bilitewski,U.Anal.Chem.,2002,74:3037872。