细胞培养常用器材与试剂
细胞培养的四个步骤
细胞培养的四个步骤细胞是组成生物体的基本单位，生物体由各种类型的细胞组成。
在显微镜下不同的细胞有不同的形态。
利用免疫荧光、流式荧光标记、免疫组化都能进行细胞观察。
培养细胞的最终目的：拿到细胞进行后续的下游实验WB、ELISA等蛋白检测DNA、RNA等分子检测凋亡、增殖、周期等功能检测原代细胞培养、冻存等细胞实验细胞培养几乎是所有细胞生物学实验的基础，细胞养得好，实验没烦恼！原代细胞培养，细胞的传代，冻存、复苏，细胞污染的防与治，我们的经验都在这篇文章里！一、细胞培养相关设备和试剂1、细胞培养的相关设备生物安全柜的安全保护等级>超净工作台，当涉及到病毒，需要使用生物安全柜。
生物安全柜：对柜内外的安全保护超净工作台：对工作台内部的安全保护超净工作台/生物安全柜的工作流程：2、细胞培养用相关试剂①培养基作用：人工模拟细胞体内生长的营养环境，维持细胞生长的营养物质，提供细胞营养和促进细胞生长增殖的物质基础。
不完全培养基：直接购买或者配置的培养基。
完全培养基：不完全培养基+血清（提供营养物质）+双抗（保证无菌环境）+其他。
由于细胞种类和培养条件不同，适宜的合成细胞培养基也不同，在动物细胞培养中最常用基础细胞培养基有6～7种，如BME、MEM、DMEM、HAMF12、RPMI1640、199等。
②血清血清的功能：生长、分化必须的物质：生长因子、激素、基础培养基中没有的微量物质、小分子营养物转运维生素、脂类、金属离子和微量元素等；促进细胞贴壁、铺展；毒素灭活，蛋白质与有毒金属和热源物质结合；提供蛋白酶抑制剂；起酸碱度缓冲液作用。
血清的分类最常用的是胎牛血清。
胎牛还未接触外界，免疫系统激活最少，血清中所含的抗体、补体等对外来物质排斥最小，对细胞有害的成分最少。
③胰酶常用0.25%胰蛋白酶+0.02%EDTA胰酶：胰脏中分离，选择性的水解蛋白质中有赖氨酸或精氨酸的羧基所构成的肽链，最佳作用温度37℃，PH=8.0，常用浓度0.1%—0.25%，一般用不含Ca2+、Mg2+的平衡盐缓冲液配制（PBS或Hanks），可用含有血清培养基终止胰酶对细胞的作用（观察细胞的剥离状态确定终止时间）。
细胞培养试剂及操作流程
实验规范化流程一、细胞培养所需1、10%FBS 1640培养液。
2、10%FBS DMEF/12培养液。
3、10%FBS DMEM/High Glucose 培养液。
4、PBS ：商品化的粉末，一袋溶于2L 去离子水中，高压后4℃保存。
5、胰酶6、冻存液：10%DMSO 、>10%FBS ，其余成分为16407、真核抗生素：G418: 50mg/mlMDA-MB-231 800ug/mlMCF-7 800ug/ml SK-BR3 100ug/mlT47D 400ug/ml)嘌呤霉素（Puromycin ）:10mg/mL 、MCF-7 4ug/ml T47D 1ug/mlMDA-MB-231 5ug/ml潮霉素（Hygromycin B ）:50mg/mL T47D 200ug/mlMDA-MB-231 800ug/mlMCF-7 50ug/ml 8、原核抗生素：双抗（抗青霉素、链霉素）（使用浓度：1%原液）环丙沙星左氧氟沙星（储存浓度5mg/ml ，使用浓度5ug/ml ）9、细胞因子：IL-6、EGF （10ug/ml ）10、抗肿瘤药物：阿霉素（储存浓度50Mm,使用浓度0.01mM ）一、细胞培养相关技术1、细胞复苏准备：37℃水浴锅、培养液、15ml 离心管、滴管、培养瓶或培养皿试验流程：（1）将细胞从-80℃或液氮取出，遵”慢冻速溶“的原则，迅速在37℃下使其液化。
（2）将融化的细胞悬液加入适量新鲜培养液稀释吹匀，转移到15ml 离心管内。
（3）将离心管以1000rpm 转速离心5min 。
（4）小心弃去上清，最好用枪头除尽，加入新鲜的培养液6ml ，重选吹匀后转移到细胞培养瓶或培养皿，放入37℃、5%CO2细胞培养箱内培养。
2、细胞传代准备：胰酶、培养液、培养瓶或培养皿、15ml离心管、滴管实验流程：（1）将覆盖率达80-90%的对数生长期细胞弃去培养液，尽量将培养液洗净，必要时加PBS冲洗，以防止培养液对胰酶的终止作用。
细胞培养基本实验操作一般培养试剂介绍常用培养基及基本特性 HBSS的配制和使用攻略
常用培养基及基本特性1、RPMI-1640 MediumRPMI-1640广泛应用于哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞，杂交瘤细胞的培养，是目前应用十分广泛的培养基。
主要用于悬浮细胞培养。
其它像K-562、HL-60、Jurkat、Daudi、IM-9等成淋巴细胞、T细胞淋巴瘤细胞以及HCT-15上皮细胞等均可参考使用。
2、Minimum Essential Medium（MEM）也称最低必需培养基，它仅含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺和8种维生素。
成分简单，可广泛适应各种已建成细胞系和不同地方的哺乳动物细胞类型的培养。
MEM-Alpha一般用于培养一些难培养细胞类型，而其它没有特殊之处的细胞株则几乎均可采用MEM来培养。
3、DMEM-高糖（标准型）是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养,更适合高密度悬浮细胞培养。
适用于附着性较差，但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养，也可用于杂交瘤中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养。
4、DMEM-低糖（标准型）是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养。
低糖适于依赖性贴壁细胞培养，特别适用于生长速度快、附着性较差的肿瘤细胞培养。
5、DMEM/F12DMEM/F12培养基适于克隆密度的培养。
F12培养基成分复杂，含有多种微量元素，和DMEM以1：1结合，称为DMEM/F12培养基（DME/F12medium），作为开发无血清配方的基础，以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分为优点。
该培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养。
为了增强该培养基的缓冲能力，改良之一是在DMEM/F12（1：1）中加入15mM HEPES缓冲液。
6、McCoy’s 5AMcCoy’s 5A Medium 主要为肉瘤细胞的培养所设计，可支持多种（如骨髓、皮肤、肺和脾脏等）的原代移植物的生长，除适于一般的原代细胞培养外，主要用于作组织活检培养、一些淋巴细胞培养以及一些难培养细胞的生长支持。
细胞培养过程中的注意事项及试剂配制
细胞培养过程中的注意事项及试剂配制一.常用设备准备室的设备：单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。
配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。
培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。
必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO孵箱（孵育培养物）、2水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。
二.无菌操作无菌室的灭菌：1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。
2.CO孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者20.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。
实验人员的无菌准备：1.肥皂洗手。
2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用75％酒精棉球擦净双手。
无菌操作的演示：1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精灯火焰操作。
3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。
5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。
如吸管不能碰到废液缸。
6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。
三.器械的清洗和消毒玻璃器械洗消：(1)新的玻璃器皿的洗消：1.自来水刷洗，除去灰尘。
2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。
3.刷洗、烘干：12小时后立即用自来水冲洗，再用洗涤剂刷洗，自来水冲干净后用烤箱烘干。
细胞工程实验总结
实验一、细胞培养实验器材和试剂的准备1、哪些物品适合于高压灭菌，并说明理由。
①材料：微孔滤膜(直径25 cm)：孔径为0.22μm、微孔滤膜(直径90 cm)：孔径为0.22 μm、过滤器(直径25 cm)。
②仪器和器材：眼科剪刀和镊子、长镊子、培养皿、培养瓶、试剂瓶（或盐水瓶）、移液枪、10毫升试管、10毫升离心管、巴氏吸管、5毫升（或10毫升）吸量管、不锈钢过滤器、塑料过滤器、注射器、超净工作台、干燥箱、高压灭菌锅、正压泵。
理由：适合于高压灭菌是布类、橡胶制品(如胶塞)、金属器械、玻璃器皿、某些耐高温的塑料制品以及加热后不发生沉淀的无机溶液(如Hanks液、PBS等)。
2、细胞培养常用液体如何配制和灭菌？1）PBS ：8.0g NaCl、0.2gKCl、2.2gNa2HPO4、0.12gKH2PO4溶于1000 mL双蒸水，高压灭菌，4℃保存。
（准备试剂瓶）灭菌方法：高压灭菌。
2）干粉培养基过滤除菌（先准备好不锈钢过滤器及滤膜，安装后高压灭菌，适度烘干；铝盒4个，三角瓶2个，容量瓶，不锈钢过滤器一套，酒精灯，酒精棉球3瓶，吸耳球3个，吸量管10毫升和5毫升各5根，分装用瓶，血清，超纯水，抗生素）认真阅读说明书。
说明书都注明干粉不包含的成分，常见的有NaHCO3、谷氨酰胺、丙酮酸钠、HEPES等。
这些成分有些是必须添加的，如NaHCO3、谷氨酰胺，有些根据实验需要决定。
配制方法（1L）：1）在一个尽可能接近总体积的容器中加入大约500mL双蒸水。
2）在室温（20℃到30℃）的水中加入干粉培养基。
3）水洗袋内残留培养基，全部转移到容器内，轻轻搅拌，不要加热。
4）完全溶解之后，1袋1L粉状DMEM加3.7g NaHCO3，1mmoL∕L丙酮酸钠，即0.11g/L，添加双抗。
5）用双蒸水定容到1L，搅拌溶解。
注意不要过分搅拌。
6）通过缓慢搅拌加入1N NaOH 或1N HCL调节pH值培养基在过滤前要保持密封。
生物实验室器材清单表
生物实验室器材清单表一、基本实验器材•称量仪器：电子天平、分析天平、移液器等。
•容器：试管、烧杯、量筒、离心管、培养皿等。
•温度控制设备：恒温水浴锅、恒温培养箱、恒温恶冷冻箱等。
•搅拌设备：磁力搅拌器、振荡器等。
•过滤设备：滤纸、滤液漏斗、滤膜、滤芯等。
•离心设备：高速离心机、台式离心机等。
•加热设备：电热板、电炉、燃气灶等。
•p H计：用于测量溶液的酸碱度。
•光学设备：显微镜、反射显微镜等。
二、分子生物学实验器材•离心管架：用于离心管的固定和摇晃。
•冻存管和冻存管盒：用于样品的长期保存和冷冻。
•培养皿和培养瓶：用于生物样品的培养和生长。
•PCR试管和PCR板：用于聚合酶链式反应(PCR)实验。
•电泳仪和电泳槽：用于DNA或蛋白质的分离和检测。
•转印设备：用于将DNA或蛋白质转移到膜上。
•半自动和全自动PCR仪：用于PCR反应的自动化控制。
•基因测序仪：用于测定DNA序列。
•真空泵和真空过滤器：用于快速过滤和生物样品的处理。
•超低温冰箱：用于存放生物样品和试剂。
三、细胞生物学实验器材•细胞培养器：细胞培养瓶、细胞培养皿等。
•色素和荧光标记试剂：用于细胞成像和染色。
•显微镜和显微摄像系统：用于观察和记录细胞结构和功能。
•细胞计数仪：用于计算细胞数量和密度。
•酶消解试剂：用于细胞的消化和分离。
•均质机和超声波颚化器：用于细胞的破碎和分散。
•细胞培养水浴锅和细胞培养箱：用于细胞培养的温度控制。
•细胞冻存液和细胞恢复液：用于细胞冻存和解冻。
四、免疫学实验器材•免疫试剂盒：用于免疫检测和定量。
•过滤膜和孔板：用于免疫试剂的过滤和固定。
•孵育箱和孵育器：用于免疫试剂的孵育和反应。
•光谱仪和荧光仪：用于测量光信号和荧光强度。
•干燥器和浓缩器：用于免疫样品的脱水和浓缩。
•凝胶电泳仪和蛋白质标记试剂：用于免疫印迹和蛋白质定量。
•细胞悬液和抗体标记试剂：用于免疫细胞的染色和标记。
五、遗传学实验器材•DNA提取试剂盒和RNA提取试剂盒：用于提取DNA和RNA。
细胞培养常识
细胞培养目录1. 实验所需器材 (3)1.1超净工作台 (3)1.2 超净实验室 (3)1.3 细胞培养箱 (3)1.4 冰箱 (3)1.5 细胞储存设备 (3)1.6 液体除菌过滤装置 (3)1.7 高温高压消毒装置 (3)1.8 离心机 (4)1.9 血细胞计数板 (5)2.0其他 (5)2.细胞培养试剂器材处理 (5)2.1 培养液 (5)2.2 血清 (5)2.3 培养用品清洗 (5)2.3.1 玻璃器皿的清洗 (5)2.3.2 橡胶制品清洗 (6)2.3.3 塑料制品的清洗 (6)2.4包装 (6)2.5灭菌 (6)2.6细胞房的日常维护 (6)3. 细胞培养所需液体的配制 (7)3.1培养液 (7)3.2胰蛋白酶溶液 (7)3.3 血清 (7)3.4 PBS与MTT (7)3.5 冻存液 (7)3.6 洗液 (7)3.7新洁尔灭配制 (8)3.8 消毒液配制 (8)4. 细胞培养基本操作 (8)4.1 无菌操作 (8)4.2 原代培养 (8)4.3 传代培养 (8)4.3.1传代前准备 (8)4.3.2 胰蛋白酶消化 (9)4.3.3吹打分散细胞 (9)4.3.4 分装稀释细胞 (9)4.3.5 继续培养 (9)4.4 MTT法筛选药物活性 (9)4.4.1种板 (9)4.4.2 细胞计数方法 (9)4.4.3 初始浓度化合物的配制 (10)4.4.4 加药 (10)4.4.5 加MTT (10)4.4.6加DMSO (10)4.5 细胞冻存 (10)4.6 细胞复苏 (11)1.实验所需器材1.1超净工作台这是一般实验室可采用的普及型无菌操作装置，其工作原理是利用鼓风机驱动空气经过高效过滤装置净化后在通过工作台面，在工作台面构成无菌环境，超净工作台应放在清洁无尘的房间，普通超净台可作生物安全I一级安全柜使用。
1.2 超净实验室空气洁净度应达到104颗粒/m3以下，并且应具有紫外杀菌装置，无菌操作间的房顶、墙壁、地面均应光滑、无死角、并定期进行清洁、消毒、检测。
细胞培养常用试剂配制
常用试剂配制
PBS溶液配制：用电子天平准确称取NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，KH2P04 0.29 g，Na2HP04—12H20 1.42 g溶于800 mL的超纯水中，用磁场搅拌器搅拌至溶解后调节pH值为7.2～7.4，然后定容至1L。
置于高压灭菌锅中灭菌30min，冷却到室温后分装，于4℃冰箱冷藏备用。
DMEM／12高糖培养液：将袋装的DMEM／12粉末溶于800ml的超纯水中，同时加入3.79碳酸氢钠，66mg青霉素钠和100mg的硫酸链霉素，用磁力搅拌器充分混匀，调节pH值为7.2-7.4，然后定容至1L。
用孔径为0.229μm的滤膜过滤除菌，分装后置于4℃冰箱冷藏备用。
用于培养细胞的培养液为上述DMEM／12高糖溶液中加入10％-20％(体积比)的胎牛血清。
0.25％胰蛋白酶一0.02％EDTA消化液：准确称取0.25g的Trypsin和0.02g的EDTA，用PBS在容量瓶中定容至100ml，调节pH值为7.2-7.4，用孔径为0.22μm的滤膜过滤除菌，用2mL的离心管分装，冻存于-20℃冰箱备用。
双抗：80mL的超纯水中加入80万u的青霉素钠和100万u的硫酸链霉素，0．22μm的滤膜过滤除菌后，用2mL的离心管分装，冻存于-20℃冰箱备用。
二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO)冻存液：将DMSO、FBS和DMEM／12按1：3：6的比例混匀，现配现用。
细胞培养中的常用试剂
1.pbs缓冲液PBS是磷酸缓冲盐溶液（phosphate buffer saline）一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用。
它是生物化学研究中使用最为广泛的一种缓冲液，主要成分为Na2HPO4、KH2PO4、NaCl和KCl，由于Na2HPO4和KH2PO4它们有二级解离，缓冲的pH值范围很广；而NaCl和KCl主要作用为增加盐离子浓度。
如有需要PBS还可以补加1 mmol/L CaCl2和0.5 mmol/L MgCl2，以提供双价阳离子。
注：PBS不是磷酸缓冲液（phosphate buffer solution，PB）保存方法高温高压灭菌后置于4摄氏度冰箱保存待用。
PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 10mmol/L， KH2PO42mmol/LPBS缓冲液一般作为溶剂，起溶解保护试剂的作用，具体试剂一般也有不同的比例配方，在针对性上就有了更好的效果。
1x PBS缓冲液就是0.01M的PBS,可直接使用,2x PBS 就是2倍浓度,使用时稀释一倍使用。
0.1M的PBS一般不用来配置缓冲液,用于其它用处。
作用PBS是磷酸缓冲盐溶液的简称，不仅伪狂犬病毒要用它稀释，一般的有活性的生物制剂都要用它来稀释。
原因就是它具有盐平衡、可调整的适宜pH缓冲作用，蒸馏水不具有盐平衡作用，可以破坏生物蛋白的结构及生物特性；生理盐水不具有调整pH的作用，对完整的、具有活性的物质不能保证其在最适条件下参与生物反应，所以使用PBS是首选。
PBS也不是万能的，有的生物活性物质需要的条件比PBS还要高，就需要在平衡缓冲液中加入2.DMEM培养液DMEM是一种含各种氨基酸和葡萄糖的培养基，是在MEM培养基的基础上研制的。
与MEM比较增加了各种成分用量，同时又分为高糖型（低于4500mg/L）和低糖型(低于1000mg/L)。
高糖型有利于细胞停泊于一个位置生长，适于生长较快、附着较困难肿瘤细胞等 DMEM 是 dulbecco's modified eagle medium的缩写，所以其特点主要包括以下：（1）氨基酸含量为依格尔培养基的2倍，且含有非必需氨基酸，如甘氨酸等；（2）维生素含量为依格尔培养基的4倍；（3）含有糖酵解途径中的重要物质——丙酮酸；（4）含有微量的铁离子。
细胞培养实验室常用仪器设备
· 电热恒温培养箱、电热恒温干燥箱的使用 方法
· CO2培养箱的供气调节和消毒方法
· 净化台使用注意事项
自动双重纯水蒸馏器
· 纯水蒸馏器使用方法
自动双重纯水蒸馏器
· 纯水蒸馏器使用方法
自动双重纯水 蒸馏器
自动双重纯水蒸馏器
· 纯水蒸馏器使用注意事项
压力蒸汽消毒器
电热恒温培养箱
· 适合细菌培养和封闭式细胞培养 · 培养箱温度变化不要超过0.5℃ · 箱内物品不宜过挤．保持热空气畅通流动和
箱内平均受热 · 箱内底板因接近电热器，不宜放置实验物品
电热恒温干操箱
· 主要用于烘干和干热消毒玻璃器皿
液氮生物容器
· 主要用于冻存细胞、组织块等活性材料
液氮生物容器
CO2培养箱
· 通常使用条件为37 ℃，5％ CO2
C使用方法和 意事项
细胞培养实验室常用的仪器设备
实验目的
· 了解细胞培养中常用仪器设备的使用方法、 注意事项和保养方法。
实验用品
· 净化台 · 自动双重纯水蒸馏器 · 培养箱 · 抽气泵 · 压力蒸汽消毒器 · 电热干燥箱 · 电热恒温培养箱 · 电动吸引器 · 液氮罐
净化台
· 净化台的工作原理
– 利用鼓风机驱动空气通过高效滤器除去空气中 的尘埃疯粒，使空气得到净化
生物实验室器材清单
生物实验室器材清单实验室是生物科学研究的重要场所，为了开展各种生物实验，科研人员需要配备一系列先进的生物实验室器材。
本文将介绍一些常见的生物实验室器材。
1. 显微镜显微镜是生物实验室中最基本的仪器之一。
它可以放大细胞和微生物等微小物体，使之可见。
常见的显微镜有光学显微镜和电子显微镜。
光学显微镜透过可见光进行观察，适用于观察活体细胞及组织。
电子显微镜则使用电子束，具有更高的放大倍数和分辨率，适用于观察更小的细胞结构。
2. 离心机离心机是用于分离液体混合物中不同密度物质的实验室仪器。
通过高速旋转离心管，根据物质的密度差异，使其在管内分层。
离心机广泛应用于细胞培养、DNA 提取、蛋白质纯化等实验过程中。
3. 培养箱培养箱是用于培养和保存微生物、细胞和组织的设备。
它提供了恒定的温度、湿度和光照条件，满足生物样本的适宜生长环境。
培养箱通常配备了温度控制装置、湿度控制器和紫外线灯等。
4. PCR仪PCR仪是一种用于核酸扩增实验的仪器。
通过PCR技术，科研人员可以在短时间内扩增出大量的目标DNA片段或RNA。
PCR仪具有精确的温度控制装置和均匀的热传导性能，确保PCR反应的准确性和可重复性。
5. 电泳装置电泳装置用于分离和检测DNA、RNA和蛋白质等生物大分子。
通过施加电场，使带电粒子在凝胶中迁移，根据它们的大小和电荷大小进行分离和分析。
电泳装置通常包括电泳槽、电源、凝胶和可视化系统等。
6. 试剂盒试剂盒是生物实验室中使用最广泛的一种器材。
它包含了各种生化试剂和缓冲液，为实验提供所需的试剂和反应条件。
常见的试剂盒有DNA提取试剂盒、蛋白质定量试剂盒和酶联免疫吸附试剂盒等。
7. 培养皿和离心管培养皿和离心管是生物实验室中常见的实验用具。
培养皿用于培养和观察微生物、细胞和组织等样本，离心管用于保存生物样本和进行离心实验。
它们通常由透明的塑料或玻璃制成，便于观察和操作。
8. 试管和移液器试管和移液器是进行实验操作时常用的工具。
细胞培养过程中的注意事项及试剂配制
细胞培养过程中的注意事项及试剂配制细胞培养过程中的注意事项及试剂配制一.常用设备准备室的设备：单蒸馏水蒸馏器、双蒸馏水蒸馏器、酸缸、烤箱、高压锅、储品柜（放置未消毒物品）、储品规（放置消毒过的物品）、包装台。
配液室的设备：扭力天平和电子天平（称量药品）、PH计（测量培养用液PH值）、磁力搅拌器（配置溶液室搅拌溶液）。
培养室的设备：液氮罐、储品柜（存放杂物）、日光灯和紫外灯、空气净化器系统、低温冰箱（-80℃）、空调、二氧化碳缸瓶、边台（书写实验记录）。
必须放在无菌间的设备：离心机（收集细胞）、超净工作台、倒置显微镜、CO2孵箱（孵育培养物）、水浴锅、三氧消毒杀菌机、4℃冰箱（放置serum和培养用液）。
二.无菌操作无菌室的灭菌：1.定期打扫无菌室：每周打扫一次，先用自来水拖地、擦桌子、超净工作台等，然后用3‰来苏尔或者新洁尔灭或者0.5％过氧乙酸擦拭。
2.CO2孵箱（培养箱）灭菌：先用3‰新洁尔灭擦拭，然后用75％酒精擦拭或者0.5％过氧乙酸，再用紫外灯照射3.实验前灭菌：打开紫外灯、三氧杀菌机、空气净化器系统各20-30分钟4.实验后灭菌：用75％酒精（3‰新洁尔灭）擦拭超净台、边台、倒置显微镜的载物台。
实验人员的无菌准备：1.肥皂洗手。
2.穿好隔离衣、带好隔离帽、口罩、放好拖鞋3.用75％酒精棉球擦净双手。
无菌操作的演示：1.凡是带入超净工作台内的酒精、PBS、培养基、胰蛋白酶的瓶子均要用75％酒精擦拭瓶子的外表面2.靠近酒精灯火焰操作。
3.器皿使用前必须过火灭菌4.继续使用的器皿（如瓶盖、滴管）要放在高处，使用时仍要过火。
5.各种操作要靠近酒精灯，动作要轻、准确，不能乱碰。
如吸管不能碰到废液缸。
6.吸取两种以上的使用液时要注意更换吸管，防止交叉污染。
三.器械的清洗和消毒玻璃器械洗消：(1)新的玻璃器皿的洗消：1.自来水刷洗，除去灰尘。
2.烘干、泡盐酸：烤箱中烘干，然后再浸入5％稀盐酸中12小时以除去脏物、铅、砷等物。
细胞培养常用器材与试剂
器材与试剂干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器等具体步骤1. 水：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。
需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.2. PBS (也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。
用HCl或NaOH调PH到7.4。
移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。
注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
3. 胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。
不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。
胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。
使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。
因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。
终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。
搅拌混匀，置于4℃内过夜。
用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。
然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
4. 0.05％胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液称取胰蛋白酶粉末（1：250）0.05g，EDTA 0.02g，加入PBSA 100ml，0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装，于－20℃保存。
细胞培养PBS配方
细胞培养PBS配方
所需试剂和设备:
-NaCl(氯化钠)
-KCl(氯化钾)
-Na2HPO4(磷酸氢二钠)
-KH2PO4(磷酸二氢钾)
-无菌水
-电子天平
-烧杯和量筒
-反应管和磨研器
步骤:
1.称取所需试剂。
根据下述配方，称取正确比例的NaCl、KCl、
Na2HPO4和KH2PO4、确保所有试剂都是无菌的，并在称取时保持清洁卫生。
2.备制1L的PBS溶液。
将称取的试剂添加到烧杯中，并用无菌水稀
释至1L。
3.搅拌混合。
使用一个电子磨研器或类似的设备，将溶液进行彻底的
混合以确保所有试剂充分溶解。
尽可能避免气泡的形成。
4.pH调节。
使用pH计来测定溶液的pH值。
根据需要，使用NaOH或HCl溶液调节pH值。
PBS的理想pH值为7.4左右。
5.灭菌。
将溶液装入无菌试管中，并将其密封。
以121°C的温度下，在高压蒸汽灭菌器中处理溶液。
处理时间为15-20分钟。
注意事项:
-在制备PBS时务必保持实验室的环境无菌，因为这种溶液广泛应用
于细菌和真菌的生长培养中。
-要使用新鲜的试剂来制备PBS，以避免试剂的老化和变质。
-处理溶液时要小心，避免对溶液的污染。
使用无菌操作来减少污染
的风险。
-在制备PBS溶液之前，请先确保相关设备（如烧杯、磨研器等）已
经过彻底清洁和消毒处理。
细胞培养-Protocol
细胞培养是一项常用的生物技术，其原理是基于细胞在适当的培养条件下能够维持存活和增殖的能力。
通过细胞培养，可以获得大量的细胞样本，用于研究、药物筛选、疾病治疗等应用。
以下是细胞培养的原理、所需试剂和耗材、实验仪器、准备工作、实验方法、注意事项、常见问题及解决方法。
一、原理细胞培养的基本原理是模拟细胞在生物体内的生长环境，提供细胞生存和增殖所需的基本条件。
这些条件包括适当的温度、湿度、营养物质（如氨基酸、葡萄糖、脂肪酸等）和气体环境（如氧气、二氧化碳等）。
通过提供这些适宜的条件，细胞可以在体外环境中维持生存和增殖。
细胞培养中涉及的关键生物学过程包括细胞的贴壁、增殖和传代。
细胞的贴壁是指细胞在培养瓶内附着于瓶壁上的过程，这通常发生在细胞悬液加入培养液之后。
细胞贴壁后，会开始进行有丝分裂，进行增殖生长。
当细胞数量增加到一定程度时，需要将培养瓶中的细胞传代到新的培养瓶中，以维持细胞的适宜生长密度。
二、所需试剂和耗材细胞培养所需的主要试剂和耗材包括：1.培养基：为细胞提供基本的营养物质，如胎牛血清、氨基酸、葡萄糖等。
2.添加剂：包括抗生素、抗真菌药物等，用于防止培养过程中的污染。
3.培养瓶：用于细胞的培养，有不同的规格和形状。
4.移液器：用于吸取和转移细胞悬液和培养液。
5.离心管：用于离心收集细胞。
6.过滤器：用于过滤培养液中的杂质和颗粒。
7.DEPC水：用于制备无RNA酶的水。
8.无菌操作台：用于进行无菌操作，防止污染。
三、实验仪器细胞培养常用的实验仪器包括：1.细胞计数器：用于细胞计数和细胞密度测量。
2.显微镜：观察细胞的生长情况和形态变化。
3.CO2培养箱：为细胞提供适宜的生长温度和气体环境。
4.高压灭菌器：用于消毒处理实验器材和试剂。
5.超净工作台：用于进行无菌操作。
6.分光光度计：用于测量细胞生长的生化指标，如蛋白质含量等。
四、准备工作在进行细胞培养前，需要进行以下准备工作：1.选择适当的细胞：根据实验需求选择适合的细胞，了解其特性、来源和培养条件。
细胞培养专用的试剂和耗材介绍
细胞培养技术也叫细胞克隆技术，在生物学中的正规名词为细胞培养技术。
不论对于整个生物工程技术，还是其中之一的生物克隆技术。
细胞培养都是一个必不可少的过程，细胞培养本身就是细胞的大规模克隆。
细胞培养技术可以由一个细胞经过大量培养成为简单的单细胞或极少分化的多细胞，这是克隆技术必不可少的环节，而且细胞培养本身就是细胞的克隆。
通过细胞培养得到大量的细胞或其代谢产物。
因为生物产品都是从细胞得来，所以可以说细胞培养技术是生物技术中最核心、最基础的技术。
细胞培养泛指所有体外培养，其含义是指从动物活体体内取出组织，于模拟体内生理环境特定的体内条件下，进行孵育培养，使之生存并生长。
细胞培养工作现已广泛应用于生物学、医学、新药研发等各个领域，成为最重要的基础科学之一。
细胞培养专用试剂
细胞培养专用耗材。
细胞培养实验指导
第五章 细胞培养实验实验一 普通光学显微镜的结构和使用【实验目的】1.熟悉显微镜的结构和各部件性能。
2.掌握低倍镜、高倍镜的正确使用方法，熟悉油镜的使用方法。
【实验内容】1.显微镜成像原理（图1—1）标本（F1）置于聚光器与物镜之间，目镜、物镜、聚光器各自相当于一个凸透镜。
平行的光线自反射镜折射入聚光器，经聚光器集聚增强，照射在标本上。
标本的像经物镜放大成像于F 2处，像是倒像。
目镜将此例像进一步放大，并成像于人眼的视网膜上(F 3)（正像）。
2.显微镜的结构1）机械部分（1）镜座：显微镜的基座。
起稳定和支持整个镜身的作用。
有的显微镜在镜座内装有照明光源等构造（图1—2）。
（2）镜臂：支持镜筒和镜台。
镜筒直立式光镜在镜臂和镜柱之间有一可活图1-2 光学显微镜结构示意图1.目镜2.镜筒3.物镜转换器4.物镜5.透光孔6.聚光器7.光圈8.反光镜 9.粗调节器10.细调节器 11.镜臂 12.移片器 13.载物台 14.倾斜关节 15.镜柱 16.镜座 17.照明 图1-1显微镜成像原理动的关节叫倾斜关节，可使镜臂作适当倾斜，便于观察。
镜筒倾斜式显微镜由于镜臂和镜柱连为一体，故无此关节。
（3）镜筒：位于镜臂前方的圆筒，上端安装目镜，下端装有旋转盘。
根据镜筒的数目，光镜可分为单筒式和双筒式两类。
（4）载物台：在镜筒下方，方形或圆形．放玻片标本用。
载物台中央有一圆形通光孔，两旁备有一压片夹。
有的载物台上装有标本移动器，移动器上装有弹簧夹，用于固定标本片。
移动器的一侧有两个旋钮，转动旋钮可使玻片前后左右移动。
（5）物镜转换器：圆盘状，在镜筒下方，其上装有3—4个放大倍数不同的物镜。
旋转物镜转换器可更换物镜。
（6）聚焦调节器；为调节焦距之用。
大旋钮为粗调节器，转动粗调节钮可使镜筒(或载物台)升降，调节焦距。
旋转一周可使镜筒(或戴物台)升降10mm。
一般用于低倍镜调焦。
小旋钮为细调节器，转动细调节钮可使镜筒(或超物台)缓慢升降，每旋转一周约使镜筒(或载物台)升降0.1mm。
细胞生物学试剂
细胞生物学试剂1. 什么是细胞生物学试剂？细胞生物学试剂是指用于研究细胞生物学过程的化学试剂，包括细胞培养基、细胞培养血清、细胞凋亡试剂、细胞荧光染料、细胞分离试剂等。
这些试剂被广泛应用于细胞生物学研究、细胞工程和药物研发等领域。
2. 细胞培养基和培养血清细胞培养基是细胞生物学试剂中最为基础的试剂之一。
它是一种含有营养物质和生长因子的液体，可以提供细胞生长所需的营养和环境条件。
细胞培养基通常由一定比例的无菌水、氨基酸、糖类、维生素和盐酸组成。
同时，培养基中也会添加一些生长因子，例如表皮生长因子、成纤维细胞生长因子等。
细胞培养血清是一种从动物血液中提取的液体，其中含有大量的生长因子和营养物质，可以促进细胞的生长和增殖。
细胞培养血清通常用于细胞培养基中，以增加细胞生长的速度和数量。
3. 细胞凋亡试剂细胞凋亡是一种细胞自我死亡的过程，它在细胞生物学研究和药物研发中具有重要意义。
细胞凋亡试剂可以诱导细胞凋亡，包括一些化学试剂、生物分子和病毒等。
这些试剂可以通过不同的途径诱导细胞凋亡，例如通过激活细胞死亡受体、抑制细胞生长因子等。
4. 细胞荧光染料细胞荧光染料是一种在细胞中用于标记和检测分子和细胞结构的试剂。
这些试剂可以用于细胞成像、细胞分析和细胞检测等。
常用的细胞荧光染料包括荧光素、荧光素蛋白、荧光素类似物、荧光蛋白等。
5. 细胞分离试剂细胞分离试剂是一种用于将混合细胞分离成不同组分的试剂。
这些试剂可以根据细胞的大小、密度、表面性质等特征，将细胞分离出来。
常用的细胞分离试剂包括离心管、梯度离心、磁性珠和流式细胞术等。
总之，细胞生物学试剂在细胞生物学研究和应用中扮演着重要的角色。
它们可以用于细胞培养、细胞标记、细胞分离和细胞凋亡等研究领域，帮助人们更好地理解细胞的结构和功能。
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器材与试剂干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器等具体步骤1. 水：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。
需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.2. PBS (也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。
用HCl或NaOH调PH到7.4。
移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。
注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
3. 胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。
不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。
胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。
使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。
因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。
终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。
搅拌混匀，置于4℃内过夜。
用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。
然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
4. 0.05％胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液称取胰蛋白酶粉末（1：250）0.05g，EDTA 0.02g，加入PBSA 100ml，0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装，于－20℃保存。
5. 青、链霉素溶液：所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。
具体操作均在超净台内完成。
青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。
链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。
分装于－20℃保存。
使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。
6. RPMI1640：溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。
然后用二氧化碳或碳酸氢钠调PH到7.2左右。
最后定容至1000ml，摇匀。
安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。
然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。
抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。
通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。
分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。
使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效）。
7. 血清的灭活：细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭活30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。
8. HEPES溶液：HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。
对细胞无毒性作用。
它是一种氢离子缓冲剂，能较长时间控制恒定的pH 范围。
使用终浓度为10-50mmol/L，一般培养液内含20mmol/LHEPES即可达到缓冲能力。
1mol/L HEPE缓冲液配制方法如下：准确称取HEPTS 238.3g，加入新鲜三蒸水定容至1L。
0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装后4℃保存。
注意：因为现在市售HEPES为约10g包装的小瓶，所以可根据实际情况灵活配制，但是要保证培养液内HEPES的终浓度仍然为20m mol/L 。
如：称取4.766克HEPES溶于20ml三蒸水中，过滤除菌后可完全（20ml）加入1L培养液中，或者每100ml培养液中加入2ml即可。
9. 谷氨酰胺：合成培养基中都含有较大量的谷氨酰胺，其作用非常重要，细胞需要谷氨酰胺合成核酸和蛋白质，谷氨酰胺缺乏要导致细胞生长不良甚至死亡。
在配制各种培养液中都应该补加一定量的谷氨酰胺。
由于谷氨酰胺在溶液中很不稳定，4℃下放置1周可分解50％，故应单独配制，置于-20℃冰箱中保存，用前加入培养液。
加有谷氨酰胺的培养液在4℃冰箱中储存2周以上时，应重新加入原来的谷氨酰胺。
一般培养液中谷氨酰胺的含量为1～4mmol/L。
可以配制200mmol/L谷氨酰胺液贮存，用时加入培养液。
配制方法为，谷氨酰胺2.922g溶于三蒸水加至100ml即配成200mmol/L的溶液，充分搅拌溶解后，过滤除菌，分装小瓶，-20℃保存，使用时可向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液。
10. 肝素溶液的配制：含有肝素的培养液可以使内皮细胞纯度提高，肝素加入全培养液中最终浓度为50ug/ml。
因为现在市售的多为肝素钠，包装为约为0.56克/瓶，配制时，可将其溶于100ml三蒸水中，定容，过夜，然后过滤除菌，分装小瓶，保存温度为??℃。
使用时，向100ml培养液中加入1ml（精确可加入0.9ml）即可。
11. Ⅰ型胶原酶：0.1％Ⅰ型胶原酶溶液同胰蛋白酶一样配制和消毒灭菌。
注意：因为Ⅰ型胶原酶分子颗粒比胰酶大，不容易过滤，因此可以用蔡式滤器过滤除菌。
分装入10ml小瓶-20℃保存。
12. 明胶溶液：因为明胶难于过滤，所以配制0.1％明胶溶液必须用无菌的PBS配制。
所以制备过程中必须要注意无菌操作。
首要的问题是如何无菌准确称量0.1克（配成100ml溶液）—即解决无菌分装药品的问题。
其次要注意即使是01.的溶液，明胶也难溶，因此要充分摇匀，过夜放置，然后无菌操作分装入50ml 小瓶中，4℃保存。
13. Hanks液：称取KH2PO4 0.06g，Nacl 8.0g，NaHCO3 0.35g，KCl 0.4g，葡萄糖 1.0g，Na2HPO4.H2O 0.06g，加H2O至1000ml注：Hanks液可以高压灭菌。
分装于4℃下保存。
14. D-hanks液：1液：NaCL:8.00g/L，KCL : 0.04g/L，Na2HPO4.2H2O:0.06g/L，KH2PO4:0.06g/L，配500毫升；2液：NaHCO3：0.35g/L，配100毫升；3液：酚红：0.02g，用数滴NaHCO3溶解酚红将2，3液移入1液中。
定容到1000毫升PH值是7.4左右。
分装于4℃下保存。
15. Giemsa染液：称Giemsa粉末0.5克，加几滴甘油研磨，再加入甘油（使加入的甘油总量为33ml）。
56℃中保温90~120分钟。
加入33ml甲醇，置棕色瓶中保存，此为Giemsa原液。
使用时按要求用PBS稀释。
一般稀释10倍。
器材与试剂干粉型培养基、胰蛋白酶，青霉素、链霉素. 纯净水系统、电子天平、PH计、磁力搅拌器等具体步骤1. 水：细胞培养用水必须非常纯净，不含有离子和其他的杂质。
需要用新鲜的双蒸水、三蒸水或纯净水.2. PBS (也可用于其它BSS，如：Hanks，D-Hanks液的配制)：主要用于免疫组化染色时组织或细胞的漂洗溶解定容：将药品（NaCl 8.0g，KCl 0.2g，Na2HPO4·H2O 1.56g，KH2PO4 0. 2g ）倒入盛有双蒸水的烧杯中，玻璃棒搅动，充分溶解，然后把溶液倒入容量瓶中准确定容至1000ml，摇匀即成新配制的PBS溶液。
用HCl或NaOH调PH到7.4。
移入溶液瓶内待消毒：将PBS倒入溶液瓶（大的吊针瓶）内，盖上胶帽，并插上针头放入高压锅内8磅消毒20分钟。
注意高压消毒后要用灭菌蒸馏水补充蒸发掉的水份。
3. 胰蛋白酶溶液：胰蛋白酶的作用是使细胞间的蛋白质水解从而使细胞离散。
不同的组织或者细胞对胰酶的作用反应不一样。
胰酶分散细胞的活性还与其浓度、温度和作用时间有关，在pH为8.0、温度为37℃时，胰酶溶液的作用能力最强。
使用胰酶时，应把握好浓度、温度和时间，以免消化过度造成细胞损伤。
因Ca2+、Mg2+和血清、蛋白质克降低胰酶的活性，所以配制胰酶溶液时应选用不含Ca2+、Mg2+的BSS，如：D-Hanks液。
终止消化时，可用含有血清培养液或者胰酶抑制剂终止胰酶对细胞的作用。
称取胰蛋白酶：按胰蛋白酶液浓度为0.25％，用电子天平准确称取粉剂溶入小烧杯中的双蒸水（若用双蒸水需要调PH到7.2左右）或PBS（D-hanks）液中。
搅拌混匀，置于4℃内过夜。
用注射滤器抽滤消毒：配好的胰酶溶液要在超净台内用注射滤器（0.22微米微孔滤膜）抽滤除菌。
然后分装成小瓶于-20℃保存以备使用。
4. 0.05％胰蛋白酶－0.02%EDTA溶液称取胰蛋白酶粉末（1：250）0.05g，EDTA 0.02g，加入PBSA 100ml，0.22um微孔滤膜过滤除菌，分装，于－20℃保存。
5. 青、链霉素溶液：所用纯净水（双蒸水）需要15磅高压20分钟灭菌。
具体操作均在超净台内完成。
青霉素是80万单位/瓶，用注射器加4ml灭菌双蒸水。
链霉素是100万单位/瓶，加5ml灭菌双蒸水，即每毫升各为20万单位。
分装于－20℃保存。
使用时溶入培养液中，使青链霉素的浓度最终为100单位/ml。
6. RPMI1640：溶解、调PH值、定容：先将培养基粉剂加入培养液体积2/3的双蒸水中,并用双蒸水冲洗包装袋2-3次(冲洗液一并加入培养基中),充分搅拌至粉剂全部溶解,并按照包装说明添加一定的药品.然后用注射器向培养基中加入配制好的青链霉素液各0.5ml, 使青链霉素的浓度最终各为100单位/ml。
然后用二氧化碳或碳酸氢钠调PH到7.2左右。
最后定容至1000ml，摇匀。
安装蔡式滤器：安装时先装好支架，按规定放好滤膜，用螺丝将不锈钢滤器和支架连接好。
然后卸下支架腿分别用布包好待消毒。
抽滤：配制好的培养液通常用滤器过滤除菌。
通常用蔡式滤器在超净工作台内过滤。
分装：将过滤好的培养液分装入小瓶内置于4℃冰箱内待用。
使用前要向100ml培养液中加入1ml谷氨酰胺溶液（4℃时两周有效）。
7. 血清的灭活：细胞培养常用的是小牛血清，新买来的血清要在56℃水浴中灭活30分钟后，再经过抽滤方可加入培养基中使用。
8. HEPES溶液：HEPES的化学全称位羟乙基呱嗪乙硫磺酸（N’-a-hydroxythylpiperazine-N’- ethanesulfanic acid ）。