MTT实验操作流程
MTT实验操作步骤
实验操作规程MTT实验操作步骤（一）MTT溶液的配置：市面上MTT的规格一般为100mg、250mg和1g的包装。
通常MTT配成的终浓度为5mg/ml，采用PBS或生理盐水做溶剂。
对于100mg的小包装，MTT放置在小管中，直接向管中加入0.5-1.0ml PBS，反复吹打若干次后将其转移至50ml离心管中。
重复2-3次上述操作，直至小管中的没有MTT残留，之后向50ml离心管中加入PBS直至离心管内的终体积为20ml。
将MTT溶液完全混匀后，用水相的0.22μm滤膜过滤，分装避光保存于-20℃。
分装的体积根据实验需求进行操作，如以每孔需要加入10μl计算，一般96孔板约需要1ml，因此分装时可每管分装1ml，如此可避免MTT溶液的反复冻融。
（二）化合物配制及稀释：一般化合物使用DMSO溶解配制成浓度为10mM的母液储存于-20℃。
稀释时从-20℃取出所需化合物常温融化，用1640（DMEM）基础培养基稀释化合物浓度至200μM(例如，取4μL浓度为10mM的母液溶于盛有196μL的1640基础培养基的1.5mL的EP管中，使其终浓度为200μM)。
铺板：96孔板的外周孔(绿色所示)由于存在边缘效应一般不进行实验操作，因此作为Blank 组，Blank组每孔加入120μL的1640（DMEM）基础培养基；剩余的中间60孔以实验具体要求分为control组(黄色所示)、阳性对照组(粉色所示)和实验组(蓝色所示)，control组中每孔加入50μL的1640（DMEM）基础培养基，阳性对照组每孔加入50μL的浓度为200μM的阳性药物，实验组每孔加入50μL的浓度为200μM的实验药物，每种化合物及阳性药物均做3个复孔，加完之后将96孔板放置在37℃含5% CO2的培养箱中进行预温。
（三）细胞处理：取对数生长期且已覆盖培养瓶底部面积80~90%的细胞，倒掉培养基，每瓶加入37℃预热的PBS清洗1次，倒掉PBS，加入1ml胰酶，放置37℃含5%CO2的培养箱中消化3min后取出培养瓶，向培养瓶中加入2ml预热的1640（DMEM）完全培养基终止消化反应，并用吸管反复吹打细胞混匀，将其转移至15ml离心管中使用1500rpm离心3min。
MTT实验流程
基于MTT的细胞毒性试验细胞存活率=[(As-Ab) / (Ac-Ab)] × 100%抑制率=[(Ac-As) / (Ac-Ab)] × 100%As: 实验孔吸光度(含细胞、培养基、MTT溶液和药物溶液) ；Ac: 对照孔吸光度(含细胞、培养基、MTT溶液，不含药物) ；Ab: 空白孔吸光度(含培养基、MTT溶液，不含细胞、药物) 。
接种细胞：1.用胰蛋白酶消化细胞，将细胞收集到含血清的培养基中。
2.离心细胞悬液（1000rpm 5min），收集沉淀，用培养基重悬，计数。
3.将细胞稀至2.5 x 10^3-5 x 10^3个/ml，这依赖于细胞的生长速度。
4.将细胞移到9ml培养皿中，用排枪在96孔板中间的10列各孔中加入200μl细胞悬液（80孔/板），从第二列开始到第十一列位置，每孔加入0.5 x 10^3-10 x 10^3个cell。
5.将200μl培养基加第1列与第12列的8个孔中。
第1列用读板仪的空白对照，第12列有助于维持第11列的湿度，并将“边缘效应”(edgeeflect)减至最小。
6.将培养板放至塑料饭盒中，于37℃湿润环境中温育1~3d，等细胞进入指数生长期时可加人药物（以上可以增加初始细胞浓度，减小培养时间）7.对于非黏附细胞，用新鲜培养基制备细胞悬液将细胞稀释至每毫升5x10^3~100x10^3个/ml，仅取100细胞悬液接种于圆底96孔板，之后立即加入药物。
添加药物8.用培养基将细胞毒性药物5被系列稀释，共制备8个浓度。
选择浓度时应以最高浓度下多数细胞被杀死，而最低浓度时不会杀死细胞为标准。
只要对药物的毒性有所了解，便可采用较小的浓度范围。
一般情况下，每种药物使用3块培养板，这样一次试验中可以有三个平行测定结果。
9.对于贴壁生长的细胞，去除第2~11列各孔中的培养基，这可以通过将皮下注射器针连在吸引管上完成。
10.在第2列和第11列的8个孔中加入200μl新鲜配制的培养基，这些细胞作为对照。
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项四、实验所需材料1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。
市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g1.1 对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。
具休做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。
可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。
将MTT 完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。
按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。
1.2 对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。
注意事项：l 在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
l 配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感l MTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内（个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。
l MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.2．MTT甲瓒溶解液2.1 二甲基亚砜DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。
2.2 三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液（文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT方法，中国医药工业杂志，1993，24（10）：455-457），该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项四、实验所需材料1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。
市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g1.1 对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。
具休做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。
可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。
将MTT 完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。
按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。
1.2 对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。
注意事项：l 在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
l 配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感l MTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内（个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。
l MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.2．MTT甲瓒溶解液2.1 二甲基亚砜DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。
2.2 三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液（文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT方法，中国医药工业杂志，1993，24（10）：455-457），该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。
MTT实验法
MTT实验原理；步骤；注意事项；一、原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法：通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4ºC避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
我一般都把MTT粉分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加，没必要一下子配那么多,尤其当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用了。
MTT具体步骤
MTT具体步骤一般，以传代2~3次的细胞铺板为好。
1刚复苏的细胞在T25的培养瓶中培养，满瓶后，全部转至T75培养瓶中，T75培养瓶中传代1~2次；2T75瓶中细胞长至70~80%时，即可准备铺板，吸掉培养基，加入PBS约10ml 润洗后吸走PBS, 再加入胰酶约5ml 左右，消化，待细胞变圆后，轻轻敲打，若细胞成群掉落，即消化完全，及时加入全培约10ml 终止消化，转移至50ml 离心管中，800rpm，离心5min ；3离心管中，将离心好的上清去掉，先加入5ml 全培悬浮细胞，用1ml 的枪吹打均匀，后加入10 ml 全培，用移液管吹匀细胞液；4细胞计数，移取9 μl细胞液于细胞计数板中，四小格分别计数后，求和再除以4，再乘于104，得出离心管中细胞的浓度C个/ml ，根据公式C*X=5*104*10ml，（按目的浓度5*104计算）计算得出X. 即从离心管中取出的体积，转移至另一离心管中，后加培养基至10ml（终体积）；5细胞铺板，边缘孔用PBS封闭，200μl/well，中间孔加入100ul 细胞液，由前知道新配置的细胞液浓度5*104，所以得出每孔是5000个细胞，即可细胞铺板，要注意移液枪的6细胞24h过夜，配置药物（以十倍稀释为例），例：Doxocubicin 母液浓度10 mM ，配制成10-5 μM、10-4μM、10-3μM、10-2μM、10-1μM、1μM、10μM ，取准备8个离心管，从左到右，分别是：control 组，10-5 组、10-4组、10-3组、10-2组、10-1组、1组、10组，分别先加入培养基：10ml，1.8ml，1.8ml，1.8ml，1.8ml，1.8ml，1.8ml，2ml，加2μl到2ml中，吹打均匀，转移200μl到前面的管中，同样操作，使最后一个1.8ml的体积到2ml就好了；7准备加药，200μl/well，注意有些药物是在避光的条件下进行配制与加板的，加药作用48h，37℃，5%CO2培养箱中放置；8加药48h后加MTT, MTT母液是5mg/ml, 用相应的培养基稀释成0.5 mg/ml，然后吸掉96孔板中的药物培养基（注意不要吸走细胞），加入0.5 mg/ml的MTT 100μl/well，37℃，5%CO2培养箱中放置4 h；9MTT加入后4h，吸掉MTT上清，加入DMSO 150μl/well ，稍微振荡，酶标仪中检测OD570 , 根据公式Inhibition（%）=（1- X/control ）*100 计算出抑制率，再用相应软件计算出IC50值，根据需要用Prime 作图软件做出相应图表。
MTT法检测细胞活性的操作方法
MTT法检测细胞活性的操作方法MTT（3-(4,5-二甲基-2-噻唑唑-2-基)-2,5-二苯基-2H-四唑）法是一种常用的细胞活性检测方法。
该方法基于MTT试剂的还原能力，通过测量细胞培养物中形成的紫色产物的光密度来评估细胞的活性及增殖水平。
以下是MTT法检测细胞活性的操作方法的详细步骤：1.实验前准备：1.1培养细胞：选择合适的细胞株，并在培养基中培养细胞。
1.2需要的材料准备：MTT试剂、PBS缓冲液、洗涤液（如DMEM/F12或PBS），消毒剂，离心管，显微镜片，吸管，96孔板等。
2.细胞处理：2.1 细胞接种：将培养好的细胞用消过毒的25cm2培养瓶等容器进行接种，使其达到适当的细胞浓度。
2.2细胞处理：根据实验需要，将细胞处理为不同的实验组和对照组。
3.细胞培养：3.1细胞培养：将细胞放在37°C的恒温培养箱中培养，直到细胞达到合适的生长状态。
3.2细胞传代：根据实验需要，将细胞进行传代。
4.细胞处理后的时间点采集：4.1细胞溶解：在处理后的适当时间点，用洗涤液洗涤一次细胞，并用PBS缓冲液将细胞溶解。
可根据需要使用离心或其他方法进行溶解。
4.2细胞计数：将溶解的细胞计数。
5.进行MTT反应：5.1 加入MTT试剂：将适量的MTT溶液（通常为5 mg/mL）加入到每个孔中，确保覆盖整个细胞，使细胞完全接触MTT溶液。
5.2孵育细胞：将孔板放在37°C恒温培养箱中孵育，孵育时间通常为2至4小时，具体时间根据实验需要进行调整。
5.3移除上清：用吸管或离心机将MTT溶液完全移除，避免产生气泡。
5.4加入溶剂：将150至200μL的溶剂（如DMSO）加入到每个孔中，溶解最终的产物。
充分振荡孔板，使产物完全溶解。
5.5 读取吸光度：使用酶标仪或分光光度计，在570 nm波长下读取吸光度。
6.数据分析：6.1数据读取：根据测得的吸光度值，将每组细胞的平均吸光度值记录下来。
6.2数据分析：根据实验设计和目标，进行适当的数据分析，例如细胞活性的百分比变化、细胞增殖速率等。
MTT试验方法
MTT试验方法MTT法原理、步骤以及注意事项(2009-05-28 11:18:56)标签：杂谈分类：实验操作技能MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm 波长处（也有用570nm波长的，我目前用的都是570nm)测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
MTT实验方法
MTT实验
1. 接种细胞，吸出旧培养基，用适量DPBS洗去残留培养基，加入适量胰酶消化，用新鲜培养基重悬细胞并计数（1*10^5个细胞/ml,视细胞大小及生长速度而定），每个孔做3-5个重复。
根据设定的时间梯度确定板的个数
2. 接种4h（0天）之后加入含10ulMTT的培养基100ul，37摄氏度培养1-4小时
3. 吸出培养基，加入100ulDMSO震荡溶解10分钟或37度孵育30min
4. 检测OD490或者570
5. 第二天或第三天（根据自己设定的时间梯度）重复步骤2-4
注意：
接种细胞及加入MTT时可沿着96孔板的侧壁加，尽量减少气泡产生
接种细胞比较多时应注意经常颠倒混匀或吹打混匀，减少人为造成的孔间及板间误差
吸出培养基时可以用小枪头吸干净减少误差
通常35mm的小皿加培养基2ml，DPBS 1ml，胰酶200ul，消化1min（可以减少胰酶用量，延长消化时间）
60mm的小皿加4ml培基，DPBS 2ml，胰酶400ul，消化1min左右
10cm大皿加10-8ml培基，DPBS 3-4ml，胰酶600ul，消化1min左右。
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项
五、MTT法实验步骤
1: 胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。
细胞详细计数方法请参照易生物实验技术中的相关文章。
对于初学者而言，要使细胞到达5-10×104/ml往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。
该溶解液因含有SDS，在低温保存的时候易产生结晶，因此在用之前必须提前几小时拿至室温，将SDS结晶全部溶解后再使用。
五、MTT法实验步骤
1:胰酶消化对数期细胞，终止后离心收集，制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5-10×104/ml。
细胞详细计数方法请参照.biobars.中的相关文章。
对于初学者而言，要使细胞到达5-10×104/ml往往不知从何处着手，我在这里向大家提供一个简单的方法以初步确定细胞数量。
1.2 对于大包装，可按上述方法称取一局部溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。
本卷须知：
l 在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
l 配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感
l MTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周〔个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不错〕有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，防止反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。
2)每孔参加150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡
10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
另一种方法，用三联溶解液〔见上面MTT甲瓒溶解液〕
MTT实验方法步骤
一．悬浮细胞MTT实验时,由于离心弃上清会造成一定程度的细胞丢失,而且操作又麻烦.请教各位老师,不用弃上清的SDS-DMF,酸化异丙醇的方法的具体步骤和参考文献.谢谢!1．介绍一种巨噬细胞杀伤活性的MTT检测：于24孔培养板中加入1×109/L腹腔巨噬细胞(1ml/孔)，培养2h后洗去未贴壁细胞，加入不同浓度的MDP。
收集对数生长期的UMR106细胞，调整细胞浓度至1×108/L，加入各孔，效靶比（E/T）为10:1，再培养24h，充分振荡。
每孔取100μl的UMR106细胞移入96孔培养板，各孔加入5g/LMTT20μl，培养4h，再加入10％SDS100μl，测定570nm处的A值。
计算公式如下：杀伤活性（％）=(1－实验组UMR106细胞的A值/对照组UMR106细胞的A值)×100％本方法参考文献，Jiao H, Shan WM, Ohe Y, et al. A new MTT assay for testing macrophage cytotoxicity to L1210 and its drug resistant cell lines in vitro. Cancer Immunol Immunother,1992;35:412～4162．SRB是一种活性蛋白染料，能与细胞蛋白的碱性氨基酸结合而显色，在490nm~520nm 波长处其OD值与活细胞数成良好的直线关系。
SRB法已被NCI选定作为筛选抗癌药物的新方法，相对于结晶紫法或目前普遍采用的MTT法，其灵敏度好于结晶紫法，相当或优于MTT法。
除此之外SRB法还有以下优点：(1)操作时间短，细胞固定和染色仅需90分钟左右，而MTT加样后还需培养4小时。
(2)没有严格时间限制，在TCA固定后或SRB结合后的细胞均可存放，Monks指出样品保存7天，测定的OD值下降不超过2％[8]。
（3）可以测定悬浮细胞，采用16% 的三氯乙酸直接加入培养细胞中能完整酸化固定细胞，较之MTT 法或结晶紫法离心取上清的操作，不会带来细胞损失，测定结果更准确。
MTT法原理、步骤以及注意事项
MTT法原理、步骤以及注意事项MTT法原理、步骤以及注意事项MTT原理MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
MTT比色法，是一种检测细胞存活和生长的方法。
其检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶联免疫检测仪在490nm波长处（也有用570nm波长的，我目前用的都是570nm)测定其光吸收值，可间接反映活细胞数量。
在一定细胞数范围内，MTT 结晶形成的量与细胞数成正比。
该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。
它的特点是灵敏度高、经济。
缺点：由于MTT经还原所产生的甲瓒产物不溶于水，需被溶解后才能检测。
这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。
MTT 溶液的配制方法通常，此法中的MTT 浓度为5mg/ml。
因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml 的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。
在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。
需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。
在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7范围内。
MTT一般最好现用现配，过滤后4℃避光保存两周内有效，或配制成5mg/ml 保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项
MTT 实验操作步骤1.收集对数生长期细胞制成细胞悬液，细胞计数调整其浓度至5×104/ml。
（MG63/DOXand SF-86 细胞都是这个浓度）。
2.细胞悬液吹打均匀后，用排枪接种到96孔板，每孔100ul(即5000个细胞)。
3.种完细胞后6—24小时后，等其完全贴壁，将排枪调至130ul，将上清液培养基吸出（吸取过程中要动作要轻，沿孔壁至每孔的左下角，枪尖不要在底面滑动，防止损伤细胞）。
4.用完全培养基将药物按梯度配制好，每孔加入含药培养基150ul，孵育72小时（每个药物做3个复孔）。
5.72h后，将排枪调至180ul，将上清液培养基吸出，每孔加入50ul 0.5mg/ml的MTT溶液，孵箱内孵育4小时。
（MTT溶液配制方法：MTT粉末先用PBS缓冲液配制成5mg/ml，超声溶解后过0.22ul微孔滤膜除菌，4℃保存，此为MTT母液，母液四度可保存一月，配制时注意不要配太多！！实验中MTT溶液为MTT母液10倍稀释与不含血清培养基，e.g. 如果需要10mlMTT溶液，取1ml 母液加9ml 不含血清培养基）6.4h后，排枪调至80ul，将上清MTT溶液吸出（注意不要损失底面的紫色结晶），每孔加入150ul DMSO 溶液，孵箱内孵育1小时，以便结晶完全溶解。
7.读板器读板（读板前注意观察紫色结晶是否完全溶解）8.读板设置为570nm 跟650nm 两波长读数，输出OD值为570nm处读数-650nm处读数。
e.g. cell plate:DRUG 1 control control 0.1 0.2 0.4 0.8 1.6 3.2 6.4 12.8ug/ml control controlcontrol controlDRUG 2 control control control control control controlResult:0.0772 0.2476 0.2444 0.2394 0.1991 0.1784 0.1617 0.1376 0.1028 0.0966 0.0842 0.0775 0.0744 0.3108 0.2942 0.2683 0.2387 0.2239 0.1891 0.1737 0.1289 0.1063 0.0966 0.07650.076 0.3111 0.3185 0.2899 0.2472 0.2175 0.2048 0.1628 0.1367 0.1111 0.094 0.0788 0.0724 0.3104 0.319 0.2747 0.2513 0.2227 0.2144 0.1658 0.1439 0.1178 0.09380.0786 0.0785 0.3152 0.3039 0.2832 0.2611 0.2303 0.193 0.1678 0.1506 0.1082 0.0797 0.0754 0.0723 0.2883 0.314 0.2864 0.2591 0.2283 0.2023 0.1565 0.151 0.123 0.0981 0.0808 0.0741 0.2644 0.2928 0.2848 0.2717 0.2065 0.1852 0.1566 0.1441 0.1204 0.0899 0.08340.079 0.2846 0.2647 0.2743 0.2255 0.1953 0.1759 0.1644 0.1405 0.1083 0.0844 0.0832MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项一、MTT是什么MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
MTT实验方法
一、原理黄色的噻唑兰，简称MTT，可透过细胞膜进入细胞内，活细胞线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性MTT还原为难溶于水的蓝紫色的针状Formazan结晶并沉积在细胞中，结晶物能被二甲基亚砜（DMSO）溶解，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。
二、实验步骤（实用于贴壁细胞）1）收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，分于96孔板，每孔180μl，3000-10000个/孔。
2）置37℃、5%CO2温箱培养使细胞贴壁，培养6-24小时。
3）加入待筛样品20μl，继续培养44小时。
4）小心吸去上清，加入80μl新鲜RPMI 1640培养液，再加入20 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。
6）然后吸掉上清，每孔加入150 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。
在酶联免疫检测仪490 nm处测量各孔的吸光值。
7）同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
8）计算抑制率＝[(对照-空白)-(给药-空白)]/(对照-空白)X100%.有依据吗MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-(4,5)-dimethylthiahiazo(-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide, MTT噻唑蓝为基础。
MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。
还原生成的formazan结晶可在含50%的N,N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm 处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。
mtt实验操作流程
mtt实验操作流程
MTT实验操作流程如下：
1. 细胞接种：将细胞接种在含有不同浓度的药物的培养基中，并进行培养。
2. MTT添加：将MTT添加到培养基中，使其浓度为/ml。
3. 细胞处理：将培养基中的MTT和细胞共同处理，一般处理时间为2-4小时，处理后可以观察到细胞内有紫色晶体的形成。
4. 溶解晶体：将细胞处理后的培养基去掉，加入DMSO（二甲基亚砜）溶解晶体，离心收集上清液。
5. 检测吸光度：将上清液放入96孔板中，用酶标仪检测吸光度，计算细胞的存活率。
通过上述步骤，就可以完成MTT实验。
希望对您有帮助。
MTT实验步骤
MTT实验步骤详细流程最后更新：2011-1-11 阅读次数：6655 【字体：小中大】MTT常用浓度为5mg/ml。
1、药物的细胞毒性四唑盐（MTT）比色法操作步骤接种细胞（1）用胰蛋白酶消化汇合的单层细胞，将细胞收集到含血清的培养基中。
（2）离心细胞悬液，使细胞沉积下来。
用培养基重悬细胞，计数。
（3）将细胞稀释至2.5×103-50×103 个/ml，每个微滴定板可容纳20ml细胞重悬液。
（4）用加样器在平底96孔板中间十列的各孔中加入200μl细胞悬液，每孔加0.5×103-10×103 个细胞。
（5）将200μl培养基加至第1列和第12列的8个孔中。
第1列作读板议的空白对照。
（6）将培养板放至塑料饭盒中，于37℃湿润环境中温育1-3天，等细胞进入指数生长期时可加入药物。
添加药物（7）用培养基将细胞毒性药物5倍系列稀释，共制备8个浓度。
（8）对于贴壁生长的细胞，去除第2-11列各孔的培养基。
（9）在第2列和第11列的8个孔中加入200μl新鲜配制的培养基，这些细胞作为对照。
（10）在第3-10列的细胞中加入细胞毒性药物。
每个药物浓度仅需4个孔，这样A-D行可用于第一种药物，E-H行用于第二种药物。
（11）向每组4 孔中各加入200μl药物溶液。
（12）将培养板放回塑料盒中，温育至确定时间。
生长期（13）在药物作用期结束时，去除所有含有细胞的孔中的培养基，加入200μl新鲜的培养基。
（14）每日换液至2-3个PDTs[群体倍增时间]。
存活细胞数的估算（15）在生长期末，每孔中各加入200μl新鲜的培养基，在第1-11列所有孔中各加入50μl MTT。
（16）用铝箔包裹培养板，于37℃湿润环境中温育4 h。
（17）弃去孔中的培养基和MTT，在第1-11列所有孔中各加入200μl DMSO，以溶解残留的MTT-甲臜结晶。
（18）在含有DMSO的各孔中加入甘氨酸缓冲液（每孔25μl）。
MTT实验操作步骤
MTT的操作方法一、MTT是什么MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetra zoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
二、MTT法用来做什么简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。
MTT主要有两个用途1．药物（也包括其他处理方式如放射线照射）对体外培养的细胞毒性的测定；2．细胞增殖及细胞活性测定。
三、为何MTT可以用来做上述工作检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
根据测得的吸光度值（OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
四、实验所需材料1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。
市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g1.1对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。
具休做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000u l PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。
可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。
将MTT完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。
按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项
MTT配制、原理、操作步骤、结果分析、注意事项四、实验所需材料1．MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。
市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g1.1 对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。
具休做法：预先在50ml离心管（没有的话，可用培养瓶替代）加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。
可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。
将MTT 完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。
按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。
1.2 对于大包装，可按上述方法称取一部分溶解，也有人将粉剂分装在EP管里，用的时候现配，直接往培养板中加。
注意事项：l 在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。
l 配成的MTT需要无菌，MTT对菌很敏感l MTT一般最好现用现配，过滤后4度避光保存两周内（个人曾做过4度避光保存4周的MTT溶液，效果仍然不错）有效，或配制成5mg/ml保存在-20度长期保存，避免反复冻融，最好小剂量分装，用避光袋或是黑纸、锡箔纸包住避光以免分解。
当MTT变为灰绿色时就绝对不能再用。
l MTT有致癌性，用的时候小心,有条件最好带那种透明的簿膜手套.2．MTT甲瓒溶解液2.1 二甲基亚砜DMSO，可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。
2.2 三联溶解液：SDS10g，异丁醇5ml，10M HCl 0.1ml 用双蒸水溶解配成100ml溶液（文献方法：周建军等，评价抗癌物质活性的改良MTT方法，中国医药工业杂志，1993，24（10）：455-457），该溶解液不需去除原培养基，但溶解较慢。
MTT实验最全指南
MTT实验最全指南一、MTT是什么MTT是一种粉末状化学试剂，全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，商品名：噻唑蓝。
是一种黄颜色的染料。
二、mtt法用来做什么简单地说：是一种检测细胞存活和生长的方法。
MTT主要有两个用途1、药物(也包括其他处理方式如放射线照射)对体外培养的细胞毒性的测定;2、细胞增殖及细胞活性测定。
三、为何MTT可以用来做上述工作检测原理为活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒(Formazan)并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜(DMSO)能溶解细胞中的甲瓒，用酶标仪在490nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
根据测得的吸光度值(OD值)，来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强(如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小)。
四、实验所需材料1、MTT 溶液的配制通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。
市面上一般MTT的包装为100mg,250mg或1g1.1、对于100mg这样的小包装，厂家都是将MTT放入小管中的，个人建议不要再用天平称量分装，而应该一次性将其全配制成溶液，如100mg用20mlPBS来溶解。
具休做法：预先在50ml离心管(没有的话，可用培养瓶替代)加入20ml PBS，从中先吸取500-1000ul PBS装入含MTT的小管中，吹打若干次后将其移入50ml离心管，然后再混匀。
可以重复几次，以使小管中的MTT不残留于管内。
将MTT 完全混匀后，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，分装避光(避光袋或是黑纸、锡箔纸包住)可长期保存于-20度。
按细胞培养板每孔需加10ul计算，一般每96孔板约需1ml，所以分装时可考虑每管分装1ml。
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M T T实验操作流程
Document serial number【NL89WT-NY98YT-NC8CB-NNUUT-NUT108】
MTT实验标准操作流程
1.原理
活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒（Formazan）并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。
二甲基亚砜（DMSO）能溶解细胞中的甲瓒，用在570nm波长处测定其光吸收值，在一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比。
根据测得的吸光度值（即OD值），来判断活细胞数量，OD值越大，细胞活性越强（如果是测药物毒性，则表示药物毒性越小）。
2.试剂及耗材
CO2细胞培养箱、生物安全柜、倒置显微镜、低速离心机、酶标仪、8道排枪、培养基
胎牛血清、MTT、 DMSO、96孔细胞培养板、胰酶、血细胞计数板
3.注意事项
MTT溶液的配制，通常MTT 配成的终浓度为5mg/ml,须用PBS或生理盐水做溶剂。
MTT一般最好现用现配，μm过滤后4℃避光保存两周内，或配制成5mg/ml保存在-20℃长期保存，避免反复冻融，小剂量分装，用避光袋或锡箔纸包住避光以免分解，当MTT变为灰绿色时不能再用。
DMSO可以直接溶解，无需配制，使用方便，溶解速度快，但对人体毒性较大，且需去除原培养液，在去除培养液的过程中，可能会把结晶去掉，导致结果不稳定。
4.实验步骤：
细胞标准曲线制作
%的胰酶消化对数期细胞，待细胞即将脱离皿底时，加少量血清终止反应，1000r/min，离心5min，吸去上清，将细胞沉淀用培养基吹打混匀，制成细胞悬液，细胞计数后调整其浓度至5-10×104/ml。
取4块96孔板，分别标记为0h、24h、48h、72h，，每组设置3个复孔，每孔加入100 μL细胞悬液，每板分别铺8组细胞，分别为3000、4000、5000、6000、7000、8000、9000、10000个/孔，边缘孔用无菌PBS填充以消除边缘效应。
5%CO2，37℃培养箱继续培养，每24 h取出一块96孔板检测：
a) 每孔加入10 μL MTT溶液（5mg/ml），继续细胞培养箱培养4-6h；
b) 小心吸去孔内培养液；
c) 每孔加入150μL DMSO，使结晶物充分溶解；
d) 加DMSO后10min内，用酶标仪检测各孔波长μl570nm的吸光值；
标准曲线制作
以时间为横坐标，吸光度值为纵坐标绘制细胞增殖标准曲线。
选择合适的细胞浓度进行实验。
MTT药物毒性实验步骤
%的胰酶消化对数期细胞，加少量血清终止反应，1000r/min，离心5min，吸去上清，将细胞沉淀用培养基吹打混匀，制成细胞悬液，细胞计数后调整其浓度至5-10×104/ml，药物毒性实验一般每孔细胞数量5000—10000个（具体数目根据预实验判断）。
此外，还应根据细胞本身特性，如生长快慢，来决定细胞数量。
比如：生长较快的细胞密度可略小。
将细胞悬液制备好后，轻轻混匀，每孔加入90μl细胞悬液, 这样待测细胞的密度为5000—10000/孔（边缘孔用无菌PBS填充）。
注意：因细胞在混匀后仍要继续沉降，因此接种的过程中要反复多次混匀，如每加5个孔就混匀一次，以确保接种的细胞密℃在各孔之间完全相同，这对于MTT的结果至关重要。
5%CO2，37℃培养箱继续培养，待细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物。
（原则上，细胞贴壁后即可加药，或两h，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，
次日上午加药。
加药时按照所需的浓度在EP管中先稀释好，每孔加入10μl已经稀释好药物，使每孔最终体积为100μl，为了避免产生误差，稀释好的药物体积应略大于所需药物的体积。
需要注意的是，以DMSO作为溶剂溶解的药物至少需要进行100倍以上稀释才能使用，因为作用于细胞DMSO的含量高于1%时，DMSO会杀死细胞从而影响判断。
）
按照药物作用时间点，每24 h取出一块96孔板检测：
a) 每孔加入10 μL MTT溶液（5mg/ml），继续细胞培养箱培养4-6h；
b) 小心吸去孔内培养液；
c) 每孔加入150μL DMSO，置上低速振荡10min，使结晶物充分溶解；
d) 加DMSO后10min内，用酶标仪检测各孔波长570nm的吸光值；
同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
MTT结果分析
IC50值可以通过Graphpad prism5进行计算
MTT增殖实验
分别收集各组对数期的细胞，调整细胞悬液浓度；
取4块96孔板，每孔加入100 μL细胞悬液，铺板使待测细胞为5×103 cell/孔（边缘孔用无菌PBS填充以消除边缘效应），每组设置3个复孔；
5%CO2，37℃培养箱继续培养，每24 h取出一块96孔板检测：
a) 每孔加入20 μL MTT溶液（5mg/ml），继续细胞培养箱培养4h；
b) 小心吸去孔内培养液；
c) 每孔加入150μL DMSO，使结晶物充分溶解；
d) 加DMSO后10min内，用酶标仪检测各孔波长570nm的吸光值。
数据处理及MTT增殖曲线绘制。