甘蔗基因表达定量PCR分析中内参基因的选择_阙友雄

种 2, 为本实验室保存, 在甘蔗品种 F134 上繁殖。 采集植株上新鲜的发病黑穗, 装于纸袋, 经太阳晒干或
风干后密封, 储存在 4℃冰箱中备用。
1.2 方法
1.2.1 试验设计 采用托盆种植, 沙培, 种植 6 盆, 每盆 30 个芽, 置赛福 PGX-380C 光照培养箱中进行
培养。 培养条件为: 温度 27 ℃±0.5 ℃, 每日光照 13 h, 黑暗 11 h, 光照强度为 440 μmol·m-2·s-1。 甘蔗长至
仪。 以上述反转录 cDNA 产物的 10 倍稀释液作为实时定量 PCR 分析的模板， 反应体系为 25 μL： SYBR
Primix ExTaqTM(2×) 12.5 μL， 上游和下游引物各 0.5 μL， cDNA 模板 2.5 μL， 无菌水 9 μL。 每个样品设置 3
次重复。 反应条件如下： 95 ℃ 10 s； 94 ℃ 5 s、 60 ℃ 25 s， 40 个循环。 设置在延伸阶段收集荧光信号,
化因子的配对差异分析(Vn/n+1)， 判定内参基因的最适数目。
276
热带作物学报Leabharlann 30 卷1.2.5 甘蔗多酚氧化酶基因的表达分析 以 25S rRNA 的两对引物为内参引物， 采用与 1.2.4 中相同的定量 PCR 反应体系和程序， 进行甘蔗多酚氧化酶基因（SSU46014）的表达特性分析。 甘蔗 PPO 基因的定量 PCR 引物见表 1。 具体方法和步骤参见文献[10]。
录体系含： 2 μL 的 5×RT 缓冲液, 0.5 μL 的 10 mmol/L dNTPs, 1 μmol/L 的 Random 6 mers, ExscriptTM RTase
反转录酶 50 U, 0.25 μL Rnase Inhibitor, 1 μL 总 RNA(500 ng)作为模板, 用 RNase free H2O 补足 10 μL。 42 ℃， 10 min； 95 ℃, 2 min； 5 ℃， 5 min。 定 量 PCR 分 析 中 ， 所 用 仪 器 为 ABI PRISM7500 实 时 荧 光 定 量 PCR
cDNA Synthesis Kit 和 Advantage2 PCR Kit 进行 cDNA 第 1 链和第 2 链合成。
1.2.3 内参基因表达稳定性
的 定 量 PCR 分 析 根 据 定
量 PCR 引物设计原则， 分别 设计 4 种内参基因的定量
25S rRNA1 25S rRNA2
5 ATAACCGCATCAGGTCTCCAAG 3 5 CCTCAGAGCCAATCCTTTTCC 3
第 30 卷 第 3 期 2009 年 3 月
热带作物学报
CHINESE JOURNAL OF TROPICAL CROPS
Vol．30 No．3 Mar ． 2009
甘蔗基因表达定量 PCR 分析中内参基因的选择
阙友雄， 许莉萍 *， 徐景升， 张积森， 张木清， 陈如凯 福建农林大学农业部甘蔗遗传改良重点开放实验室， 福州 350002
样品的表达量定义为 1， 其他样品此内参基因的相对表达量则为 2-△Ct (△Ct=各样本 Ct 值-最小 Ct 值)， 将
这些数据导入 geNorm 程序。 在进行数据格式转换后（通过 “Change Data” 命令）， 利用 geNorm 程序计算
基因表达稳定度 M， 对内参基因的表达稳定度进行排序(M 值越小， 表达越稳定)， 最后根据内参基因标准
经 7500 System Software 分析获得各样本不同内参基因的循环域值(Ct 值)。
1.2.4 数据处理和分析 数据分析采用 Microsoft Office Excel 2003 和 geNorm 程序进行。 从 http://medgen.
ugent.be/~jvdesomp/genorm/网址下载 geNorm 程序， 在 Excel 中将不同样本中某一内参基因 Ct 值最小者对应
保存备用, 用于提取 RNA, 进行 4 种内参基因的表达稳定性分析和甘蔗多酚氧化酶的表达特性研究[8]。
1.2.2 RNA 提取和 cDNA 合成 甘蔗叶片总 RNA 的提取方法, 在传统的 Trizol 法的基础上略加改进[9]；
对提取的总 RNA 进行琼脂糖凝胶电泳和紫外分光光度检测。 并分别采用 CLONTECH 公司的 SMART PCR
* 通讯作者， 许莉萍, E-mail: xlpmail@。
收稿日期： 2008-10-30
修回日期： 2009-01-20
３期
阙友雄等： 甘蔗基因表达定量 PCR 分析中内参基因的选择
275
果进行统计学分析， 评价各内参基因表达的稳定性和甘蔗基因表达分析中最适合内参基因数目。 此外， 还 利用所筛选出的内参基因， 对甘蔗 PPO 基因在黑穗病菌侵染后的表达特性进行研究。 旨在探讨甘蔗基因 表达定量 PCR 分析中内参基因的选择， 为植物基因表达中内参基因的选择提供理论依据。
1 材料与方法
1.1 植物材料
供 试 甘 蔗 品 种 为 NCo376, 由 福 建 农 林 大 学 甘 蔗 综 合 研 究 所 提 供 。 选 取 健 康 、 生 长 期 一 致 的 甘 蔗
（Saccharum Complex）品种 NCo376 蔗茎为材料。 供试菌株为甘蔗黑穗病菌（Ustilago scitaminea Syd）生理小
5S 图 1 甘蔗组织总 RNA 电泳图
Average expression stability M
2.2 内参基因的表达稳定性分析和最适数目判定 在定量 PCR 分析中， 基因表达的准确性与合适的内
参基因的选用密切相关。 为此， Vandesompele 等[6]基于微 软 Excel 平 台 ， 编 写 了 VBA 宏 程 序 geNorm， 用 于 候 选 内参基因的表达稳定度排序及合适的内参基因数目的筛 选 。 在 本 研 究 中 ， 25S rRNA1、 25S rRNA2、 GAPDH、 β-actin 和 β-tubulin 表达稳定度的平均值 M 依次为0.054、 0.056、 0.226、 0.605 和 0.843， 表达稳定度由高到低排序 依 次 为 25S rRNA1>25S rRNA2>GAPDH>β-actin>β-tubulin
5 CACGGCCACTGGAAGCA 3 5 CTGGAATGGTCAAGGCTGGT 3 5 CCAAGTTCTGGGAGGTGATCTG 3 5 AAGGTCTCCCTCTGCATCAC 3
5 TCCTCAGGGTTCCTGATGCC 3 5 TCCTTCTGTCCCATCCCTACC 3 5 TTGTAGTAGACGTTGATGCGCTC 3 5 TTGATCGTCACCTTTGCATT 3
2 结果与分析
2.1 总 RNA 的提取
28S
18S
图 1 显示， 所有 RNA 样品均有完整带型的 5S、 18S 和 28S， 28S
与 18S 比值约为 2； 紫外分光光度计检测中 A260/A280 均在 1.98~2.00 之 间 。 电 泳 和 定 量 分 析 结 果 说 明 RNA 样 品 没 有 发 生 降 解 ， 质 量 良 好, 能满足后续试验操作的要求。
5 GCAGCCAAGCGTTCATAGC 3
5 CCTATTGGTGGGTGAACAATCC 3
PCR 引 物 ， 其 中 25S rRNA 基因设计了两对引物， 分别 位 于 5' 和 3' 端 ， 引 物 具 体 序 列 见 表 1。 10 μL 的 反 转
GAPDH ß-actin ß-tubulin PPO
5 叶期时, 进行 2 种处理, 即 5×105 个孢子/mL 黑穗病菌孢子悬浮液针刺接种甘蔗芽部组织, 同时以蒸馏水
处理作为对照, 选择生长比较一致的 20 株, 其+1 叶、 +2 叶和+3 叶为取样叶片， 分别在处理后 0、 6、 12、
24、 48、 60 和 72 h 时间点用直径 1 cm 打孔器取样, 每叶片取一块， 立即用液氮固定, 置于-80 ℃冰箱中
理想的内参基因应是在各种实验环境和影响因子作用下， 在各种类型的组织或细胞中恒定或相对稳定 表达。 然而， 大量的研究结果表明， 任何一种内参基因的所谓恒定表达都是相对的， 在一定类型的细胞或 实验因素作用下恒定表达的某内参基因， 在其他类型的细胞中或实验因素作用下可能是变化的。 25S rRNA、 GAPDH、 β-actin 和 β-tubulin 是植物学研究中最常用的 4 种内参基因[3]。 rRNA 占总 RNA 量的 80％， 含量 稳定， 是定量 PCR 分析中潜在的理想内参基因， 已经有不少应用[3,4]。 甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（GAPDH） 作为内参基因在动植物研究中已被广泛应用。 肌动蛋白在真核细胞进化过程中高度保守。 微管由 α-tubulin 和 β-tubulin 组成， 其中编码 β-tubulin 的 β-tubulin 基因具有良好的有保守性。 迄今， 尚无一种内参基因 可适用于所有样本以进行校正和标准化， 盲目地使用一种或几种内参基因， 一方面难以发现基因表达的微 小差异， 另一方面可能引致错误甚至相反的结论 。 [5～7] 因此， 在定量 PCR 分析中， 必须根据样品的不同， 选择最合适的 1 个或 1 个以上的内参基因进行校正， 以尽可能除去不稳定因素， 获得可靠的实验结果。 geNorm 程序是一种内参基因选择的良好工具， 该程序首先将某一内参基因与其他内参基因表达水平进行 两两比较和对数转换， 获得其平均标准差， 而后将该平均标准差作为基因表达稳定度的平均值 M， 对所有 候选内参基因的表达稳定度进行排序， 同时根据标准化因子的配对差异分析结果判定所需内参基因的最适 数目[6]。 目前国内尚未见甘蔗基因表达定量 PCR 分析内参基因筛选的相关报道 。 本研究选择 25S rRNA、 GAPDH、 β-actin 和 β-tubulin 共 4 个内参基因， 其中 25S rRNA 设计了两对定量 PCR 引物， 通过实时定量 PCR 技术对受到黑穗病菌侵染后甘蔗中各内参基因的表达水平进行检测。 而后利用 geNorm 程序对检测结
基金项目： 国家高技术研究发展计划(863 计划)项目(No. 2007AA100701)， 农业部引进国际先进农业科学技术计划(948 计划)项目(No. 2006-G37)，
福建省科技厅国家科技项目备案(No. F2007AA100701)， 现代农业产业技术体系建设专项资金资助。
作者简介： 阙友雄， 男, 1979 年生, 博士。 研究方向: 植物抗病分子生物学。
摘要 以甘蔗接种黑穗病菌后 0、 6、 12、 24、 48、 60 和 72 h 时间点的材料为研究对象, 应用实时荧光定量 PCR （real-time quantitative PCR, Real-time qPCR）技术, 探讨 25S rRNA、 GAPDH、 β-actin 和 β-tubulin 4 个内参基因mRNA 水平的表达情况。 经 geNorm 程序统计学分析, 4 种内参基因的表达稳定性各异, 25S rRNA>GAPDH>β-actin>β-tubulin, 其中以 25S rRNA 表达稳定性最好， 且根据该基因设计的两对定量 PCR 引物都是可行的。 同时, 甘蔗 PPO 基因表 达特性的定量 PCR 分析也显示, 甘蔗 PPO 基因与植物的抗病性相关。 结果显示， 研究 中 所 筛 选 的 内 参 基 因 是 合 适的。 关键词 内参基因； geNorm 程序； 基因表达； 实时定量 PCR； 多酚氧化酶基因 中图分类号 S566.1
实时荧光定量 PCR(real-time quantitative PCR, Real-time qPCR)是一种新型 PCR 技术， 该技术利用 PCR 反应体系中添加的特定荧光基团， 实时监测整个 PCR 进程中产物的变化， 即荧光信号的累积， 从而 对 DNA、 RNA 样品或者目标基因的表达进行定性或者定量分析[1]。 为了获得真实可靠的实验结果， 在此 过程中通常采用内参基因进行数据校正和标准化， 以消除不同样品在 RNA 产量、 质量以及反转录效率上 可能存在的差别[2]。