实验三细菌形态结构观察及革兰染色优秀课件
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实验三细菌的革兰氏染色(Gram stain)
肽聚糖(peptidoglycan) 肽聚糖
革兰阳性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链、 革兰阳性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链、五肽交联桥
N-乙酰葡糖胺 N-乙酰胞壁酸
溶菌酶作用点
青霉素作用点
肽聚糖(peptidoglycan) 肽聚糖
革兰阴性菌肽聚糖—聚糖骨架、 革兰阴性菌肽聚糖—聚糖骨架、四肽侧链
大肠杆菌革兰氏染色
炭疽芽胞杆菌
五、实验报告
1．结果 ． 列表比较大肠杆菌、 列表比较大肠杆菌、枯草芽孢杆菌和未知菌 的染色反应，并判断它们分别是G 的染色反应，并判断它们分别是 -或G+. 2．思考题 ． （1）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？ ）作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚？ 其染色成败的关键一步是什么？ 其染色成败的关键一步是什么？ （2）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时， ）当你对一株未知菌进行革兰氏染色时， 怎样能确证你的染色技术操作正确， 怎样能确证你的染色技术操作正确，结果 可靠？ 可靠？
2．染色
（1）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟， ）初染：加草酸铵结晶紫一滴，约一分钟， 水洗。 水洗。 （2）媒染：滴加碘液冲去残水，并覆盖约一 ）媒染：滴加碘液冲去残水， 分钟，水洗。 分钟，水洗。 （3）脱色：将载玻片上面的水甩净，并衬以 ）脱色：将载玻片上面的水甩净， 白背景， 白背景，用95％酒精滴洗至流出酒精刚刚 ％ 不出现紫色时为止， 秒钟， 不出现紫色时为止，约20～30秒钟，立即 ～ 秒钟 用水冲净酒精。 用水冲净酒精。 分钟， （4）复染：用番红液染 ～2分钟，水洗。 ）复染：用番红液染1～ 分钟 水洗。
• 革兰氏染色需用四种不同的溶液：碱性染料 革兰氏染色需用四种不同的溶液： （basic dye）初染液；媒染剂 ）初染液； ）；脱色剂 （mordant）；脱色剂（decolorising ）；脱色剂（ agent）和复染液（counterstain）。 ）和复染液（ ）。 • 碱性染料初染液 碱性染料初染液——结晶紫（crystal 结晶紫（ 结晶紫 violet） ） • 媒染剂 媒染剂——碘（iodine） 碘 ） • 脱色剂——95％的酒精（ethanol） 脱色剂 ％的酒精（ ） • 复染液 复染液——番红 番红
实验三革兰氏染色
革兰氏染色– 染色
6 镜检 干燥后，用油镜观察。蓝紫色为G+,红色为G-。 7 混合涂片染色 将大肠杆菌和金黄色葡萄球菌作混合涂片、染色、镜检进行 比较。
Procedures of Gram Staining
Gram positive or Gram negative?
实验报告
1．绘图说明经革兰氏染色后大肠肝菌和金黄色葡萄球 菌的染色结果。
细菌的等电点较低，pH值大约在2—5之间，故在中性、碱性或弱酸 性溶液中，菌体蛋白质电离后带负电荷；而碱性染料电离时染料离子带 正电。因此，带阴电的细菌常和带阳电的碱性染料进行结合。所以，在 细菌学上常用碱性染料进行染色。
2 染色方法
微生物染色方法一般分为单染色法和复染色法两种。前者用一种染 料使微生物染色，但不能鉴别微生物。复染色法是用两种或两种以上染 料，有协助鉴别微生物的作用，故亦称鉴别染色法。常用的复染色法有 革兰氏染色法和抗酸性染色法，此外还有鉴别细胞各部分结构的（如芽 胞、鞭毛、细胞核等）特殊染色法。
革兰氏染色– 制片
A.ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ加小滴水
B. 涂成薄层
C. 固定菌体
2 初染 滴加结晶紫（以刚好将菌膜覆盖为宜）,染色1－2 min，水洗。 3 媒染 用碘液冲去残水，并用碘液覆盖菌膜约1min，水洗。 4 脱色 用滤纸吸去玻片上的残水，将玻片倾斜，用滴管流加95％的乙 醇脱色，直至流出的乙醇无紫色时，立即水洗。脱色时间一般 液20－30 S。脱色不足与过度都会影响和改变染色的结果。 5 复染 用番红液复染约2min，水洗。
实验三 细菌的单染色与革兰氏 染色法
1 微生物染色的基本原理
微生物染色的基本原理，是借助物理因素和化学因素的作用而进 行的。物理因素如细胞及细胞物质对染料的毛细现象、渗透、吸附作 用等。化学因素则是根据细胞物质和染料的不同性质而发生的各种化 学反应。酸性物质对于碱性染料较易吸附，且吸附作用稳固；同样， 碱性物质对酸性染料较易于吸附。如酸性物质细胞核对于碱性染料就 有化学亲和力，易于吸附。
医学课件实验三 细菌的革兰氏染色及芽孢染色法
实验三 细菌的革兰氏染色及 芽孢染色法
（一）实验目的：
1、学习并掌握革兰氏染色法和芽孢染色法。
2、巩固显微镜油镜的使用技术。
（二）实验原理：
1、革兰氏染色原理： 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学 C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所 有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革 兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最 常用的鉴别染色法。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由 这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。 G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂 质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或 丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透 性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结 果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+ 菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量 少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小， 通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
（5）水洗：待玻片冷却后 ，用水轻轻地 冲洗，直至流出的水中无染色液为止。 （6）复染：用蕃红液染色2min。 （7）水洗： （8）干燥： （9）镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜 下观察芽胞和菌体的形态。。 结果：芽胞呈绿色，菌体为红色。
3、芽孢染色
（1）制备菌悬液，1-2滴 (2) 染色，2-3滴孔雀石绿，沸水1520min (3)涂片，自然干燥，火焰固定 (4)脱色（水洗）：轻轻冲洗，自然干燥 (5)复染，番红2-3min (6)水洗 (7)镜检
（7）水洗：用水洗去碘液。 （8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱 色20—25s至流出液无色，立即水洗。 （9）复染：滴加蕃红复染2min。 （10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。 （11）干燥：将染好的涂片放空气中晾干或者用 吸水纸吸干。 （12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后 用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。
（一）实验目的：
1、学习并掌握革兰氏染色法和芽孢染色法。
2、巩固显微镜油镜的使用技术。
（二）实验原理：
1、革兰氏染色原理： 革兰氏染色法是1884年由丹麦病理学 C.Gram所创立的。革兰氏染色法可将所 有的细菌区分为革兰氏阳性菌（G+）和革 兰氏阴性菌（G—）两大类，是细菌学上最 常用的鉴别染色法。
该染色法所以能将细菌分为G+菌和G—菌，是由 这两类菌的细胞壁结构和成分的不同所决定的。 G—菌的细胞壁中含有较多易被乙醇溶解的类脂 质，而且肽聚糖层较薄、交联度低，故用乙醇或 丙酮脱色时溶解了类脂质，增加了细胞壁的通透 性，使初染的结晶紫和碘的复合物易于渗出，结 果细菌就被脱色，再经蕃红复染后就成红色。G+ 菌细胞壁中肽聚糖层厚且交联度高，类脂质含量 少，经脱色剂处理后反而使肽聚糖层的孔径缩小， 通透性降低，因此细菌仍保留初染时的颜色。
（5）水洗：待玻片冷却后 ，用水轻轻地 冲洗，直至流出的水中无染色液为止。 （6）复染：用蕃红液染色2min。 （7）水洗： （8）干燥： （9）镜检：先低倍，再高倍，最后在油镜 下观察芽胞和菌体的形态。。 结果：芽胞呈绿色，菌体为红色。
3、芽孢染色
（1）制备菌悬液，1-2滴 (2) 染色，2-3滴孔雀石绿，沸水1520min (3)涂片，自然干燥，火焰固定 (4)脱色（水洗）：轻轻冲洗，自然干燥 (5)复染，番红2-3min (6)水洗 (7)镜检
（7）水洗：用水洗去碘液。 （8）脱色：将玻片倾斜，连续滴加95%乙醇脱 色20—25s至流出液无色，立即水洗。 （9）复染：滴加蕃红复染2min。 （10）水洗：用水洗去涂片上的蕃红染色液。 （11）干燥：将染好的涂片放空气中晾干或者用 吸水纸吸干。 （12）镜检：镜检时先用低倍，再用高倍，最后 用油镜观察，并判断菌体的革兰氏染色反应性。
革兰氏染色 ppt课件
许多g细菌对高等生物有致病性是由lps的成分决定的它的毒性组分常称为内毒素细菌外毒素与内毒素的区别外毒素exotoxin内毒素endotoxin产生菌多数革兰氏阳性菌少数革兰氏阴性菌多数革兰氏阴性菌少数革兰氏阳性如苏云金芽孢杆菌存在部位多数活菌分泌出少数菌裂解后释出细胞壁组分菌裂解后释出化学成份蛋白质脂多糖稳定性60半小时被破坏16024小时被破坏毒性作用强较弱毒性反应对组织细胞有选择性毒害效应引起特殊临床表现各菌的毒性效应相似引起发热白细胞增多微循环障碍休克等免疫原性强刺激宿主产生抗毒素弱甲醛液处理脱毒成类毒素不形成类毒素27实验原理
ppt课件 11
2.5固定的目的 ① 杀死微生物，固定其细胞结 构； ② 保证菌体能牢固地粘附在载 玻片上，以免水洗时被水冲掉； ③ 改变菌体对染料的通透性， 一般死细胞原生质容易着色。
ppt课件
12
2.6实验现象：
染色后菌体呈蓝紫色的，称为“革兰阳 性菌”；菌体是伊红色，称“革兰阴性 菌”。无论阳性菌还是阴性菌，都有杆 菌和球菌。葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿 假单胞菌是临床最为常见的病原菌。葡 萄球菌属于革兰阳性菌，大肠杆菌属于 革兰阴性菌。除大肠杆菌以外，临床较 常见的肠杆菌科细菌还有变形杆菌属， 沙门菌属、克霉白菌属；铜绿假单胞菌 是临床常见的较耐药革兰阴性杆菌。
ppt课件 16
细菌结构模式图
ppt课件
17
2.7实验原理：
① G+细菌的细胞壁
G+细菌细胞壁具有较厚（20-80nm）而致密的肽聚糖层， 多达20层，占细胞壁成分的60%～90%，它同细胞膜的外层 紧密相连 ；有的G+细菌细胞壁中含有磷壁酸。细胞生长中 有自溶素（酶类）起作用，磷壁酸对自溶素有调节功能， 阻止胞壁过度降解和壁溶。如果细胞壁的肽聚糖层被消溶， G+细胞成为原生质体（protoplasts），细胞壁不复存在， 而只存留细胞膜。除链球菌外，大多数G+细菌细胞壁中含 极少蛋白质。
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2.5固定的目的 ① 杀死微生物，固定其细胞结 构； ② 保证菌体能牢固地粘附在载 玻片上，以免水洗时被水冲掉； ③ 改变菌体对染料的通透性， 一般死细胞原生质容易着色。
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2.6实验现象：
染色后菌体呈蓝紫色的，称为“革兰阳 性菌”；菌体是伊红色，称“革兰阴性 菌”。无论阳性菌还是阴性菌，都有杆 菌和球菌。葡萄球菌、大肠杆菌、铜绿 假单胞菌是临床最为常见的病原菌。葡 萄球菌属于革兰阳性菌，大肠杆菌属于 革兰阴性菌。除大肠杆菌以外，临床较 常见的肠杆菌科细菌还有变形杆菌属， 沙门菌属、克霉白菌属；铜绿假单胞菌 是临床常见的较耐药革兰阴性杆菌。
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细菌结构模式图
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2.7实验原理：
① G+细菌的细胞壁
G+细菌细胞壁具有较厚（20-80nm）而致密的肽聚糖层， 多达20层，占细胞壁成分的60%～90%，它同细胞膜的外层 紧密相连 ；有的G+细菌细胞壁中含有磷壁酸。细胞生长中 有自溶素（酶类）起作用，磷壁酸对自溶素有调节功能， 阻止胞壁过度降解和壁溶。如果细胞壁的肽聚糖层被消溶， G+细胞成为原生质体（protoplasts），细胞壁不复存在， 而只存留细胞膜。除链球菌外，大多数G+细菌细胞壁中含 极少蛋白质。
实验三 细菌形态观察和革兰氏染色技术
⑥ 复染：
已经脱色处理的细胞或其结构常以复染液作复染 以便于观察。 复染液与初染液的颜色不同而成鲜明对比，所以 复染也称为对比染色。 复染液不宜太强，以免掩盖初染的颜色而失去对 比作用。
用于革兰氏染色的初染液一般是结晶紫。 媒染剂的作用是增加染料和细胞之间的亲和力或附着力，
即以某种方式帮助染料固定在细胞上，使不易脱落。
不同类型的细胞脱色反应不同，有的能被脱色，有的则不
能，脱色剂常用95％的酒精。
复染液也是一种碱性染料，其颜色不同于初染液，复染 的目的是使被脱色的细胞染上不同于初染液的颜色，而未 被脱色的细胞仍然保持初染的颜色，常用的复染液是番红。
三、结果:
② 固定：
染色前必须先行固定。其目的在于凝固细胞质和 其它细胞结构成分而杀死细菌；使菌体粘附于玻 片上以及改变细菌对染料的通透性（因活菌通常 不易使染料透入细胞内）。
固定的方法一般采用火焰加热法，在特殊目的时 也可用冷冻干燥法或化学法如醇、酸、氯化高汞 、重金属盐或氧化剂等进行固定。
③ 媒染：
① 涂片制备：
随标本的种类而略有不同。
• 若为液体培养液，亦可直接涂于载玻片上；
• 若为固体培养基上的细菌，则先取一接种环生理盐水于载玻片中 央，然后从培养基上取菌少许，在盐水中研磨均匀，使呈轻度乳 浊，以接种环扩成1cm2或2份硬币大小的涂面。
在室温下自然干燥或放在火焰上方的热空气中慢 慢烘干。但切忌紧靠火焰烤干。
⑤ 脱色：
脱色：是使被染物脱去已染上的颜色。脱色的目 的是观察细菌与染料结合的稳定程度，故可作为 鉴别染色之用。
凡具有脱色作用的化学试剂称脱色剂。脱色剂或 呈溶媒作用，如醇类、丙酮等；或能影响蛋白质 的电离程度，改变其电荷性质或数量，因而影响 细菌与染料的结合程度，如酸类能减少细菌的负 电荷，故可作碱性染料的脱色剂。
革兰染色法及细菌形态和结构课件
革兰染色法的优缺点
优点
01
02
03
快速
革兰染色法是一种快速且 有效的细菌分类方法，可 以在短时间内对大量样本 进行处理。
准确
革兰染色法对于区分革兰 氏阳性菌和革兰氏阴性菌 具有很高的准确性，有助 于疾病的诊断和治疗。
简便
该方法操作简便，所需的 设备和试剂相对简单，适 合在基层医疗单位和实验 室中使用。
染色技术的普及与推广
随着技术的进步和研究的深入，革兰染色技术将更加普及和推广。不仅在医疗机构中广泛应用，还将逐渐应用于公共 卫生、食品安全等领域。这将有助于提高细菌性疾病的防控和应对能力。
染色技术的国际化标准与认证 为了确保染色结果的准确性和可比性，未来将制定更加完善的国际标准和质量认证体系。这将促进染色 技术的规范化发展，提高其在全球范围内的应用价值。
自动化与智能化染色技术
随着科技的进步，染色技术正逐步实现自动化和智能化。通过引入机器人和人工智能技术， 染色过程将更加精准、快速和高效，大大提高了染色质量和效率。
染色试剂的优化与改进
为了提高染色效果和准确性，科研人员正不断优化和改进染色试剂的配方。通过改进染色 剂的成分和性能，可以更准确地鉴别细菌，有助于疾病的快速诊断和治疗。
THANKS
感谢您的观看Βιβλιοθήκη 缺点主观性革兰染色法的结果很大程 度上依赖于操作者的经验 和技能，存在一定的主观性。
局限性
革兰染色法无法用于所有 细菌的分类，对于某些特 殊细菌可能需要其他方法。
对某些细菌不适用
对于某些经过特殊处理的 细菌或某些特殊类型的细 菌，革兰染色法的结果可 能不准确。
革兰染色法的发展趋势和未来
05
展望
发展趋势
革兰染色法及细菌形 态和结构课件
实验三细菌的简单染色和革兰氏染色课件
➢ 碱性染料电离时，其分子染色部分带正电荷，能和带负 电荷的物质结合。由于细菌生长于中性环境中一般带负 电荷，所以通常采用碱性染料使其着色。
➢ 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电 荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料 着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊 红美蓝、伊红天青等。
• 革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，
革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过 短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间 的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以 严格规定。
• 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去
玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。
一、实验目的及要求
• 学习微生物涂片、染色的基本技术， 掌握 细菌的简单染色法。
• 学习并掌握革兰氏染色法，了解革兰氏染 色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要 性。
• 巩固油镜的使用和无菌操作技术。
二、实验原理
➢ 简单染色法是利用单一染料使细菌着色以显示其形态的 染色方法。常用于染色的染料主要有碱性染料、酸性染 料和中性染料三大类。
2. 染色剂：草酸铵结晶紫染液或齐氏石炭酸复红染 液，革兰氏染色液。
3. 其他：显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶 （内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，废液缸等。
四、实验步骤
1、简单染色： （1）涂片：注意取菌不要太多； （2）干燥：室温自然干燥； （3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上， 通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）； （4）染色：涂片加草酸铵结晶紫染液或齐氏石炭酸复 红染液 1min； （5）水洗：自来水冲洗，直至流下的无色； （6）干燥：自然晾干或用电吹风吹干； （7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的 视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏 油，油镜观察细菌的形态。
➢ 当细菌分解糖类产酸使培养基pH下降时，细菌所带正电 荷增加，因此易被伊红、酸性复红或刚果红等酸性染料 着色。中性染料是前两者的结合物又称复合染料，如伊 红美蓝、伊红天青等。
• 革兰氏染色成败的关键是酒精脱色。如脱色过度，
革兰氏阳性菌也可被脱色而染成阴性菌；如脱色时间过 短，革兰氏阴性菌也会被染成革兰氏阳性菌。脱色时间 的长短受涂片厚薄及乙醇用量多少等因素的影响，难以 严格规定。
• 染色过程中勿使染色液干涸。用水冲洗后，应吸去
玻片上的残水，以免染色液被稀释而影响染色效果。
一、实验目的及要求
• 学习微生物涂片、染色的基本技术， 掌握 细菌的简单染色法。
• 学习并掌握革兰氏染色法，了解革兰氏染 色法的原理及其在细菌分类鉴定中的重要 性。
• 巩固油镜的使用和无菌操作技术。
二、实验原理
➢ 简单染色法是利用单一染料使细菌着色以显示其形态的 染色方法。常用于染色的染料主要有碱性染料、酸性染 料和中性染料三大类。
2. 染色剂：草酸铵结晶紫染液或齐氏石炭酸复红染 液，革兰氏染色液。
3. 其他：显微镜，酒精灯，载玻片，接种环，双层瓶 （内装香柏油和二甲苯），擦镜纸，废液缸等。
四、实验步骤
1、简单染色： （1）涂片：注意取菌不要太多； （2）干燥：室温自然干燥； （3）固定：手执玻片一端，让菌膜朝上， 通过火焰2-3次固定（以不烫手为宜）； （4）染色：涂片加草酸铵结晶紫染液或齐氏石炭酸复 红染液 1min； （5）水洗：自来水冲洗，直至流下的无色； （6）干燥：自然晾干或用电吹风吹干； （7）镜检：先低倍观察，再高倍观察，并找出适当的 视野后，将高倍镜转出，在涂片上加香柏 油，油镜观察细菌的形态。
最新-微生物学实验3革兰氏染色与细菌个体形态的观察-精选PPT文档
G+: Staphylococcoli
用铅笔做好标记
2、染色(p82-83)
初染
滴加结晶紫染液初染1 min→水洗
冲残水
媒染
滴加卢戈氏碘液媒染1 min → 水洗
吸残水
脱色
滴加95％乙醇脱色，摇动玻片至紫色不 再为乙醇脱退为止(约30 s) →水洗
用接种环接挑取被检细菌于3% KOH溶液中混匀 30-60 s后观察菌液是否变粘稠，并拉出丝来
根据实验结果鉴别G+和G-
四、实验报告
结 果: 1、 p84 1.（1）、（2）：描述(绘) 所观察细菌(G+和G-)的个体形态； 2、描述KOH试验的结果； 思考题 1、p84 2.（3）题 2、KOH试验现象直观，可否取代现 有染色方法，为什么？
一、革兰氏染色法原理
1. 细菌的细胞壁组成和结构差异
G+：壁厚，肽聚糖含量高，类脂质含量低 G-：壁薄，肽聚糖含量低，类脂质含量高
革兰氏阳性细菌细胞壁
革兰氏阴性细菌细胞壁
2. 染色
初染
（结晶紫）
媒染 脱色
（碘液）
复染
（番红）
（乙醇）
G+：蓝紫色 G-：红色
革兰氏染色
甲菌
紫色 （ G＋ ）
初染 结晶紫
操作考核
• • • • • • • 端正坐姿，臂悬空 托住瓶底，慢拔塞 皿底在上，翻过来 悬空倒下，轻晃动 平推平板，勿再碰 冷却凝固，倒放置 写上标记，在皿底
下次实验
实验六. 细菌的鞭毛染色与运动性观察
滴加番红复染1~2 min →水洗
复染
用滤纸吸干，待镜检。
3、显微镜观察（油镜）。
三、革兰氏染色注意问题及对策 1.菌龄：应选择活跃生长期的培养物作革兰氏染色。 培养时间过长，或死亡及部分自溶，改变了细菌细 胞壁的通透性，造成阳性菌的假阴性反应。
实验三 细菌形态观察和革兰氏染色技术51页PPT
41、学问是异常珍贵的东西，从任何源泉吸 收都不可耻。——阿卜·日·法拉兹
42、只有在人群中间，才能认识自 己。——德国
43、重复别人所说的话，只需要教育； 而要挑战别人所说的话，则需要头脑。—— 玛丽·佩蒂博恩·普尔
44、卓越的人一大优点是：在不利与艰 难的遭遇里百折不饶。——贝多芬
45、自己的饭量自己知道。——苏联
实验三 细Байду номын сангаас形态观察和革兰氏染色技
术
21、没有人陪你走一辈子，所以你要 适应孤 独，没 有人会 帮你一 辈子， 所以你 要奋斗 一生。 22、当眼泪流尽的时候，留下的应该 是坚强 。 23、要改变命运，首先改变自己。
24、勇气很有理由被当作人类德性之 首，因 为这种 德性保 证了所 有其余 的德性 。--温 斯顿． 丘吉尔 。 25、梯子的梯阶从来不是用来搁脚的 ，它只 是让人 们的脚 放上一 段时间 ，以便 让别一 只脚能 够再往 上登。
革兰染色及细菌形态结构观察
均匀，不宜过厚；热固定温度不宜过高，（以玻片背面不烫手为宜）， 否则会改变甚至破坏细胞形态；水洗时不要直接冲洗涂面，而应使水从 载玻片的一端流下，水流不宜过急，过大，以免涂片薄层脱落。
革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节， 脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染为阴性菌。
霍乱弧菌
特殊构造的观察Ⅰ
鞭毛
变形杆菌
特殊构造的观察Ⅲ
芽孢
破伤风梭菌
枯草芽孢杆菌
革兰氏染色的基本原理
革兰氏染色是丹麦医生 C.Gram（革兰）于
1884年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。
根据细菌细胞壁的组分和结构不同，通过革 兰氏染色法可将所有的细菌区分为两大类G+和 G-
实 验 材 料
涂抹 自然 干燥 酒精灯 固定 结晶紫 初染 1min ，水洗 碘液 染1min , 水洗 95％酒精 0.5～1min ,水洗 复红 染0.5—1min , 水洗 吸干 镜检。
结果判定 • G﹢：紫色 G﹣：红色
3、细菌基本形态和特殊构造的的观察：
1. 利用油镜，观察细菌的基本形态（球状、 杆状和螺旋状），边观察边绘图。 2. 观察细菌的特殊构造： 大肠杆菌----示鞭毛 破伤风梭菌、枯草杆菌----示芽孢 肺炎双球菌---示荚膜
实验一
革兰染色及细菌形态 与结构的观察
一、实验目的
• 学习并掌握显微镜油镜的使用技术及维护 的基本知识 • 使用油镜观察细菌的基本形态和特殊构造 • 初步掌握细菌涂片方法 • 学习并掌握革兰氏染色法步骤
二、实验内容
1、显微镜的使用 • 操作步骤：（1）坐姿。（2）识别油镜头。（3）对光。 （4）滴加香柏油。（5）调焦距。（6）清洁保养。 2、细菌的革兰染色法
革兰氏染色结果是否正确，乙醇脱色是革兰氏染色操作的关键环节， 脱色不足，阴性菌被误染成阳性菌，脱色过度，阳性菌被误染为阴性菌。
霍乱弧菌
特殊构造的观察Ⅰ
鞭毛
变形杆菌
特殊构造的观察Ⅲ
芽孢
破伤风梭菌
枯草芽孢杆菌
革兰氏染色的基本原理
革兰氏染色是丹麦医生 C.Gram（革兰）于
1884年发明的一种鉴别不同类型细菌的染色方法。
根据细菌细胞壁的组分和结构不同，通过革 兰氏染色法可将所有的细菌区分为两大类G+和 G-
实 验 材 料
涂抹 自然 干燥 酒精灯 固定 结晶紫 初染 1min ，水洗 碘液 染1min , 水洗 95％酒精 0.5～1min ,水洗 复红 染0.5—1min , 水洗 吸干 镜检。
结果判定 • G﹢：紫色 G﹣：红色
3、细菌基本形态和特殊构造的的观察：
1. 利用油镜，观察细菌的基本形态（球状、 杆状和螺旋状），边观察边绘图。 2. 观察细菌的特殊构造： 大肠杆菌----示鞭毛 破伤风梭菌、枯草杆菌----示芽孢 肺炎双球菌---示荚膜
实验一
革兰染色及细菌形态 与结构的观察
一、实验目的
• 学习并掌握显微镜油镜的使用技术及维护 的基本知识 • 使用油镜观察细菌的基本形态和特殊构造 • 初步掌握细菌涂片方法 • 学习并掌握革兰氏染色法步骤
二、实验内容
1、显微镜的使用 • 操作步骤：（1）坐姿。（2）识别油镜头。（3）对光。 （4）滴加香柏油。（5）调焦距。（6）清洁保养。 2、细菌的革兰染色法
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实验三细菌形态 结构观察及革兰
染色
实验目的
１掌握细菌的基本形态及特殊结构 2 掌握革兰染色的原理、方法、结果 3 掌握油镜的使用原理及使用方法
实验原理
G染色原理：等电点学说 化学学说 通透性学说
实验用品
1、菌种 培养24h的葡萄球菌、大肠杆菌。 2、染液 革兰氏染液 草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、稀 释石炭酸复红染液。 3、其他物品 接种环、吸水纸、酒精灯、载玻片、 显微镜、香柏油、擦镜纸、细菌标本片等。
肺炎链球菌电镜图
G-球菌：
淋球菌
G-杆菌：
大肠埃希菌
G-弧菌：
霍乱弧菌
（二）、细菌特殊结构观察
1. 荚膜：肺炎球菌 2. 鞭毛：变形杆菌（周鞭毛）、霍乱弧菌（单鞭毛） 3. 芽胞：破伤风杆菌（顶端）、炭疽杆菌（中部）
荚膜：
❖ 概念:某些细菌在其细胞壁外包绕一层粘液性物质
❖ 生物学意义:
1.保护细菌，与细菌致病性有关
G+菌
初染
结
G-菌
晶 紫
一
媒染
卢 戈 氏 碘 液
一
95%
脱色
乙 醇
半
复染
石 碳 酸 复 红
半
（一）、革兰染色原理
等电点学说 化学学说 通透性学说
G+菌 PI 2~3
G-菌 PI 4~5
带负电荷多
带负电荷少
含核糖核酸镁盐多 含核糖核酸镁盐少
低
高
肽聚糖多，脂质少 肽聚糖少，脂质多
酒精不易进入
酒精易进入
（四）、革兰染色注意事项
❖ 涂片要均匀，不可太厚 ❖ 干燥时切勿在火焰上直烤 ❖ 染色时脱色最关键 ❖ 细流水冲洗，不要直冲涂膜 ❖ 涂片上积水不能太多，以免稀释染液
（五）、革兰染色的意义
1、鉴别细菌 通过染色将细菌分为G+、G-两大类细菌
2、研究与致病性的关系 G+菌致病一般为外毒素 G-菌致病一般为内毒素
4、如在实验过程中发生有菌材料溅出、污染环境或化学药品 灼伤等意外情况，应立即报告老师，以便及时处理。
5、爱护仪器设备，不经老师批准，不准自行接通、断开电 源或拆卸仪器。对仪器设备造成人为损坏的，要酌情赔 偿。实验结束后，仪器设备状态复原。
6、实验结束后，清洁台面、所有循环使用器材复原；安排 值日生打扫卫生；检查水、电、门、窗等设施，并经实 验室负责人检查认可。
3. 鉴别细菌 每种细菌形成一种类型芽胞
芽胞的大小、形状、位置等随菌种而异，有重要的鉴 别意义
肉毒梭菌
破伤风杆菌
炭疽芽胞杆菌
二、革兰染色法
❖ 革兰染色法是细菌学中最广泛使用的一 种鉴别染色法。由丹麦医师Christian Gram创立。
❖ 方法是先将细菌用结晶紫染色，加媒染 剂（增加染料和细胞的亲和力）媒染后， 用脱色剂（乙醇）脱色，再用复染剂染 色。
（二）、 G染色步骤与方法
1、涂片制备
涂片
干燥
固定
2、染色
初染（结晶紫） 1min 媒染（卢戈氏碘
液） 1min 脱色（95%乙醇） 30s 复染（石 碳酸复红） 30s 吸水纸吸干
3、镜检（油镜下观察）
每次染色后都要进行冲洗 时间：一、一、半、半
（三）、G染色结果
葡萄球菌
革兰氏阳性
大肠杆菌
革兰氏阴性
目镜
物镜 载物台 集光器
光源
镜臂
粗螺旋 细螺旋
（二）油镜使用方法
1．对光 接通电源，打开显微镜上的电源开关，内置光源灯亮，并可调
节亮度。使用油镜时，应将灯光调至最亮，聚光器升至最高，光栅完全 打开。
2．标本加油 在细菌染色片的菌膜上滴加1滴香柏油，注意勿使载物台
倾斜，以免镜油流淌。
3．识别并转换油镜头 油镜有三种标志：①放大倍数×100；②镜头
下缘有一圈白线；③英文标识“oil”。找到油镜，旋转物镜转换器（勿 用手直接掰动镜头）使油镜头转至载物台中央。
4．调焦、观察标本 从侧面观察并缓慢转动粗调螺旋，使载物台上升
至油镜头浸入油中并几乎与玻片接触（注意勿使两者相碰）时为止；眼 睛转向目镜观察视野，并往相反方向转动粗调螺旋缓慢下降载物台，至 视野中闪现标本轮廓时为止；再转换细调螺旋调节至物像清晰。若直至 油镜头脱离油滴仍未看到物象，可重复以上操作。
（三）油镜使用注意事项
❖ 显微镜属于精密仪器，使用时需仔细小心、避免震动。
3、指导临床用药 G+菌对青霉素、红霉素、头孢菌素敏感 G-菌对上述药物不敏感，对链霉素、氯霉素、庆大霉素、
卡那霉素等敏感
三、显微镜油镜的使用
（一）油镜工作原理
❖ 油镜的透镜非常小。在不加油的情况下，由于空气和玻璃对 光线的折射率不同，因此光线透过载玻片经过空气时发生散 射，很少能够进入油镜，造成物像不清。香柏油（n=1.515） 的折光率与玻璃（n=1.52）相近，由于光线透入时不会因折 射而减弱，因此视野明亮，物像清晰。
霍乱弧菌（单鞭毛）
芽孢：
❖ 概念:某些细菌在一定的环境条件下，能在菌体内部形成 一个圆形或卵圆形小体，是细菌的休眠形式。
❖ 生物学意义
1.芽胞抵抗力强，故应以杀灭芽胞作为可靠的灭菌指标。高压蒸汽灭 菌法是杀灭芽孢最有效的方法。
2.芽胞的抵抗力强，可在自然界中存在多年，是重要的传染源。但芽 胞并不直接引起疾病，只有发芽成为繁殖体后，才能迅速大量繁殖而 致病。
2.用于细菌的鉴别与分型
荚膜
肺炎链球菌荚膜
荚膜：
肺炎链球菌
鞭毛：
❖ 概念：许多细菌在菌体上附有细长并呈波状弯曲的丝状
物
❖ 生物学意义
1.鞭毛是运动器官。有鞭毛的细菌能主动运动，可通过动 力试验进行细菌鉴定。 2.有的细菌其鞭毛与致病性有关。 3.可作为细菌分类、分型的依据。
鞭毛：
鞭毛
变形杆菌（周鞭毛）
7、用肥皂或消毒液洗手、脱隔离衣后方可离开实验室。
一、细菌基本形态、特殊结构观察
（一）、细菌基本形态观察
1. 球菌：G+：葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌 G-：淋球菌
2. 杆菌：大肠杆菌（G-）
3. 螺形菌：霍乱弧菌（G-）
G+球菌：
葡萄球菌
链 球 菌
G+球菌： 肺炎球菌
痰液中的肺炎链球菌 （革兰染色，×1 细菌的G染色（操作，6人/组）
病原生物学实验室守则
1、学生进实验室应穿好实验室专用隔离衣；与实验无关物品 不准带入实验室，所有实验材料严禁带出实验室。
2、实验室内禁止吸烟及饮食。
3、严格操作规程，杜绝生物安全事故。污染标本及使用过的 有菌器材放于指定的消毒缸内，统一进行消毒处理。需要 培养的物品做好标记，放于指定培养箱内。
染色
实验目的
１掌握细菌的基本形态及特殊结构 2 掌握革兰染色的原理、方法、结果 3 掌握油镜的使用原理及使用方法
实验原理
G染色原理：等电点学说 化学学说 通透性学说
实验用品
1、菌种 培养24h的葡萄球菌、大肠杆菌。 2、染液 革兰氏染液 草酸铵结晶紫染液、卢戈氏碘液、95%乙醇、稀 释石炭酸复红染液。 3、其他物品 接种环、吸水纸、酒精灯、载玻片、 显微镜、香柏油、擦镜纸、细菌标本片等。
肺炎链球菌电镜图
G-球菌：
淋球菌
G-杆菌：
大肠埃希菌
G-弧菌：
霍乱弧菌
（二）、细菌特殊结构观察
1. 荚膜：肺炎球菌 2. 鞭毛：变形杆菌（周鞭毛）、霍乱弧菌（单鞭毛） 3. 芽胞：破伤风杆菌（顶端）、炭疽杆菌（中部）
荚膜：
❖ 概念:某些细菌在其细胞壁外包绕一层粘液性物质
❖ 生物学意义:
1.保护细菌，与细菌致病性有关
G+菌
初染
结
G-菌
晶 紫
一
媒染
卢 戈 氏 碘 液
一
95%
脱色
乙 醇
半
复染
石 碳 酸 复 红
半
（一）、革兰染色原理
等电点学说 化学学说 通透性学说
G+菌 PI 2~3
G-菌 PI 4~5
带负电荷多
带负电荷少
含核糖核酸镁盐多 含核糖核酸镁盐少
低
高
肽聚糖多，脂质少 肽聚糖少，脂质多
酒精不易进入
酒精易进入
（四）、革兰染色注意事项
❖ 涂片要均匀，不可太厚 ❖ 干燥时切勿在火焰上直烤 ❖ 染色时脱色最关键 ❖ 细流水冲洗，不要直冲涂膜 ❖ 涂片上积水不能太多，以免稀释染液
（五）、革兰染色的意义
1、鉴别细菌 通过染色将细菌分为G+、G-两大类细菌
2、研究与致病性的关系 G+菌致病一般为外毒素 G-菌致病一般为内毒素
4、如在实验过程中发生有菌材料溅出、污染环境或化学药品 灼伤等意外情况，应立即报告老师，以便及时处理。
5、爱护仪器设备，不经老师批准，不准自行接通、断开电 源或拆卸仪器。对仪器设备造成人为损坏的，要酌情赔 偿。实验结束后，仪器设备状态复原。
6、实验结束后，清洁台面、所有循环使用器材复原；安排 值日生打扫卫生；检查水、电、门、窗等设施，并经实 验室负责人检查认可。
3. 鉴别细菌 每种细菌形成一种类型芽胞
芽胞的大小、形状、位置等随菌种而异，有重要的鉴 别意义
肉毒梭菌
破伤风杆菌
炭疽芽胞杆菌
二、革兰染色法
❖ 革兰染色法是细菌学中最广泛使用的一 种鉴别染色法。由丹麦医师Christian Gram创立。
❖ 方法是先将细菌用结晶紫染色，加媒染 剂（增加染料和细胞的亲和力）媒染后， 用脱色剂（乙醇）脱色，再用复染剂染 色。
（二）、 G染色步骤与方法
1、涂片制备
涂片
干燥
固定
2、染色
初染（结晶紫） 1min 媒染（卢戈氏碘
液） 1min 脱色（95%乙醇） 30s 复染（石 碳酸复红） 30s 吸水纸吸干
3、镜检（油镜下观察）
每次染色后都要进行冲洗 时间：一、一、半、半
（三）、G染色结果
葡萄球菌
革兰氏阳性
大肠杆菌
革兰氏阴性
目镜
物镜 载物台 集光器
光源
镜臂
粗螺旋 细螺旋
（二）油镜使用方法
1．对光 接通电源，打开显微镜上的电源开关，内置光源灯亮，并可调
节亮度。使用油镜时，应将灯光调至最亮，聚光器升至最高，光栅完全 打开。
2．标本加油 在细菌染色片的菌膜上滴加1滴香柏油，注意勿使载物台
倾斜，以免镜油流淌。
3．识别并转换油镜头 油镜有三种标志：①放大倍数×100；②镜头
下缘有一圈白线；③英文标识“oil”。找到油镜，旋转物镜转换器（勿 用手直接掰动镜头）使油镜头转至载物台中央。
4．调焦、观察标本 从侧面观察并缓慢转动粗调螺旋，使载物台上升
至油镜头浸入油中并几乎与玻片接触（注意勿使两者相碰）时为止；眼 睛转向目镜观察视野，并往相反方向转动粗调螺旋缓慢下降载物台，至 视野中闪现标本轮廓时为止；再转换细调螺旋调节至物像清晰。若直至 油镜头脱离油滴仍未看到物象，可重复以上操作。
（三）油镜使用注意事项
❖ 显微镜属于精密仪器，使用时需仔细小心、避免震动。
3、指导临床用药 G+菌对青霉素、红霉素、头孢菌素敏感 G-菌对上述药物不敏感，对链霉素、氯霉素、庆大霉素、
卡那霉素等敏感
三、显微镜油镜的使用
（一）油镜工作原理
❖ 油镜的透镜非常小。在不加油的情况下，由于空气和玻璃对 光线的折射率不同，因此光线透过载玻片经过空气时发生散 射，很少能够进入油镜，造成物像不清。香柏油（n=1.515） 的折光率与玻璃（n=1.52）相近，由于光线透入时不会因折 射而减弱，因此视野明亮，物像清晰。
霍乱弧菌（单鞭毛）
芽孢：
❖ 概念:某些细菌在一定的环境条件下，能在菌体内部形成 一个圆形或卵圆形小体，是细菌的休眠形式。
❖ 生物学意义
1.芽胞抵抗力强，故应以杀灭芽胞作为可靠的灭菌指标。高压蒸汽灭 菌法是杀灭芽孢最有效的方法。
2.芽胞的抵抗力强，可在自然界中存在多年，是重要的传染源。但芽 胞并不直接引起疾病，只有发芽成为繁殖体后，才能迅速大量繁殖而 致病。
2.用于细菌的鉴别与分型
荚膜
肺炎链球菌荚膜
荚膜：
肺炎链球菌
鞭毛：
❖ 概念：许多细菌在菌体上附有细长并呈波状弯曲的丝状
物
❖ 生物学意义
1.鞭毛是运动器官。有鞭毛的细菌能主动运动，可通过动 力试验进行细菌鉴定。 2.有的细菌其鞭毛与致病性有关。 3.可作为细菌分类、分型的依据。
鞭毛：
鞭毛
变形杆菌（周鞭毛）
7、用肥皂或消毒液洗手、脱隔离衣后方可离开实验室。
一、细菌基本形态、特殊结构观察
（一）、细菌基本形态观察
1. 球菌：G+：葡萄球菌、链球菌、肺炎球菌 G-：淋球菌
2. 杆菌：大肠杆菌（G-）
3. 螺形菌：霍乱弧菌（G-）
G+球菌：
葡萄球菌
链 球 菌
G+球菌： 肺炎球菌
痰液中的肺炎链球菌 （革兰染色，×1 细菌的G染色（操作，6人/组）
病原生物学实验室守则
1、学生进实验室应穿好实验室专用隔离衣；与实验无关物品 不准带入实验室，所有实验材料严禁带出实验室。
2、实验室内禁止吸烟及饮食。
3、严格操作规程，杜绝生物安全事故。污染标本及使用过的 有菌器材放于指定的消毒缸内，统一进行消毒处理。需要 培养的物品做好标记，放于指定培养箱内。