高保真DNA聚合酶在SNP检测中的应用
一种基于聚合酶链式反应检测SNP的方法
中国农业大学学报２００６，１１（３）：５１—５５ＪｏｕｒｎａｌｏｆＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ一种基于聚合酶链式反应检测ＳＮＰ的方法郑艳萍１，２ＣｈａｎｄｅｒＳｕｂｈａｓｈｌ，２杨小红１，２周俊青１，２李建生１，２严建兵１，２（１．中国农业大学农学与生物技术学院，北京１０００９４；２．国家玉米改良中心，北京１０００９４）摘要ＳＮＰ是具有广泛利用潜力的第３代分子标记。
本文旨在开发一种利用ＰＣＲ技术快速检测ＳＮＰ的方法。
设计思路是：根据已知ＳＮＰ位点设计２条特异正向引物，其最后一个碱基分别与已知ＳＮＰ的２个碱基相同，同时在１条引物的５’端添加１段２０ｂｐ左右的其他物种的特异序列（如细菌ＤＮＡ序列），然后选择１条合适的反向引物；最后同时加入３条引物，通过梯度ＰＣＲ选择合适的退火温度进行ＰＣＲ反应。
利用这一方法成功将玉米的ＺＤＳ基因定位在玉米第７染色体短臂７．０２Ｂｉｎ。
这种检测ＳＮＰ的方法设计简单。
费用低廉，尤其适合ＳＮＰ标记的分子标记连锁图构建或者基因定位。
关键词Ａｌｌｅｌｅ—ＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅＰＣＲ（ＡＣ—ＰＣＲ）；单核苷酸多态性；基因定位中图分类号Ｑ３４３．１７；Ｓ５１３文章编号１００７—４３３３（２００６）０３—００５１—０５文献标识码ＡＭｅｔｈｏｄｆｏｒｄｅｔｅｃｔｉｎｇＳＮＰｂａｓｅｄｏｎＰＯＲｔｅｃｈｎｉｑｕｅＺｈｅｎｇＹａｎｐｉｎ９１一，ＣｈａｎｄｅｒＳｕｂｈａｓｈｌ一，ＹａｎｇＸｉａｏｈｏｎ９１一，ＺｈｏｕＪｕｎｑｉｎ９１一，ＬｉＪｉａｎｓｈｅｎ９１一，ＹａｎＪｉａｎｂｉｎ９１・２（１．ＣｏｌｌｅｇｅｏｆＡｇｒｏｎｏｍｙａｎｄＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ＣｈｉｎａＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ。
Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００９４，Ｃｈｉｎａ；２．ＮａｔｉｏｎａｌＭａｉｚｅＩｍｐｒｏｖｅｍｅｎｔＣｅｎｔｅｒｏｆＣｈｉｎａ，Ｂｅｌｌｉｎｇ１０００９４，Ｃｈｉｎａ）ＡｂｓｔｒａｃｔＳＮＰｉＳｏｎｅｋｉｎｄＯｆｐｏｗｅｒｆｕｌｍｏｌｅｃｕｌａｒｍａｒｋｅｒｓ．ＴｈｅｐｕｒｐｏｓｅｉｎｔｈｉｓｓｔｕｄｙＷａｓｔｏｅｓｔａｂｌｉｓｈａｓｉｍｐｌｅｍｅｔｈｏｄｏｆｄｅｔｅｃｔｉｎｇＳＮＰｂａｓｅｄｏｎＰＣＲｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｔｗｏｓｐｅｃｉｆｉｃｆｏｒｗａｒｄｐｒｉｍｅｒｓｗｅｒｅｓｙｎｔｈｅｓｉｚｅｄ．ｂｏｔｈｗｅｒｅｉｎｃｏｎｆｏｒｍｉｔｙｗｉｔｈｔｈｅｆｏｕｎｄＳＮＰｉｎｔｈｅＩａｓｔｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ．Ａ１９ｂｐｐｅｃｉｃｉｆｉｃｓｅｑｕｅｎｃｅｗａｓａｄｄｅｄｉｎｔｏｏｎｅｐｒｉｍｅｒｗｉｔｈｏｔｈｅｒｓｐｅｃｉｅｓ’ｓｅ—ｑｕｅｎｃｅ（ｅｇ．ＢａｃｔｅｒｉａＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅ）ｉｎ５’ｅｎｄ．ＴｈｅｓａｍｅｒｅｖｅｒｓｅｄｐｒｉｍｅｒｗａｓｓｅｌｅｃｔｅｄｕｓｉｎｇｔｈｅｓｏｆｔｗａｒｅＰｒｉｍｅｒ５．０．ＴｈｅＰＣＲｗａｓｐｅｒｆｏｒｍｅｄｗｉｔｈｔｈｅｔｈｒｅｅｓｐｅｃｉｆｉｃｐｒｉｍｅｒｓｕｓｉｎｇａｎａｐｐｒｏｐｒｉａｔｅａｎｎｅａｌｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｓｅｌｅｃｔｅｄｂｙｇｒａ—ｄｉｅｎｔＰＣＲ．ＴｈｅＺＤＳｇｅｎｅｈａｓｂｅｅｎｍａｐｐｅｄｏｎｔｈｅｓｈｏｒｔａｒｍＯｆｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ７ｉｎｍａｉｚｅｂａｓｅｄｏｎｔｈｉｓｍｅｔｈｏｄ．Ｔｈｉｓｔｅｃｈｎｉｑｕｅｉｓｓｉｍｐｌｅ，ｅｆｆｅｃｔｉｖｅａｎｄｃｈｅａｐ，ａｎｄｃｏｕｌｄｂｅｈｅｌｐｆｕｌｉｎｃｏｎｓｔｒｕｃｔｉｎｇｌｉｎｋａｇｅｍａｐｓａｎｄｍａｐｇｅｎｅｓ．ＫｅｙｗｏｒｄｓＡｌｌｅｌｅ－ＣｏｍｐｅｔｉｔｉｖｅＰＣＲ（ＡＣ－ＰＣＲ）；ＳｉｎｇｌｅＮｕｃｌｅｏｔｉｄｅＰｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ（ＳＮＰ）；ｇｅｎｅｍａｐｐｉｎｇ１９８０年Ｂｏｔｓｔｅｉｎ等首次提出ＤＮＡ限制性片段长度多态性（ＲＦＬＰ）概念以来［１］，ＤＮＡ分子标记技术发展迅速，已经成为基因定位、连锁图构建、数量性状分析、资源收集评估等研究领域不可或缺的工具，发展快速、方便和低廉的分子标记技术已成为遗传学和分子生物学研究的重要内容。
SNP检测原理和应用
SNP检测原理和应用SNP（单核苷酸多态性）是指在基因组中存在的单个核苷酸变异，也是造成个体之间遗传差异的主要形式之一、SNP检测原理是通过不同的技术手段检测基因组的SNP位点，并将不同个体之间的SNP变异与疾病、药物反应等进行关联分析，从而用于研究和预测人类复杂疾病的发生机制和个体化治疗。
SNP检测的主要技术包括基于凝胶电泳的限制片段长度多态性（RFLP）、聚合酶链反应（PCR）扩增测序、DNA芯片技术和基因测序等。
其中，RFLP是早期应用最广的技术，主要通过特定限制酶酶切目标DNA片段，然后通过凝胶电泳分离DNA片段，根据不同基因型的片段长度差异进行分型和分析。
PCR扩增测序技术则通过特定引物扩增目标DNA片段，再通过测序技术获得具体的SNP位点信息。
DNA芯片技术则通过固相杂交将DNA片段与特定的SNP探针结合，然后通过荧光标记的信号检测技术获得SNP位点信息。
而基因测序技术则是目前应用最广泛和高通量的SNP检测技术，通过测序获得整个基因组的SNP信息。
SNP检测的应用非常广泛。
首先，SNP检测可用于研究人类复杂疾病的发病机制。
复杂疾病的发生不仅受到环境因素的影响，还与多个基因的相互作用有关。
通过SNP检测，可以发现与复杂疾病相关的SNP位点，并进一步研究这些位点与疾病的关联关系以及其在疾病发生发展过程中的作用。
这为疾病预防、治疗和个体化医疗提供了重要的依据。
其次，SNP检测可用于预测个体对药物的反应和副作用。
由于个体对药物的反应存在巨大的差异，因此通过SNP检测可以发现与药物代谢、药物作用靶点相关的SNP位点，并据此预测个体对药物的反应。
这样可以实现个体化的用药方案，提高药物疗效，减少副作用。
此外，SNP检测还可以用于亲子鉴定、法医学鉴定、种群遗传学研究、植物和动物遗传改良等领域。
例如，通过SNP检测可以判断是否为亲生子女，鉴定遗传疾病的患者或罪犯，追溯人类的遗传演化历程，以及选择适应环境的作物和动物品种。
SNP分子标记的原理及应用解读
SNP分子标记的原理及应用解读SNP（Single Nucleotide Polymorphism，单核苷酸多态性）是指个体间在DNA序列中存在的单个碱基差异。
SNP是最常见的遗传变异形式，它在基因组中广泛存在，可以用来研究个体之间的遗传差异。
SNP分子标记技术通过检测SNP位点上的碱基差异，可以用来研究生物个体的遗传相关性、种群结构、物种起源、适应性以及疾病的遗传风险等。
SNP分子标记的原理是基于PCR（聚合酶链反应）技术，在PCR反应中引入荧光标记的引物来扩增感兴趣的SNP位点。
SNP位点上的碱基差异会导致引物与模板DNA序列的匹配性不同，从而影响PCR反应的效率和产物的数量。
这种差异可以通过凝胶电泳或者高通量测序等方法来检测。
1.遗传研究：SNP是人类基因组中最常见的遗传变异形式，可以用来研究个体之间的遗传差异。
通过分析SNP位点上的碱基差异，可以确定个体之间的亲缘关系、种群的遗传结构以及物种的起源演化等。
2.遗传性疾病的研究：SNP位点与许多遗传性疾病之间存在关联。
通过分析SNP位点上的碱基差异，可以确定个体对一些疾病的易感性风险，进而进行早期预防和干预。
3.个体化药物治疗：个体的基因差异可以影响药物的代谢和疗效。
通过分析SNP位点上的碱基差异，可以预测个体对一些药物的反应，进而实现个体化的药物治疗。
4.农业育种：SNP分子标记可用于农作物和家畜等的品种鉴定、个体选择和育种进展的监测等。
通过分析SNP位点上的碱基差异，可以选择具有优良特性的个体进行育种，提高农作物和家畜的产量和品质。
除了以上几个应用领域，SNP分子标记还可以应用于环境研究、种群遗传分析、疾病的诊断和预后、区域起源和扩散等方面。
由于其高度可重复性、高通量性和成本效益等特点，SNP分子标记已成为现代生命科学研究的重要工具之一、随着高通量测序技术的不断发展，SNP分子标记技术还将进一步发展和应用。
三种dna聚合酶的作用
DNA聚合酶是一类能够催化DNA合成的酶，它们在生物体的DNA复制、修复和重组等过程中发挥着重要作用。
根据其功能和特点，DNA聚合酶可分为多种类型，其中最常见的有三种：DNA聚合酶I、DNA聚合酶II和DNA聚合酶III。
下面将分别介绍这三种DNA聚合酶的作用。
1.DNA聚合酶I（Pol I）DNA聚合酶I是一种多功能酶，它在原核生物（如细菌）和真核生物（如人类）中都存在。
它具有以下几种主要活性：（1）聚合活性：在5'→3'方向上，将单个脱氧核苷酸添加到生长中的DNA链的3'-OH末端。
这种活性需要模板DNA链和与模板链互补的引物。
（2）外切活性：从5'→3'方向上，切割DNA链上的核苷酸。
这种活性在DNA修复和校对过程中起到关键作用，因为它可以去除错误配对的核苷酸。
（3）内切活性：在特定条件下，DNA聚合酶I还可以切割DNA链内部的磷酸二酯键。
这种活性在DNA修复过程中也起到一定作用。
2.DNA聚合酶II（Pol II）DNA聚合酶II主要存在于真核生物中，它的主要功能是在DNA损伤修复过程中填补单链缺口。
与DNA聚合酶I不同，DNA聚合酶II具有更强的校对能力，因此它在DNA修复过程中的准确性更高。
此外，DNA聚合酶II还参与一些特殊的DNA修复途径，如跨越损伤合成（TLS）和断裂诱导复制（BIR）。
3.DNA聚合酶III（Pol III）DNA聚合酶III是原核生物中最主要的DNA复制酶，它在DNA复制过程中起到核心作用。
DNA聚合酶III具有以下特点：（1）高保真性：DNA聚合酶III具有高度的校对能力，因此在DNA复制过程中的错误率非常低。
（2）高速性：与其他类型的DNA聚合酶相比，DNA聚合酶III的合成速度更快，这使得它在DNA复制过程中能够快速地进行链延伸。
（3）协同作用：DNA聚合酶III通常与一些辅助蛋白（如β亚基、γ复合物和τ因子）一起工作，这些辅助蛋白可以提高DNA聚合酶III的稳定性和活性。
SNP的原理和应用
SNP的原理和应用1. 简介SNP（Single Nucleotide Polymorphism），即单核苷酸多态性，是指基因组中单个核苷酸的变异，常常出现在基因的编码区和非编码区，是人类和其他物种基因组的重要组成部分。
SNP的发现和研究对于遗传学、基因组学以及人类疾病的研究具有重要意义。
2. SNP的原理SNP的形成是由于基因组中的碱基对发生突变，导致一个碱基替换成另外一个碱基。
SNP的存在可以影响基因的功能以及物种个体的表型差异。
SNP的分析通常是通过对DNA序列的测序和比对来进行的。
SNP的主要类型包括：纯合SNP（homozygous SNP）和杂合SNP （heterozygous SNP），前者指的是同一位点上两个等位基因中只有一种存在，后者指的是同一位点上两个等位基因都存在。
3. SNP的检测方法目前，常用的SNP检测方法主要包括基于PCR的方法、测序方法以及芯片分析方法。
3.1 基于PCR的方法基于PCR的SNP分析方法包括引物延伸（Primer Extension）、限制性片段长度多态性（RFLP）以及引物扩增反应-聚合酶链式反应（ARMS-PCR）等。
这些方法结合了PCR技术和适当的检测技术，可以快速准确地检测SNP。
3.2 测序方法测序方法是一种直接测定DNA序列的方法，包括链终止法（Sanger测序）、高通量测序技术（如454测序、Illumina测序）以及单分子测序技术（如PacBio 测序）。
这些方法可以读取SNP位点的具体碱基序列，提供更准确的SNP检测结果。
3.3 芯片分析方法芯片分析方法是通过将已知的SNP探针固定在芯片上，再将待测DNA样本与探针进行杂交，最后通过芯片扫描和图像分析确定SNP型态。
芯片分析方法具有高通量、高准确性和高效率的特点。
4. SNP的应用SNP在遗传学研究、人类疾病研究以及个体化医疗等领域有着广泛的应用。
4.1 遗传学研究SNP的广泛分布使其成为遗传学研究的理想工具。
SNP检测方法汇总
SNP检测方法汇总SNP（Single Nucleotide Polymorphism）是存在于基因组中的最小的遗传变异单位，是指基因组中单个核苷酸发生变化的现象。
SNP检测方法是针对这些变异进行分析和检测的工具或技术。
本文将对目前常用的SNP检测方法进行汇总和介绍。
1.基于PCR的SNP检测方法PCR是一种常用的DNA复制技术，在SNP检测中有多种变体，包括追踪标记PCR（TaqMan PCR）、Allele-Specific PCR（AS-PCR）、限制性片段长度多态性（RFLP）PCR等。
这些方法都利用PCR扩增目标DNA片段，并通过引入特定的引物或酶切位点来区分不同等位基因的差异。
2.基于测序的SNP检测方法测序是一种直接测定DNA序列的方法，可以通过测序检测SNP。
在基于测序的SNP检测中，有两种主要的方法：Sanger测序和大规模并行测序（Next-Generation Sequencing，NGS）。
Sanger测序是一种经典的测序方法，能够准确地确定单个核苷酸的序列，但是对于大规模SNP检测来说成本较高。
而NGS技术则可以同时测定多个样本的DNA序列，且速度和成本都更高效。
3.基于芯片的SNP检测方法芯片技术是通过固相法在芯片上固定已知的DNA片段，再与样本中的DNA进行杂交来实现SNP检测。
常用的芯片技术包括基于碱基延伸法（Primer Extension Assay）的Oligonucleotide Ligation Assay （OLA）、基于碱基延伸法的SNPstream和基于液相杂交法的GeneChip等。
这些方法在检测过程中通常采用荧光探针标记样本的SNP位点，通过荧光检测的方式进行分析和鉴定。
4.基于质谱的SNP检测方法质谱技术是通过检测质量-电荷比（m/z）来对样本中的DNA片段进行分析和检测的方法。
基于质谱的SNP检测主要采用基因分型质谱法（genotyping mass spectrometry），其中常用的方法有MALDI-TOF质谱（Matrix-Assisted Laser Desorption/Ionization Time-of-Flight Mass Spectrometry）和Sequenom质谱。
SNP分子标记的原理及应用
SNP分子标记的原理及应用SNP（单核苷酸多态性）是一种常见的遗传变异形式，其是指在基因组中，单个核苷酸发生变异所引起的差异。
SNP分子标记是通过检测SNP位点的变异情况来确定个体之间的遗传差异。
SNP分子标记具有高度的稳定性和高通量检测的优势，因此被广泛应用于遗传学、基因组学、生物学研究以及医学诊断等领域。
首先，SNP位点的检测是指对目标DNA样本中的SNP位点进行筛查和确定。
目前常用的SNP检测方法有PCR-RFLP（聚合酶链式反应-限制性片段长度多态性）、TaqMan探针法、等位基因特异性扩增等。
其中，PCR-RFLP是最为常用的方法之一、该方法通过PCR扩增目标DNA片段，然后利用特异性内切酶切割PCR产物，根据不同SNP位点的限制酶切模式进行分析，从而确定SNP位点的变异型。
而TaqMan探针法是一种高度特异性的SNP鉴定方法，通过引入特异性的TaqMan探针来区分不同SNP位点的变异型。
等位基因特异性扩增方法则是通过引入特异性引物和探针，根据SNP位点上的变异基因特异性扩增PCR产物，以确定SNP位点的变异情况。
SNP分子标记的应用非常广泛。
在人类遗传学和基因组学研究中，SNP分子标记被广泛应用于基因关联研究、人类种群遗传结构分析、基因组遗传图谱构建等。
在农业和动植物遗传改良领域，SNP分子标记被用于作物和家畜的选育和品种鉴定。
此外，SNP分子标记也被应用于药物代谢研究、疾病预测和诊断、亲子鉴定等医学领域。
总之，SNP分子标记具有高度的稳定性和可靠性，能够有效地开展高通量、精确和快速的遗传研究与分析，成为现代遗传学研究和应用的重要工具。
snp分子标记的原理及应用
SNP分子标记的原理及应用概述单核苷酸多态性（SNP）是一种常见的基因组变异，它在基因组中占据重要地位。
SNP作为一种重要的分子标记，具有许多应用。
本文将从SNP的基本原理开始介绍，然后探讨SNP分子标记在遗传研究、医学诊断、农业育种等领域的应用。
SNP的原理SNP是指在基因组中单个核苷酸处发生的变异。
这些变异可以导致个体间的遗传差异，可能与疾病易感性、药物反应性、表型特征等相关。
SNP的形成有多种机制，包括突变、重组、等位基因演化等。
SNP的检测方法SNP的检测可以采用多种方法，其中最常用的方法包括：1.基于PCR的方法：通过特异性引物扩增目标SNP区域，并使用限制性内切酶或测序等技术进行检测。
2.基于芯片的方法：利用芯片上固定的DNA探针与样品DNA杂交，通过检测信号强度来确定SNP的基因型。
3.基于测序的方法：利用高通量测序技术对样品DNA进行测序，通过分析碱基对应位置碱基的差异来确定SNP。
4.基于大规模变异分析的方法：利用高通量基因分型技术，如SNP芯片、全基因组关联研究等，进行全基因组范围的SNP检测。
SNP分子标记的应用遗传研究SNP分子标记在遗传研究中发挥着重要的作用。
它可以用于构建遗传连锁图谱、进行群体遗传结构分析以及进行复杂疾病的关联分析。
通过分析SNP与特定性状的关系，可以探索人类遗传变异与疾病发生发展的相关性。
医学诊断SNP分子标记在医学诊断中具有潜在的应用。
通过分析个体SNP的基因型，可以帮助预测个体对某些药物的反应性以及易感性疾病的风险。
此外，SNP分子标记也可以用于亲子鉴定以及疾病致病基因的筛查。
农业育种SNP分子标记在农业育种中被广泛应用。
通过分析作物或家畜的SNP基因型，可以鉴定优良品种、预测物种的遗传背景、进行种质资源保护和遗传改良。
SNP分子标记的应用可以有效提高育种工作的效率和准确性。
DNA人身鉴定SNP分子标记在人身鉴定领域也起到了重要作用。
通过对个体的SNP基因型进行分析，可以确定个体的遗传信息，用于刑事侦破、亲子关系鉴定以及基因地理学研究等方面。
taq酶与高保真酶原理
taq酶与高保真酶原理Taq酶和高保真酶是在分子生物学实验中广泛使用的两种酶。
它们在DNA复制和扩增过程中起着关键的作用。
下面我将分别介绍Taq酶和高保真酶的原理。
Taq酶，全名为热稳定DNA聚合酶，是从热液生物钟海温泉中分离出的一种酶。
它能在高温条件下保持活性，因此被广泛应用于聚合酶链式反应（PCR）中。
Taq酶的特殊之处在于它能耐受PCR反应中高温（通常为94-98摄氏度）的变性条件，而不失去活性。
这使得Taq酶成为PCR反应的理想选择。
在PCR反应中，Taq酶能够扩增DNA模板，其原理可以简单概括为三个步骤。
首先，在高温下（通常为94-98摄氏度），反应混合物中的DNA双链被解旋成两条单链。
然后，在退火温度（通常为50-65摄氏度）下，引物与目标DNA序列的单链末端互补结合。
最后，Taq酶在适宜温度（通常为72摄氏度）下，沿着DNA模板的单链进行DNA合成，生成新的DNA分子。
高保真酶也是PCR反应中常用的一种酶类。
与Taq酶相比，高保真酶在PCR过程中表现出更高的DNA复制准确性和低错误率。
这使得其在需要高保真性的应用中得到广泛应用。
高保真酶的原理主要基于两个机制：外切末端3'-5'外切活性和外切碱基修复活性。
外切末端3'-5'外切活性允许酶将嵌入到扩增DNA链上的错误碱基切除，并通过3'末端移除后的新外切末端与正确碱基进行配对。
而外切碱基修复活性允许高保真酶对不配对碱基进行修复，使其更加准确地复制模板DNA序列。
总的来说，Taq酶和高保真酶在PCR反应中扮演着重要的角色。
Taq酶具有耐高温性，在高温条件下能保持活性，适用于标准PCR反应。
而高保真酶则提供了更高的准确性和较低的错误率，适用于对PCR产物质量要求较高的实验。
这些酶的应用为分子生物学研究和诊断提供了可靠的工具。
一种高保真DNA聚合酶及其制备和应用[发明专利]
![一种高保真DNA聚合酶及其制备和应用[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/89f57db170fe910ef12d2af90242a8956becaa80.png)
(10)申请公布号 (43)申请公布日 2014.12.31C N 104250641A (21)申请号 201310268966.9(22)申请日 2013.06.28C12N 9/12(2006.01)C12N 15/54(2006.01)C12N 15/70(2006.01)C12N 15/10(2006.01)(71)申请人思洛生物技术股份有限公司地址610100 四川省成都市经济技术开发区（龙泉驿区）兴茂街108号(72)发明人龙虎 狄廷娣 周裕程 万强(74)专利代理机构北京集佳知识产权代理有限公司 11227代理人赵青朵 冯琼(54)发明名称一种高保真DNA 聚合酶及其制备和应用(57)摘要本发明属于基因工程领域，公开了一种高保真DNA 聚合酶、编码该高保真DNA 聚合酶的基因，以及该高保真DNA 聚合酶的制备方法，及其在核酸扩增中的应用。
本发明公开的高保真DNA 聚合酶，其具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列，或者SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
该高保真DNA 聚合酶能够扩增高GC 含量的核酸模板、样品纯度较低的核酸模板，同时，也能实现对极低的模板量的扩增，大幅提高了高保真DNA 聚合酶的灵敏度和扩增效率，同时具有较高的保真性，适合各类PCR 及对扩增保真性要求较高的实验，也适合作为PCR 扩增试剂盒中的高保真DNA 聚合酶。
(51)Int.Cl.权利要求书1页 说明书9页序列表23页 附图2页(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书9页序列表23页 附图2页(10)申请公布号CN 104250641 A1/1页1.一种高保真DNA 聚合酶，其特征在于，其具有(Ⅰ)、(Ⅱ)所示的氨基酸序列中任意一个：(Ⅰ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列；(Ⅱ)具有SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列经取代、缺失或添加一个或多个氨基酸获得的氨基酸序列。
不同dna聚合酶的特点及应用范围
不同DNA聚合酶的特点及应用范围DNA聚合酶是一类在细胞分裂和DNA合成过程中起着关键作用的酶类，它能够催化DNA链的合成，使得DNA复制和修复得以顺利进行。
在不同的生物体和不同的环境中，存在着多种不同特点和应用范围的DNA聚合酶。
本文将对一些常见的DNA聚合酶进行介绍，分析其特点及应用范围。
1. Taq DNA聚合酶Taq DNA聚合酶是一种由热液单核菌（Thermus aquaticus）产生的热稳定DNA聚合酶。
它的主要特点包括：(1) 热稳定性：Taq DNA聚合酶具有较高的热稳定性，在高温条件下依然能够保持其催化活性，因此适用于高温PCR反应。
(2) 3'->5'外切酶活性：Taq DNA聚合酶具有3'->5'外切酶活性，使得在PCR反应中形成的双链DNA片段的末端呈现出A附加，这为DNA片段的克隆和连接提供了便利。
(3) 应用范围：Taq DNA聚合酶在分子生物学领域被广泛应用于PCR技术、DNA片段的扩增和克隆等方面。
2. Pfu DNA聚合酶Pfu DNA聚合酶是一种由嗜热古菌（Pyrococcus furiosus）产生的酶类，其特点如下：(1) 高精确度：Pfu DNA聚合酶具有较高的精确度，其错误率较低，适用于对基因组进行重测序和其他对精确度要求较高的实验。
(2) 3'->5'外切酶活性：与Taq DNA聚合酶类似，Pfu DNA聚合酶也具有3'->5'外切酶活性。
(3) 应用范围：Pfu DNA聚合酶常用于对转录因子和其他高保真基因进行扩增和突变，同时也被广泛应用于对基因组结构和序列的研究中。
3. Vent DNA聚合酶Vent DNA聚合酶是一种由热液核菌（Thermococcus litoralis）产生的热稳定DNA聚合酶，其特点包括：(1) 高度热稳定性：Vent DNA聚合酶具有较高的热稳定性，能够在高温条件下保持其酶活性。
高保真酶常见种类
高保真酶（High-fidelity enzymes）是一类能够在DNA复制和PCR等过程中高度准确地复制DNA序列的酶。
它们能够减少错误率，提高DNA复制的准确性。
以下是一些常见的高保真酶种类：
1. Pfu DNA聚合酶：Pfu（Pyrococcus furiosus）DNA聚合酶是一种热稳定的高保真酶，能够在高温下工作。
它具有3'-5'外切酶活性，能够修复DNA末端的错误配对。
2. Phusion DNA聚合酶：Phusion DNA聚合酶是一种高保真酶，具有高度准确的DNA复制能力。
它是通过融合两种不同来源的DNA聚合酶而得到的，结合了高温稳定性和高保真性。
3. Q5 DNA聚合酶：Q5 DNA聚合酶是一种高保真酶，具有高度准确的DNA复制能力。
它能够在高温下工作，并且具有高扩增效率和高产物纯度。
4. KOD DNA聚合酶：KOD DNA聚合酶是一种高保真酶，具有高度准确的DNA复制能力。
它能够在高温下工作，并且具有高扩增效率和高产物纯度。
这些高保真酶在分子生物学实验中广泛应用，特别是在需要高度准确的DNA复制和PCR扩增的实验中。
它们能够提供可靠的DNA复制和扩增结果，减少错误率，提高实验结果的可靠性。
浅析DNA 聚合酶的主要类型及作用
浅析DNA聚合酶的主要类型及作用DNA聚合酶是催化DNA或RNA为模板合成DNA的一类酶的总称。
这些聚合酶的共同特点是：它们都能把脱氧核糖核苷酸（dNTP）连续的加到双链DNA引物链的3'-羟基末端上，催化核苷酸的聚合，形成新的DNA 链。
PCR DNA聚合酶的种类包括Taq DNA聚合酶、高保真DNA聚合酶、热启动DNA聚合酶、等温扩增DNA聚合酶和链置换DNA聚合酶等。
1.Taq DNA聚合酶特点：Taq DNA聚合酶是从水生栖热菌中分离提取的，具有很高的热稳定性，能够在70℃保持活性，适合标准的PCR反应。
它缺乏3’→5’核酸外切酶活性，因此无校正功能，容易产生错配碱基。
应用：用于常规PCR扩增，尤其是当对保真度要求不高时。
其扩增产物3’末端带有A尾，可直接用于TA克隆。
2.高保真DNA聚合酶特点：这类酶具有3’→5’核酸外切酶活性，能够校正错误插入的核苷酸，显著降低错配率。
常见的有Pfu、KOD、Phusion等。
应用：适用于需要高保真度的应用场景，如基因克隆、定点突变、测序及SNP分析等。
例如，Hieff Canace®Plus High-Fidelity DNA Polymerase具有极高的保真性和扩增效率，适用于复杂模板的高保真扩增。
3.热启动DNA聚合酶特点：通过化学修饰或抗体结合，在室温下抑制其活性，直到高温激活。
这种酶可减少非特异性扩增，提高PCR反应的特异性和灵敏度。
应用：适用于需要高特异性扩增的实验，如多重PCR、复杂模板的扩增等。
例如，Hieff Union Hotstart High Specific Taq DNA Polymerase 能够有效防止非特异性扩增，并提高扩增特异性。
4.等温扩增DNA聚合酶特点：这类酶具有链置换活性和5’→3’聚合酶活性，能在恒温条件下进行快速、高效、特异性扩增。
应用：适用于等温扩增技术，如LAMP、CPA、RCA等。
DNA聚合酶高保真机理的新发现及其在SNP分析中的应用
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以及利用自然界天然存在的高保真聚合酶的这一对l7m聚合反应的关闭效应与耐外切酶消化的n末端碱基特异性引物共同构成的由单碱基多态性特异性操控的纳米级复合分子开关在后基因时代基因序列分析尤其是单碱基多态性分析中的应用
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高保真DNA聚合酶在SNP检测中的应用
第31卷第2期Vol.31No.2南华大学学报・医学版Journal of Nanhua University (Medical Edition )2003年6月Jun.2003 高保真DNA 聚合酶在SNP 检测中的应用张 佳3,廖端芳3,张 旭,陈琳玲,李 凯(南华大学药物药理研究所,湖南衡阳421001)摘 要:DNA 测序技术,使人类步入了后基因时代;而后基因时代对DNA 序列分析的新要求,尤其是有关单碱基多态性的检测,急需更高效和更特异的分析方法。
作者介绍两种可靠性高且适应性广的单碱基多态性检测新方法。
基于高保真DNA 聚合酶对引物3′末端错配碱基的校正机制,通过标记引物3′末端,配对引物得到带标记信号的产物而不配对的引物则只能得到不含标记信号的产物。
最近,我们新发现高保真DNA 聚合酶具有通过聚合反应非成熟性终止以维持成熟性终产物保真度的能力。
利用3′硫化磷酸修饰的引物,可强化由不配对引物所激发的对聚合反应的终止作用。
3′硫化磷酸修饰与高保真DNA 聚合酶共同形成一种由单碱基多态性调控的分子开关。
这一新的分子开关可与电泳等多种现有的技术联合使用,在分析单一或多个已知S NP 位点时,具有极大的应用价值。
关键词:硫化磷酸引物; 三末端标记引物; 单碱基多态性; 高保真DNA 聚合酶中图分类号:Q31 文献标识码:A 文章编号:1000-2510(2003)02-0128-04Application of DNA Polymerase With 3′Exonuclease in SNP AssayZH ANGJia ,LI AO Duan -fang ,ZH ANG Xu ,et al(Institute o f Pharmacy &Pharmacology ,Nanhua Univer sity ,Hengyang ,Hunan 421001,China )Abstract :T w o assays for S NP analysis were developed based on 3′ex onuclease of DNA polymerase.Proofreading or mismatch ed 2iting by 3′ex onuclease exhibited a reliable discrimination to single base differences ,which is used in terminal labeled allele -specific primer extenstion for S NP assay.In addition to the well -known proofreading mechanism ,we recently revealed a novel “OFF -switch ”effect by which the 3′ex onuclease is attributed to fidelity maintenance in DNA replication.With phosphorothioate -m odified allele -spe 2cific primer ,polymerase with 3′ex onuclease showed a powerful “ON ΠOFF switch ”:matched primer turned on and mismatched primer turned off DNA polymerization.These new methods especially the S NP -operated “ON ΠOFF switch ”have immediate applications in screening single and multiple S NPs.K ey w ords :phosphorothioate -midified primer ; 3′terminal labeled primer ; S NP ; ex o +DNA polymerase基金项目:国家自然科学基金资助(30171084)和国家“973”项目部分资助(G 2000056905).通讯作者:李凯,男,43岁,加拿大sherbrooke 大学药理学博士,主要从事生物技术开发等工作.Email :kaili34@.3此二位作者对本文具有相同贡献,为并列第一作者.1 SNP 检测的意义人类基因组序列测定计划的完成及多个其它物种基因组的完全测序,标志着人类已步入了后基因时代。
高保真聚合酶
高保真聚合酶
高保真聚合酶是一种高精度的DNA聚合酶，它能够在DNA复制过程中减少错误率，从而保证DNA复制的准确性。
高保真聚合酶是一种非常重要的生物学工具，它在分子生物学、基因工程、医学诊断等领域都有广泛的应用。
高保真聚合酶的特点是具有高度的准确性和稳定性。
它能够在高温环境下工作，因此被广泛应用于PCR技术中。
PCR技术是一种基于DNA复制的技术，它可以在短时间内扩增DNA片段，从而使得DNA的检测和分析变得更加容易。
高保真聚合酶在PCR技术中的应用，可以保证扩增的DNA片段的准确性和稳定性，从而提高PCR 技术的可靠性和精度。
除了在PCR技术中的应用，高保真聚合酶还被广泛应用于基因工程和医学诊断中。
在基因工程中，高保真聚合酶可以用于构建重组DNA，从而实现基因的克隆和表达。
在医学诊断中，高保真聚合酶可以用于检测病原体的DNA，从而实现疾病的早期诊断和治疗。
高保真聚合酶是一种非常重要的生物学工具，它在分子生物学、基因工程、医学诊断等领域都有广泛的应用。
随着科技的不断发展，高保真聚合酶的应用也将不断扩大和深化，为人类的健康和生活带来更多的福利。
高保真酶常见种类
高保真酶常见种类高保真酶是一类具有高精确度和高效率的酶，常用于分子生物学实验和工业应用中。
下面将介绍几种常见的高保真酶及其特点。
一、Taq DNA聚合酶Taq DNA聚合酶是一种高保真酶，常用于PCR扩增实验中。
它是从热泛菌属中分离出来的，具有耐高温的特点，可在高温环境下工作。
Taq DNA聚合酶在扩增过程中能够准确复制DNA序列，具有较高的扩增效率和较低的错误率。
二、Pfu DNA聚合酶Pfu DNA聚合酶是一种高保真酶，也常用于PCR扩增实验中。
与Taq DNA聚合酶相比，Pfu DNA聚合酶具有更高的保真度。
它来源于嗜热古菌属，能够在高温环境下工作。
Pfu DNA聚合酶能够准确复制DNA序列，不易产生错配碱基，因此在需要高保真度的扩增实验中被广泛应用。
三、Vent DNA聚合酶Vent DNA聚合酶也是一种高保真酶，适用于PCR扩增实验。
它来源于嗜热菌属，具有耐高温的特点。
Vent DNA聚合酶在扩增过程中具有高度的保真度和扩增效率，能够准确复制DNA序列。
四、Phusion DNA聚合酶Phusion DNA聚合酶是一种高保真酶，常用于PCR扩增实验中。
它具有高度的保真度和扩增效率，能够准确复制DNA序列。
Phusion DNA聚合酶是通过融合两种不同来源的酶而得到的，结合了这两种酶的优点，具有更高的扩增准确度和更低的错误率。
五、DeepVent DNA聚合酶DeepVent DNA聚合酶是一种高保真酶，适用于PCR扩增实验。
它来源于嗜热古菌属，具有耐高温的特点。
DeepVent DNA聚合酶在扩增过程中具有高度的保真度和扩增效率，能够准确复制DNA 序列。
六、AccuPrime Pfx DNA聚合酶AccuPrime Pfx DNA聚合酶是一种高保真酶，常用于PCR扩增实验。
它在扩增过程中具有高度的保真度和扩增效率，能够准确复制DNA序列。
AccuPrime Pfx DNA聚合酶通过特殊的引物设计和酶的优化，能够减少非特异性扩增产物的生成，提高扩增准确性。
聚合酶链反应技术在基因诊断中的应用
聚合酶链反应技术在基因诊断中的应用近年来，聚合酶链反应技术（Polymerase Chain Reaction，PCR）已经成为基因诊断领域中非常重要的一种技术手段，其应用范围涉及基因检测、药物筛选、肿瘤诊断等众多领域，其应用也越来越广泛，为临床医学提供了更加精准、便捷、快速的基因诊断手段。
本文将从PCR技术发展历程、PCR技术在基因诊断中的应用、PCR技术在病毒性疾病检测中的应用等方面进行阐述。
一、PCR技术发展历程PCR技术是由美国生物学家凯瑟琳·穆利斯（Kary Banks Mullis）于1983年发明的，其获得了1993年的诺贝尔化学奖。
该技术是基于DNA分子的复制原理，通过利用酶类反应体系在较短的时间内扩增一段特定的DNA序列，其产物是以指数级别增长。
PCR技术的成功，使得遗传基因检测和分析研究取得了突破性进展。
在创新之初，PCR技术的应用范围受到了一定的限制，主要是由于PCR反应体系中存在一系列的实验条件。
这些条件的不稳定性，如条件限制、长度限制、重复性限制以及装置限制等，使得PCR反应技术无法进行精确、复杂的定量和数组分析等多年应用。
随着技术手段的不断完善，PCR技术的应用范围逐渐扩大，同时也具备了更强的稳定性和准确性。
二、PCR技术在基因诊断中的应用PCR技术作为一种重要的基因检测技术，发挥了巨大的作用，其对人类基因和遗传学研究的进展产生了深远的影响。
为了进一步了解PCR技术在基因诊断中的应用，以下将分别从常见基因突变的检测、慢病基因的诊断、肿瘤基因的定量、基因表达水平的分析等方面进行详细介绍。
1.常见基因突变的检测PCR技术已经成为常见基因突变检测技术中不可或缺的一种方法，如检测与罕见疾病相关的基因突变、检测遗传性疾病基因突变等。
PCR技术不仅可以检测基因突变，还可以基于多种不同的PCR技术体系进行SNP（单核苷酸多态性）、CpG 位点甲基化和基因打靶等高通量分子标记分析。
snp array检测原理
snp array检测原理
snp（single nucleotide polymorphism）array是一种用于检测基
因组中单核苷酸多态性的技术。
其基本原理是通过比较个体之间的DNA序列差异来检测特定的单核苷酸变异。
首先，对待检测的基因组进行DNA提取，并产生大量的
DNA片段。
然后，使用PCR（聚合酶链反应）扩增这些DNA 片段，以增加其数量。
接下来，使用snp array芯片来检测这些扩增的DNA片段中的SNP位点。
snp array芯片上包含了大量已知的SNP标记位点，每个位点上可能有不同的等位基因。
这些位点上的等位基因可能与特定疾病、特征或药物反应相关。
将扩增的DNA片段与snp array芯片上的探针进行杂交反应。
探针与芯片上的位点上的目标DNA序列互补配对。
如果样品
中的DNA序列与探针上的序列完全匹配，就会发生探针与目
标DNA的特异性结合。
然后，通过检测和分析探针与目标DNA的配对情况，来确定
待检测的基因组中的SNP位点的等位基因情况。
这可以通过
测量芯片上的标记物的荧光强度来实现。
不同的等位基因可能具有不同的荧光信号。
最后，通过比较待测个体之间的SNP位点的等位基因组合，
可以检测到个体之间的遗传差异。
这些差异可能与疾病易感性、药物反应性等相关。
总之，snp array检测原理是利用芯片上的探针与待检测基因组中的DNA序列进行特异性结合，并通过测量芯片上标记物的荧光强度来确定SNP位点的等位基因情况，从而检测个体之间的遗传差异。
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第31卷第2期Vol.31No.2南华大学学报・医学版Journal of Nanhua University (Medical Edition )2003年6月Jun.2003 高保真DNA 聚合酶在SNP 检测中的应用张 佳3,廖端芳3,张 旭,陈琳玲,李 凯(南华大学药物药理研究所,湖南衡阳421001)摘 要:DNA 测序技术,使人类步入了后基因时代;而后基因时代对DNA 序列分析的新要求,尤其是有关单碱基多态性的检测,急需更高效和更特异的分析方法。
作者介绍两种可靠性高且适应性广的单碱基多态性检测新方法。
基于高保真DNA 聚合酶对引物3′末端错配碱基的校正机制,通过标记引物3′末端,配对引物得到带标记信号的产物而不配对的引物则只能得到不含标记信号的产物。
最近,我们新发现高保真DNA 聚合酶具有通过聚合反应非成熟性终止以维持成熟性终产物保真度的能力。
利用3′硫化磷酸修饰的引物,可强化由不配对引物所激发的对聚合反应的终止作用。
3′硫化磷酸修饰与高保真DNA 聚合酶共同形成一种由单碱基多态性调控的分子开关。
这一新的分子开关可与电泳等多种现有的技术联合使用,在分析单一或多个已知S NP 位点时,具有极大的应用价值。
关键词:硫化磷酸引物; 三末端标记引物; 单碱基多态性; 高保真DNA 聚合酶中图分类号:Q31 文献标识码:A 文章编号:1000-2510(2003)02-0128-04Application of DNA Polymerase With 3′Exonuclease in SNP AssayZH ANGJia ,LI AO Duan -fang ,ZH ANG Xu ,et al(Institute o f Pharmacy &Pharmacology ,Nanhua Univer sity ,Hengyang ,Hunan 421001,China )Abstract :T w o assays for S NP analysis were developed based on 3′ex onuclease of DNA polymerase.Proofreading or mismatch ed 2iting by 3′ex onuclease exhibited a reliable discrimination to single base differences ,which is used in terminal labeled allele -specific primer extenstion for S NP assay.In addition to the well -known proofreading mechanism ,we recently revealed a novel “OFF -switch ”effect by which the 3′ex onuclease is attributed to fidelity maintenance in DNA replication.With phosphorothioate -m odified allele -spe 2cific primer ,polymerase with 3′ex onuclease showed a powerful “ON ΠOFF switch ”:matched primer turned on and mismatched primer turned off DNA polymerization.These new methods especially the S NP -operated “ON ΠOFF switch ”have immediate applications in screening single and multiple S NPs.K ey w ords :phosphorothioate -midified primer ; 3′terminal labeled primer ; S NP ; ex o +DNA polymerase基金项目:国家自然科学基金资助(30171084)和国家“973”项目部分资助(G 2000056905).通讯作者:李凯,男,43岁,加拿大sherbrooke 大学药理学博士,主要从事生物技术开发等工作.Email :kaili34@.3此二位作者对本文具有相同贡献,为并列第一作者.1 SNP 检测的意义人类基因组序列测定计划的完成及多个其它物种基因组的完全测序,标志着人类已步入了后基因时代。
就基因序列分析而言,后基因时代的重点已由全基因组序列测定转移到了对基因组中个体遗传差异及物种间遗传差异的比较。
在诸多基因变异中,S NP 是研究基因遗传与变异时一种高效的量化标志。
S NP 既与单基因遗传病相关,也可能与多基因遗传病相关。
S NP 分析,除对疾病预防、用药选择、新药研发、疾病预后等诸多个体化医药学领域具有十分关键的影响,还对农林业、制药业、乃至整个生物学的广泛领域和最基本的遗传与变异等重大课题,具有极大的促进作用。
如通过对S NP 分析,证实了“亚当生于非洲”也即人类起源于非洲的观点。
我国自己克隆的第一个疾病基因———神经性耳聋相关基因G JB3,其致病机理为一种单碱基多态性1。
就数量而论,在人类基因组大约30亿个碱基中,S NP 位点以百万的数量级存在2,而实际上无论是仅仅将S NP 作为快速扫描全基因组的物理标志,还是对全基因组与疾病相关或药物代谢相关的S NP进行选择性扫描,则需要检测的S NP位点进一步从百万级的数量下降至数万或数千个。
当可以从数万个甚至数千个S NP位点而不是从数十亿个碱基序列得到特定研究目的必要信息时,其巨大的科学与经济价值已不言而喻。
因此,生物科技面临着如何快速可靠地对已知S NP位点进行检测。
2 SNP分析现状与为数有限的蛋白质测序和DNA序列分析方法相比,S NP分析的基本方法在数量上已达20余种3,主要的S NP分析方法的原理如下:(1)利用单碱基变化产生新的或消除已有的内切酶识别位点。
(2)利用单碱基变化造成的碱基互补性对引物延伸反应的影响。
(3)利用单碱基变异对核酸分子杂交的影响。
(4)利用单碱基变异对核酸分子在电场中迁移速度的影响。
(5)直接测定单碱基变异对核酸分子量所造成的改变。
种类繁多的S NP分析方法,既反映了研究S NP分析方法在生物学和医学领域所受到的重视程度,也反映出任一单个方法尚无法满足后基因时代对S NP分析的要求。
与S NP生物学意义的研究成果相比,S NP分析方法的研究远落后于时代的要求。
整个生物学界对研发S NP分析方法并不乐观。
目前,无论是找寻新的还是确认已知S NP位点,传统的DNA测序法,仍处于无可替代的地位。
从建立蛋白质测序之后,Sanger等人用了10年左右的时间率先解决了DNA测序技术4。
从DNA测序方法的建立至今,30多年过去了,人类仍在找寻一种简单、快速和可靠的S NP分析方法。
蛋白质测序是对一个由20种氨基酸基本单元构成的复杂体系的还原过程;DNA测序则是对一个由4种脱氧核苷酸基本单元构成的复杂体系的还原过程。
值得指出的是,尽管DNA测序的化学法和酶法同时授予了诺贝尔奖,而人类基因组测序的提前完成,很大程度上得益于荧光标记的双脱氧核苷酸使酶法测序自动化。
在数以百万计的S NP的位点上,多数情况下需要回答的是一个二元性问题,即对待测S NP位点上的碱基进行“非此即彼”的确认过程。
分析S NP要求对二元性问题求解,在技术上难于解析由4单元组成的复杂体系,更难于由20单元组成的复杂体系,对S NP分析的难度,决定了需要更长的时间来解决这一技术。
目前在有关S NP与疾病相关性研究中应用最广的方法为限制性内切酶酶解片段长度多态性,这一方法具有简便、经济和十分可靠的特点,但这一方法的显著弱点是仅能用于研究小部分涉及了限制性内切酶酶解位点变化的S NP,且该类方法难以直接应用于高通量平行分析。
另一类种类繁多且获得广泛应用的S NP检测方法是所谓的碱基特异引物延伸反应,包括双向引物延伸反应,即应用碱基特异性引物与常规的多聚酶链式反应相结合、引物延伸反应与连接酶相结合、引物延伸反应与杂交分析相结合和使用双脱氧核苷酸进行的单碱基延伸反应的方法。
后者主要用于酶反应介导的S NP芯片。
所有这些方法的共同点是使用了无校正功能的DNA聚合酶。
上述不同方法所得的假阴性高低各不相同,但其共用的无校正功能的低保真聚合酶使所有这一类方法具有其结构上的缺陷,即无可避免地产生较高的假阳性。
对单一S NP位点经济、高效、可靠的分析方法的缺乏,严重制约了对S NP进行高通量测定。
除上述利用双脱氧核苷酸进行的单碱基引物延伸原理的S NP芯片外,目前另一种用于实验研究的S NP芯片为采用原位合成法制造的高密度寡核苷酸芯片,由于该合成法仅能提供自由五末端而缺乏用于延伸反应的自由三末端,故这类芯片的工作原理只能是分子杂交。
该S NP芯片利用寡核苷酸与待检测DNA分子间完全互补与在单碱基水平上的不完全互补杂交对热稳定性的影响,以识别待检测分子中的S NP位点。
这一杂交原理的S NP芯片,其误差视所检测S NP的数目而变化,假阳性与假阴性总和可从0.1%至50%左右5,6。
杂交原理的S NP芯片结果不可靠的主要原因是不配对碱基所致自由能变化的差异以及该不配对碱基与所在核酸序列的局部环境相互作用,从而导致杂交二联体热稳定性的不均一。
事实上,要求在同一特定的杂交温度利用单碱基水平不配对以准确识别待测分子中多个不同的S NP位点不但困难重重;而且利用单碱基水平的不完全配对的寡核苷酸探针对杂交稳定性的影响测定单一S NP位点在实际应用时也绝非易事,如T aqMan适时PCR 技术,其对探针设计和反应条件的严格要求在一定程度上反映出杂交原理测定S NP时理论与应用的差距。
3 高保真酶与三末端标记引物延伸反应1968年,Drake等人发现了DNA聚合酶在DNA复制过程中参与了遗传的保真性和控制变异的数量7。
随后的研究确认了高保真酶通过其3′→5′外切酶活性所表现出高效的校正功能,即对错配碱基的切除以提高DNA聚合产物的保真性8。
生物体包括人体已发现的多种聚合酶,大部分属于含有3′→5′外切酶活性的具有校正功能的高保真酶。
生命选择了高保真聚合酶和生命离不开高保真聚合酶这一自然存在,具有很大的启发性。
从1999年开始,我们在理论上和实验中反复探索这样两个问题:即是否可以利用高保真聚合酶进行S NP检测?以及如何利用高保真聚合酶的特性来实现对S NP的测定?在未对高、低保真聚合酶介导的三末端碱基特异性引物延伸反应进行系统的热力学分析之前,有无引物延伸产物,被认为是低保真聚合酶区别于高保真酶之所在,而事实上,这一有无产物的效果,仅仅是由于不配对引物对退火状态的影响所致,而与聚合酶有无校正功能无关。