REAL-TIMEPCR方法测定转基因小麦中外源基因拷贝数

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利用实时荧光定量PCR法检测转基因水稻外源基因拷贝数的研究

利用实时荧光定量ＰＣＲ法检测转基因水稻外源基因拷贝数的研究摘要：转基因植物中外源基因拷贝数是影响目的基因表达水平和遗传稳定性的重要因素，因此外源基因拷贝数的检测成为转基因研究的关键，利用高通量、快速、灵敏的SYBR Grcen I荧光定量实时PCR法，检测了转大麦烟酰胺合成酶基因(NAS1)水稻中外源基因拷贝数，以蔗糖磷酸合成酶基因(SPS)作为水稻的内源参照基因，通过梯度稀释法，分别获得了NA51和SPS基因的Ct值与起始模板数的相关性标准曲线，相关系数分别为0.99976和0.99571，相关性高，通过目的基因NASl和水稻內源参照基因SPS起始模板数的比较，获得了目的基因在转基因水稻中的拷贝数，在8株转基因株系中，1株为假阳性，1株拷贝数为1，3株拷贝数为2，其余3株拷贝数分别为3、4和7，而阴性对照拷贝数为0，这种方法快速、简便、准确，可以满足转基因育种工作中对后代优良株系的选择。

关键词：SYBR Creen I实时荧光定量PCR；烟酰胺合成酶基因；转基因水稻；拷贝数植物遗传转化是作物改良和新基因功能鉴定的常用方法，但在转基因植物中外源基因拷贝数常影响目的基因的表达水平和遗传稳定性，因此，转基因研究中关键的一步就是检测外源基因的拷贝数，以筛选出拷贝数少或单拷贝的转基因植株供进一步的研究或育种利用，传统的转基因植株拷贝数检测主要是Southern 杂交法，但该方法工作量大，需要的DNA材料较多，费时费力，并且经常要用到放射性同位素等具有潜在危险的药品，近年来，利用高通量、快速、灵敏的定量PCR方法检测转基因拷贝数逐渐受到科研人员的青睐。

SYBR Green I实时荧光定量PCR法是在PCR反应体系中加入SYBR Green I 荧光染料，该染料能够结合于所有dsDNA双螺旋小沟区域并具有受激发产生绿色荧光的能力，当它与PCR合成的双链DNA结合，在激发光照射下产生荧光，由于荧光信号强度的增加与PCR产物的增加完全同步，因此通过对PCR反应进程中的荧光信号强度进行实时检测，就可间接的获得PCR扩增数据，根据Ct(cycle thresholds)值与起始模板数的对数值成反比线性关系的原理，制作标准曲线，获得Ct值与起始模板数的相关性方程，将样品的Ct值代人该方程就可获得目的基因的起始模板数，通过与水稻内源参照基因起始模板数的比较，就可知道基因组中该外源基因拷贝数，内源参照基因一般选择拷贝数少，同一物种内的不同生态类型间具有稳定的序列结构和拷贝数的一类基因，Ding等通过对水稻、小麦、玉米、大麦等十几种作物的研究发现，蔗糖磷酸合成酶(sucrose phosphate synthase，SPS)基因是水稻特有的基因，并且为单拷贝，可以作为水稻的内源参照基因。

应用real-time PCR定量检测小麦条锈菌潜伏侵染量方法的建立

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Ａｂｔａｔｓｒｃ：Ｗｈａｓｉｕｔａｓｄｂｕｃｉｓｉｏｍｓｓｎｆｈｏｔｍｐｒｎｗｅｔｉａｅｈ— ｅｔｔｐｒｓｃｕｅｙＰｃｉａｔｉｒｉｉｏｅｅｍｓｉｏｔｔｈａｄｓｓｓｎＣｉｒｅｎｒｆｏｔａｅｉ
植物病理学报
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ｓｑｅｃｆｌｔｂｌｅｅｔｅｅｔｈａｈｇｎｅｉｉｇｉｅｔｅｖｓｌｔｎｆｃｉｎｐｃｆｉｆｔｅｅｕｎｅｏ＿— ｉｎｇｎｏｄｔｃｅｐｔｏｅｘｓｎｎｗｈａａｅａａｅｔｉｅｔ．ＳｅｉｃｔｏＢｕｉｔｔｌｎｏｉｙｈ

real-time pcr原理

实时聚合酶链式反应（Real-time PCR）是一种分子生物学技术，用于定量测量DNA或RNA的含量。

它可以用于检测、量化和分析特定基因的表达水平，也可以用于检测病原体、基因突变和许多其他应用。

下面是实时PCR的基本原理：1. **选择性扩增目标DNA/RNA**：实时PCR的第一步是选择性扩增目标DNA或RNA片段。

这通常涉及到设计一对特异性引物（引导片段）来诱导DNA合成。

引物是两个短的DNA片段，它们会结合到目标序列的两端。

2. **荧光探针**：为了实时检测PCR反应的进展，一种叫做荧光探针的特殊DNA分子被引入反应混合物中。

荧光探针是一个含有荧光染料的短链DNA片段，它的一端与一个荧光染料分子紧密相连，另一端与一个荧光阻尼器分子相连。

在初始PCR反应中，这两个分子紧密靠在一起，从而抑制了荧光的发射。

3. **PCR反应**：PCR反应开始后，DNA引物将目标序列进行扩增。

如果目标序列存在，PCR会不断复制它，导致DNA量指数级增加。

4. **荧光信号检测**：在每个PCR循环的末尾，荧光探针靠近的情况会改变。

当PCR过程中荧光探针结合到目标序列时，它被降解，荧光染料与阻尼器分离，导致荧光信号的释放。

荧光信号的强度与PCR反应中目标序列的数量成正比。

5. **实时监测**：荧光信号会在PCR过程中实时检测和记录。

这种监测可以通过特殊的仪器完成，该仪器测量荧光信号的强度并将其显示在一个图表中。

荧光信号的强度与PCR反应中目标序列的初始数量成比例。

因此，通过比较样本中的荧光信号与标准曲线或对照样本，可以定量测量目标DNA或RNA的含量。

总的来说，实时PCR允许科学家在PCR反应进行的同时实时监测和记录DNA或RNA的数量，因此它是一种非常有用的技术，用于定量和检测基因表达、基因变异、病原体等多种生物学研究和诊断应用中。

利用微滴数字PCR分析转基因生物外源基因拷贝数_姜羽

1 材料与方法
1.1 材料与试剂转基因水稻(Oryza sativa)T1c-19 材料由华中农
示意图。 1.3.3 引物和探针
实验中涉及的定性、实时荧光定量 PCR 扩增引物和探针通过软件 primer express v2.0 设计，由
业大学生命科学技术学院提供。转人乳铁蛋白基 Invitrogen 公司合成，具体序列见表 1。其中，转基因(human lactoferrin, HLF)山羊(Capra hircus)134 血因水稻 T1c-19 的外源基因杀虫晶体蛋白基因 (in-
Southern blot 和实时荧光定量 PCR 是常用的两种多功能酶标仪 (BioTek, 美国)。 QX100TM Droplet
外源基因拷贝数分析技术, 已广泛用于外源基因拷 DigitalTM PCR 系统(Bio-Rad, 美国, 包括微滴生成仪
贝数分析。但这两种方法也存在一定缺陷。例如，和微滴读取仪)。 ABI 7900 定量 PCR 仪 (Applied
Abstract Droplet digital PCR(ddPCR) is a new absolutely quantitative method based on Poisson distribution, which shows huge potential applicability in accurate quantification of nucleic acid. Herein, we developed the ddPCR method to evaluate the exogenous gene copy number in genetically modified organisms (GMOs) as the example from genetically modified rice(Oryza sativa) T1c-19 and transgenic human lactoferrin gene goat(Capra hircus) 134 examples, and the results was also compared with those from quantitative Realtime PCR (qRT-PCR) and Southern blot. The results from qRT-PCR and ddPCR for cry1C* in T1c-19 were comparatively unanimous (~2 copies), while 1 copy was reported in literatures by Southern blot. The copy number from ddPCR was higher than that of qRT- PCR for bar gene in T1c- 19, 2.09 and 1.51 copies respectively. Same result (~1 copy) was obtained from qRT- PCR and ddPCR for HLF gene in goat 134. Therefore, the ddPCR was well developed as one novel method for estimating transgene copy number with high accuracy, and which may be widely used in the exogenous genes copy number analysis in GMOs. Keywords Droplet digital PCR(ddPCR), Genetically modified organisms(GMOs), Exogenous gene, Copy number

real-time pcr名词解释

real-time pcr名词解释
外文名【Real-time Quantitative polymerase chain reaction】
中文名【实时荧光定量多聚核苷酸链式反应】
中文简称【实时荧光定量PCR】
外文简称【RT PCR】
【实时荧光定量PCR技术】，是指在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。

实时荧光定量PCR （Quantitative Real-time PCR）是一种在DNA扩增反应中，以荧光化学物质测每次聚合酶链式反应（PCR）循环后产物总量的方法。

通过内参或者外参法对待测样品中的特定DNA序列进行定量分析的方法。

·
Real-timePCR是在PCR扩增过程中，通过荧光信号，对PCR进程进行实时检测。

由于在PCR扩增的指数时期，模板的Ct值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

【技术原理】
将标记有荧光素的Taqman探针与模板DNA混合后，完成高温变性，低温复性，适温延伸的热循环，并遵守聚合酶链反应规律，与模板DNA互补配对的Taqman 探针被切断，荧光素游离于反应体系中，在特定光激发下发出荧光，随着循环次数的增加，被扩增的目的基因片段呈指数规律增长，通过实时检测与之对应的随扩增而变化荧光信号强度，求得Ct值，同时利用数个已知模板浓度的标准品作对照，即可得出待测标本目的基因的拷贝数。

Real-timePCR实验原理与技术

实时荧光定量PCR技术原理
01
在实时荧光定量PCR反应中， DNA模板被扩增时，与荧光探针结合，产生荧光信号。
02
随着DNA的扩增，荧光信号逐渐增强，通过对荧光信号的实时监测和分析，可以计算出 DNA的起始浓度。
03
通过标准曲线或内参基因的校准，可以将起始浓度转化为目标基因的表达量或基因拷贝数。
实时监测荧光信号
实时监测荧光信号，确保PCR产物在指数扩增阶段被检测到。
标准化实验流程
建立标准化实验流程，确保实验结果的可靠性和可重复性。
未来展望
新技术应用
01
随着新技术的不断发展，如数字PCR、微流控PCR等，Real-
time PCR技术将得到进一步优化。
高通量检测
02
通过多重PCR和高通量检测平台，实现大规模样本的快速检测。
03
Real-time PCR 实验数据分析
数据收集与整理
数据收集
在实时PCR实验中，数据收集通常涉及记录每个循环的荧光信号强度。这些数据通常以图表形式表示，其中横轴表示循环数，纵轴表示荧光信号强度。
数据整理
收集到的原始数据需要经过整理，包括去噪、去除异常值和标准化等步骤，以确保数据分析的准确性。
自动化与智能化
03
实现Real-time PCR的自动化和智能化，提高实验效率，减少人
为误差。
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real-timepcr实验原理与技术
contents
目录
• Real-time PCR 实验原理 • Real-time PCR 实验技术 • Real-time PCR 实验数据分析 • Real-time PCR 实验应用 • Real-time PCR 实验注意事项与优化建

Real-time_PCR(从原理到实验方法及数据分析)

total RNA total RNA
cDNA
cDNA
cDNA
cDNA
相对定量：内对照 Endogenous Control
用以标准化样品操作
time t =0 t=12 t=24 t=48
total RNA total RNA
total RNA total RNA
cDNA
cDNA
cDNA
cDNA
线性图谱
对数图谱
基线
阈值
Ct值
[DNA]0
什么是阈值？
1. 基线（空白）信号的产生是由于测量的偶然误差引起的。 2. 偶然误差的结果满足对数分布。 3. 阈值 = 基线（背景）信号标准偏差 x 10。 4. 由于测量的偶然误差而导致测得的荧光信号大于阈值的概率小于10－5。 5. 当荧光信号大于阈值时，可以肯定是由于PCR的扩增使得荧光强度得以测量。
突变的存在形式
目标序列的有无
等位基因分型
• 定义：等位基因分型(AD)分析是一种多重（每个反应包括一个以上的引物和探针对）、终点（在PCR过程的终点收集数据）分析实验，用于检测某个核酸序列的变异。每个反应中包括两个引物和探针对，允许在一个目标模板序列的单核苷酸多态性（SNP）位点上出现两个可能的变异基因型。目标序列的实际量不确定。
1. 2. 3. 4. 5. 6. Transcription Hairpin release in the nucleus Export to cytoplasm Dicer processing Strand selection by RISC Translational repression
*mature active strand
等位基因自动识别软件

pcr和real-pcr检测技术及方法

核酸提取试剂盒
国家/项目标准
文献报道
PCR kit
设计合成
Taq酶 dNTP 缓冲液 Mg离子
特异性引物
国家/项目标准文献报道
设计合成
引物设计
1. 引物的长度：配对引物的长度一般在15-30bp之间比较合适。
➢ 尽可能使用两条引物的Tm值相同（最好相差不要超过 5℃） ➢ Tm值的计算：一般的公式：Tm = 4 (G+C) + 2(A+T)
琼脂糖电泳原理
琼脂糖凝胶电泳步骤
配胶
点样
电泳
胶图分析
成像拍照
配胶
✓ 按所要分离的DNA分子的大小，称取适量的琼脂糖粉末，放入锥形瓶，加入适量0.5×TBE电泳缓冲液
✓ 置微波炉内加热摇匀至完全溶化呈透明状，适当冷却后，加入核酸染料（例EB或其他替代产品），混匀后，倒入胶托模具内
✓ 待胶完全冷凝后放入电泳槽，电泳槽内的缓冲液没过胶面
引物自身不能配对，否则易形成约两个引物长度的引物二聚体；
引物二聚体
发夹结构
Primer Premier 5.0
PCR体系配置
引物合成稀释
➢ 冻干粉末，开启前10000rpm离心5min
成分
➢ 小心开盖，防止粉末喷出
➢ 储存液配置：用Rnase Free Water溶解，加水量为10×总摩尔数，充分混匀，此时为100pmol/μl，即100μM（例如：合成 9.5nmol，则加水量为10×9.5=95μL）
2. 引物的GC%含量：一般为40%-60%。上下游引物的GC含量不能相差太大。 3. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，
否则容易导致错配。 4. 引物3’端的末位碱基避开密码子的第3位，且最好不选择A 5. 引物的5′端可以修饰，而3′端不可修饰。 6. 引物无回文对称结构，否则会形成发夹结构；

Real Time PCR 检测方法原理

Real Time PCR 检测方法原理■嵌合荧光染料检测法(SYBR Green I)SYBR® Green I是荧光定量PCR最常用的DNA结合染料，能与双链DNA非特异性结合，结合后发出荧光，可以通过检测反应体系中的SYBR® Green I 荧光强度，达到检测PCR产物扩增量的目的。

通过PCR反应生成双链DNA，SYBR® Green I与双链DNA结合发出荧光，通过检测荧光不但可以检测反应体系中的DNA扩增量，同时还能测定扩增产物的DNA融解温度。

具体原理见下图。

嵌合荧光染料法原理图■双标记荧光探针法双标记荧光探针法是使用5’端带有荧光物质（如：FAM等)，3’端带有淬灭物质（如:TAMRA等）的双标记荧光探针进行荧光检测的方法。

当探针完整时，5’端的荧光物质受到3’端的淬灭物质的制约，不能发出荧光。

而当双标记荧光探针被分解后，5’端的荧光物质便会游离出来，发出荧光。

当PCR反应液中加入荧光探针后，在PCR反应的退火过程中，荧光探针便会和模板杂交。

进一步在PCR反应的延伸过程中，Taq DNA聚合酶的5’→3’Exonuclease活性可以分解与模板杂交的荧光探针，游离荧光物质发出荧光。

通过检测反应体系中的荧光强度，可以达到检测PCR产物扩增量的目的。

具体原理见下图。

双标记荧光探针法原理图■ CycleavePCR法原理CycleavePCR法是由RNA和DNA构成的杂合Cycling 探针与RNase H组合使用的高灵敏度检测方法，能够高效率地检出目的基因。

Cycling 探针内部夹有RNA部分，一端标记荧光物质，另一端标记淬灭物质，当探针处于完整状态时，由于荧光淬灭作用抑制荧光物质发出荧光，但当探针与扩增产物中的互补序列杂交后，RNase H在RNA部分将探针切断，淬灭抑制作用解除，荧光物质发出荧光，通过测定荧光强度，能够实时监测扩增产物量。

如果探针的RNA部分与模板不匹配，RNase H就不能在RNA部分将探针切断，所以该检出方法是一种即使一碱基不同也能识别的高特异性检出方法，特别适合于SNP解析。

实时荧光定量PCR方法快速检测转基因大豆

实时荧光定量PCR方法快速检测转基因大豆朱德斌;邢晓波【摘要】A real-time fluorescence quantitative PCR method was developed to detect genetically modified ( GM ) soybean using SYBR Green I,a double-stranded DNA-selective fluorescent dye. Special primers were used to amplify 35S promoter that was often used in GM soybeans. The fluorescence of SYBR Green I was used to monitor the quantity of PCR product. The results show that the detection limit for 35S promoter is 0. 005 nmol/L and the linear range is more than three orders of magnitude. The GM soybean and the non-GM soybean can be clearly discriminated. Thus, the method may become a convenient tool for daily GM food detection due to its rapidness, simplicity, sensitivity, safety, high throughput and low cost.%针对转基因大豆中普遍含有的35S启动子进行引物设计,以双链DNA染料SYBR Green Ⅰ为荧光标记物,利用实时荧光定量PCR方法对大豆样品进行检测.该法检测转基因大豆的检测低限为0.005 nmol/L的35S启动子,线性范围达3个数量级,可快速区分转基因大豆和非转基因大豆,具有快速、简便、灵敏、安全、高通量、低成本等优点,可推广用于转基因植物产品的快速定量检测.【期刊名称】《激光生物学报》【年(卷),期】2012(021)003【总页数】4页(P279-282)【关键词】实时荧光定量PCR;转基因大豆;35S启动子【作者】朱德斌;邢晓波【作者单位】华南师范大学生物光子学研究院激光生命科学研究所、暨激光生命科学教育部重点实验室,广东广州510631;华南师范大学生物光子学研究院激光生命科学研究所、暨激光生命科学教育部重点实验室,广东广州510631【正文语种】中文【中图分类】Q503;Q78随着近年来人们对转基因产品(genetically modified organism，GMO)安全性的日益重视，GMO标识已成为各国GMO监管的重要部分。

实时定量PCR法检测转基因CHO细胞中外源抗体轻重链基因的拷贝数

中外源抗体轻链和重链基因的拷贝数，可用于外源抗体基因在ＣＨＯ细胞中的遗传稳定性研究，也为高表达细胞株
的获得提供了一种检测方法。
关键词：实时定量ＰＣＲ； ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ基因；ＣＨＯ细胞；单克隆抗体；轻链；重链；基因拷贝数
中图分类号：Ｑ７８９Ｒ３９２ — ３３文献标识码：Ａ文章编号：１００４－５５０３（２０１５）０５ — ０５２３ — ０５
ＸＵＥＪｉａｎ — ｈｕａ，ＨＵＡＮＧＸｕｅ — ｙｉ，ＸＵＳｈｕｉ — ｑｉｎｇ
ＤｅｐａｒｔｍｅｎｔｏｆＵｐｓｔｒｅａｍＰｒｏｃｅｓｓ，ＧｅｎｏｒＢｉｏｐｈａｒｍａＣｏ．，Ｌｔｄ．，Ｓｈａｎｇｈａｉ２０１２０３，Ｃｈｉｎａ
ａｎｄｈｅａｖｙｃｈａｉｎｇｅｎｅｓｏｆｆｏｒｅｉｇｎａｎｔｉｂｏｄｙｉｎｔｒａｎｓｇｅｎｉｃＣＨＯｃｅｌｌｓ．ＭｅｔｈｏｄｓＴｈｅｓｔａｎｄａｒｄｃｕｒｖｅｓｏｆｌｉｇｈｔａｎｄｈｅａｖｙｃｈａｉｎｇｅｎｅｓｗｅｒｅｇｅｎｅｒａｔｅｄｗｉｔｈｔｈｅｓｔａｎｄａｒｄｐｌａｓｍｉｄｓｃｏｎｔａｉｎｉｎｇｌｉｇｈｔａｎｄｈｅａｖｙｃｈａｉｎｇｅｎｅｓｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡｏｆＣＨＯｃｅｌｌｓｔｒａｎｓｆｅｃｔｅｄｗｉｔｈｌｉｇｈｔｃｈａｉｎａｎｄｈｅａｖｙｃｈａｉｎｇｅｎｅｓｗｅｒｅｅｘｔｒａｃｔｅｄａｎｄａｎａｌｙｚｅｄｂｙｒｅａｌ・・ｔｉｍｅｑｕａｎｔｉｔａ — ・ｔｉｖｅＰＣＲ．Ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｎｕｍｂｅｒｏｆｓｉｎｇｌｅｃｏｐｙｇｅｎｅｉｎ１０ｎｇＣＨＯｇｅｎｏｍｉｃＤＮＡ，ｔｈｅｃｏｐｙｎｕｍｂｅｒｏｆｌｉｇｈｔｃｈａｉｎａｎｄ

Real-time PCR数据分析

由于Real-time qPCR 的众多优点，现在已是生命科学领域的一项常规技术。

越来越多的研究文章中涉及RT-PCR 的实验，也基本上被real-time qPCR 所代替。

由于real-time aPCR 输出的数据不同于常规的PCR 电泳检测，不少没有做过real-time qPCR 的研究者往往感到高深莫测，不知从何入手；甚至一些做过次实验的研究者也会对数据处理分析感到迷惑，不知所措。

本文就从real-time qPCR 的发展史说起，包括real-time qPCR 的原理，实验设计，实际操作，数据分析，常见问题解答五个方面，手把手教你从各个方面了解real-time qPCR，彻底的从菜鸟到高手！一、Real-time qPCR 发展史Real-time qPCR 就是在PCR 扩增过程中，通过荧光信号，对PCR 进程进行实时检测。

由于在PCR 扩增的指数时期，模板的Ct 值和该模板的起始拷贝数存在线性关系，所以成为定量的依据。

由于常规的PCR 的缺点，real-time qPCR 由于其操作简便，灵敏度高，重复性好等优点发展非常迅速。

现在已经涉及到生命科学研究的各个领域，比如基因的差异表达分析，SNP 检测，等位基因的检测，药物开辟，临床诊断，转基因研究等。

在Real-time qPCR 技术的发展过程中，定量PCR 仪的发展起了至关重要的作用。

1995 年，美国PE 公司(已经并入Invitrogen 公司)成功研制了Taqman 技术，1996 年推出了首台荧光定量PCR 检测系统，通过检测每一个循环的荧光强度，通过Ct 值进行数据分析。

从而荧光定量PCR 获得广泛应用。

现在的定量PCR 仪有ABI7000、7300、7500，7700、7900HT、StepOnePlusTM、StepOneTM、PRISM@StepOneTM 系列；BIO-RAD 的CFX96、iCycler iQ5@、MyiQ@、MJ Research Chromo4TM Opticon 系列；Stratagene MxTM 系列；Roche LightCycler@ 系列；Eppendorf Masercycler@；Corbett Rotor-GeneTM；Cepheid SmartCycler@和BIOER 的LineGene 系列。

定时定量pcr的名词解释

定时定量pcr的名词解释引言：定时定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）是一种生物学实验技术，被广泛应用于基因表达、病原体检测、遗传变异分析等领域。

本文将对定时定量PCR进行名词解释，介绍其原理、应用范围和优势。

1. 定时定量PCR的原理定时定量PCR是基于聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）的一种改进技术。

PCR是一种能够迅速复制DNA的方法，通过引物和DNA聚合酶的配合作用，使DNA模板在不断经历多轮的加热与退火过程，最终产生大量的复制片段。

定时定量PCR借助特殊的荧光技术，实现了PCR反应的实时监测和定量分析。

在反应过程中，荧光信号与DNA量的增加成正比，可通过荧光信号的变化来测定反应过程中DNA的扩增量。

2. 定时定量PCR的应用范围2.1 基因表达研究定时定量PCR广泛应用于基因表达研究中，可以测定不同条件下基因的表达水平，了解基因调控机制。

研究人员可通过定时定量PCR分析特定基因在细胞、组织或器官中的表达差异，从而揭示与疾病发生发展相关的分子机制。

2.2 病原体检测定时定量PCR在病原体检测中的应用越来越广泛。

通过设计特异性引物和探针，可以快速、准确地检测细菌、病毒和寄生虫等病原体。

定时定量PCR的高灵敏度和高特异性，使其成为常用的病原体检测方法，为临床诊断和疾病监测提供了强有力的工具。

2.3 遗传变异分析定时定量PCR还可用于遗传变异分析，比如SNP（single nucleotide polymorphism）分型和突变检测。

通过设计特异性引物和探针，可以准确捕获某一具体位点的变异，并进行定量分析。

这种方法在遗传疾病诊断、个体化药物治疗和DNA亲子鉴定等领域具有重要意义。

3. 定时定量PCR的优势3.1 高灵敏度和高特异性定时定量PCR可以精确测定样品中含有的目标DNA或RNA分子的数量，其高灵敏度和高特异性使其成为许多实验室首选的技术。

一种定量PCR检测转基因细胞中外源基因拷贝数的方法[发明专利]

(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201510218245.6(22)申请日 2015.04.30(71)申请人嘉和生物药业有限公司地址 201203 上海市浦东新区张衡路1690号3号楼1-4层(72)发明人薛建华　黄雪怡　徐水清　(74)专利代理机构上海天翔知识产权代理有限公司 31224代理人高迷想(51)Int.Cl.C12Q 1/68(2006.01)(54)发明名称一种定量PCR检测转基因细胞中外源基因拷贝数的方法(57)摘要本发明涉及一种转基因动物细胞CHO中抗体分子的轻重链基因拷贝数的定量检测方法，采用SYBR-Green定量PCR方法，实现对抗体分子的轻链基因拷贝数和重链基因拷贝数进行定量、准确、高通量的检测。

本发明的方法检测灵敏度高且线性范围宽、结果可靠，可用于研究抗体细胞株的稳定性，筛选出稳定的高表达的工程化细胞株。

权利要求书2页说明书10页序列表3页附图4页CN 106191216 A 2016.12.07C N 106191216A1.一种SYBR-Green定量PCR方法检测转基因细胞中抗体重链基因拷贝数的方法，其特征在于，所采用的正向引物和反向引物分别是SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的DNA分子。

2.如权利要求1所述的SYBR-Green定量PCR方法检测转基因细胞中重链基因拷贝数的方法，其特征在于，具体包括如下步骤：a)合成针对抗体重链基因的特异性正向引物JHc-1F和特异性反向引物JHc-1R，以完整抗体的重链DNA作为模板进行普通PCR扩增，制备出带有重链片段的质粒DNA，从而制备重链质粒DNA标准品；所述JHc-1F的序列如SEQ ID No.7，所述JHc-1R的序列如SEQ ID No.8所示；b)以SEQ ID No.1所示的正向引物和SEQ ID No.2所示的反向引物、以步骤a)中的带有重链片段的质粒DNA标准品作为模板进行定量PCR反应，计算质粒DNA的拷贝数，建立PCR反应标准曲线；c)提取转染抗体分子的动物细胞株的基因组DNA和未转染抗体分子的动物细胞株的基因组DNA作为模板，采用SEQ ID No.1和SEQ ID No.2所示的正向引物和反应引物，进行定量PCR反应，同时用无菌超纯水作为空白对照；定量PCR反应结束后获得Ct值，并进行溶解曲线的试验，根据Ct值和步骤b)中的标准曲线计算动物细胞中抗体分子的重链基因拷贝数；上述步骤b)和c)中，在进行定量PCR扩增时，其定量PCR反应的总体积是30μl：SYBR Green PCR Mix 15μl，10μM浓度的正向引物0.5μl，10μM浓度的反向引物0.5μl，DNA 模板10μl，无菌超纯水，4μl；其定量PCR反应条件为：先95℃10min，随后依次95℃30s、60℃30s、72℃30s，共40个循环。

小麦TaAGL7-N基因的Real-time PCR检测

小麦TaAGL7-N基因的Real-time PCR检测李红霞;张战凤【期刊名称】《西北农业学报》【年(卷),期】2012(021)012【摘要】为了建立SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量PCR方法,测定TaAGL7-N 基因在小麦不同器官的表达水平.采用RT-PCR扩增小麦TaAGL7-N基因片段,建立SYBR Green Ⅰ荧光定量PCR标准曲线,以18SrRNA为内参,检测小麦不同器官中的TaAGL7-N表达水平.结果表明,标准曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系,熔解曲线分别在82.8～83.6℃和83.1～85.6℃各仅有一个单峰.成功建立SYBR Green Ⅰ荧光染料实时定量PCR法,该方法具有特异度和敏感度高、稳定性好的特点,可用于定量测定小麦中TaAGL7-N的表达水平.【总页数】5页(P48-52)【作者】李红霞;张战凤【作者单位】西北农林科技大学农学院,陕西杨凌712100;西北农林科技大学植物保护学院,陕西杨凌712100【正文语种】中文【中图分类】S512.1【相关文献】1.转基因小麦根际土壤镰刀菌Real-time QPCR方法的建立及应用 [J], 王秀宇;林凡云;吴季荣;曹欢;史建荣2.转基因水稻多重PCR和Real-time PCR定性检测中的问题与策略 [J], 仇娟3.应用real-time PCR 定量检测土壤中小麦纹枯病菌方法的建立 [J], 徐娜娜;李鹏昌;于金凤4.Real-time PCR、焦磷酸测序及基因芯片快速检测ALDH2∗2基因多态性 [J], 王秀芳;张艳;廖映红;吴金虎;邓艾平;蔡毅5.通用引物多重PCR和Real-time PCR检测复合性状转基因玉米Bt11×GA21的转化事件特异性成分 [J], 许文涛;元延芳;罗云波;白卫滨;张春娇;黄昆仑;郭天笑因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

SYBR Green实时定量PCR检测转基因大豆中外源基因拷贝数

SYBR Green实时定量PCR检测转基因大豆中外源基因拷贝数冀志庚;高学军;敖金霞;张明辉;霍楠【期刊名称】《东北农业大学学报》【年(卷),期】2011(042)010【摘要】采用SYBR Green I real-time PCR方法检测转基因大豆中外源基因35S 边界基因的拷贝数,以大豆凝集素基因(Lectin)作为内参照基因,以转基因大豆基因组DNA为内参照基因标准品,初始浓度为0.43μg·μL-1,进行5倍梯度稀释得到内参照基因CT值与起始模板量的相关性标准曲线:y=-2.9915x+22.3321,R2=0.996；以含35S边界序列的质粒DNA为目的基因为标准品,初始浓度为0.64μg· μL-1,同样进行5倍梯度稀释,建立目的基因CT与起始模板量的相关性标准曲线:y=-3.4021x+ 17.7219,R2=0.999.通过SYBR Green I real-time PCR获得样本中目的基因和内参基因的CT值,将CT值分别代入标准曲线计算该样本中内参基因和目的基因起始模板量,目的基因与内参基因起始模板量比值即是目的基因在该转基因中的拷贝数.计算结果为4份样品中,2个拷贝的1个,3个拷贝的3个.【总页数】5页(P11-15)【作者】冀志庚;高学军;敖金霞;张明辉;霍楠【作者单位】东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,哈尔滨150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,哈尔滨150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,哈尔滨150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,哈尔滨150030;东北农业大学生命科学与生物技术研究中心,哈尔滨150030【正文语种】中文【中图分类】S565.1;Q78【相关文献】1.利用SYBR Green实时定量PCR法检测转基因植物外源基因的拷贝数 [J], 裘劼人;许颖;喻富根2.利用SYBR Green实时定量PCR法检测转基因植物外源基因的拷贝数 [J], 裘劼人;许颖;喻富根3.SYBR Green实时定量PCR检测外源基因拷贝数 [J], 庄强;钱程;刘立4.人4型腺病毒拷贝数SYBR Green Ⅰ实时定量PCR检测方法的建立 [J], 张文宁;王芃;周建光;王健;秦崇涛;李宗;李山虎5.巢式PCR和SYBR Green Ⅰ实时PCR检测转基因大豆方法的研究 [J], 彭新凯;宋涛平;谭舸;陈娜;胡朝晖;杨丽霞因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

实时荧光定量PCR检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数

在毕赤酵母中，外源基因能够在基因组的同一位点进行多次同源重组，从而插入多个拷贝的外源基因。

而高拷贝的外源基因通常会导致其在毕赤酵母中的高表达［1］。

比较外源基因在毕赤酵母中表达量的差异时，如比较不同启动子的转录活性时，往往需要检测外源基因的拷贝数，筛选单拷贝整合外源基因的毕赤酵母菌株。

目前，在毕赤酵母的研究中，Southern blot 是运用最多的检测外源基因拷贝数的方法［2］。

但该方法需要大量的DNA ，工作量大，操作要求高。

近年来，荧光定量PCR 技术不断成熟，并已开始用于检测外源基因的拷贝数，如在转基因植物研究领域，已利用该项技术检测外源基因的拷贝数［3］。

但相关文献报道较少。

本文以毕赤酵母中的看家基因GAP （Glycer －aldehyde -3-phosphate dehydrogenase ）为内参，绿色荧光蛋白（GFP ）基因为报告基因，采用双标准曲线实时荧光定量PCR 法，建立了一种测定毕赤酵母中外源基因拷贝数的方法，现报道如下。

1.材料与方法1.1菌株及质粒大肠杆菌Top10、毕赤酵母GS115及质粒pPIC3.5K 均购自Invitrogen 公司；含GFP 基因的毕赤酵母GS115-KDR -P 菌株由本室保存；pMD19-T Simple 载体购自TaKaRa 公司。

1.2主要试剂及仪器Premix Taq （Ex Taq TM Version ）和连接试剂DNA作者单位：华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室（上海200237）.通讯作者：周祥山，E -mail ：xszhou@中国图书分类号Q789文献标识码A文章编号1004-5503（2009）12-1236-05【实验技术】实时荧光定量PCR 检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数宣姚吉周祥山张元兴【摘要】目的建立实时荧光定量PCR 检测毕赤酵母基因组中外源基因拷贝数的方法。

方法采用双标准曲线法，分别利用含有GAP 基因和绿色荧光蛋白（GFP ）基因的质粒，进行实时荧光定量PCR 反应，建立标准曲线。

实时荧光PCR技术检测过敏原小麦的研究

实时荧光PCR技术检测过敏原小麦的研究摘要:采用实时荧光PCR技术检测过敏原小麦成分｡结果表明,采用小麦管家基因GAG56D和Wx012基因的特异性检测引物和探针进行检测时,26种样品经实时PCR扩增,只有小麦产生阳性的荧光信号,其余样品均不产生荧光信号｡灵敏度实验结果表明,该方法对小麦过敏原基因的检测灵敏度较高,可达到 1.0 mg/kg,符合痕量检测要求｡关键词:小麦;实时PCR;过敏原检测Detecting Sensitinogen Wheat in Food by Real-time PCRAbstract: To identify sensitinogen wheat in food, a real-time fluorescent PCR assay was performed. The result showed that the primers and probe of wheat house-keeping genes GAG56D and Wx012 could specifically identify wheat within 26 kinds of sample. Sensitivity results showed that 1.0 mg/kg of wheat in food could be detected, and meet the need of trace detection.Key words: wheat; real-time PCR; sensitinogen detection近年来,食物过敏的发生率正继续增加,过敏性疾病发病率在全球呈逐年上升趋势,发达国家超过20%的人受过敏性疾病的困扰[1]｡过敏原又称变态反应原,是指能够使人发生过敏的抗原｡美国和欧盟从2007年开始执行新的食品过敏原标签法规,法规分别要求生产企业明确标明其产品中是否含有8大类和12种主要的食品过敏原,包括小麦､大豆､花生､芹菜､芥末､芝麻和坚果,畜禽产品,水产品等｡根据小麦过敏原以及潜在的过敏免疫机制表明,小麦过敏会影响皮肤､内脏､呼吸道的健康,引起运动激发过敏症､职业哮喘､鼻炎､接触性荨麻疹等[2]｡传统的生物活性检测精确度和灵敏度不高,目前采用实时荧光PCR技术实现了PCR从定性到定量的飞跃,具有实时监测､消除交叉污染､特异性强､定量结果准确等特点[3]｡本实验采用实时荧光PCR技术,建立了食品中过敏原小麦成分的快速检测方法,为食品过敏原的标签管理､监管､检测提供了可靠的技术支撑｡1材料与方法1.1材料实验于2008年8月在辽宁出入境检验检疫局技术中心实验室进行｡实验所用小麦､大麦､燕麦､荞麦､黑麦､白芝麻､糙米､绿豆､玉米､黑大豆､雪豆､泰国香米､花豆､黑小豆､黄豆､豌豆､饭豆､黑大米､胡萝卜､大白菜､韭菜､油菜､花生米､高粱､薏米和小米这26份样品由大连农业科学院､沈阳农业大学等多家单位提供,或购于大连家乐福超市｡TaqMan GEx PCR Master酶预混液购于美国ABI公司｡用于DNA提取的主要试剂CTAB缓冲液配制方法为55 mmol/L CTAB,1 400 mmol/L NaCl,20 mmol/L EDTA,100 mmol/L Tris-HCl,用10%盐酸调pH值至8.0,121℃,高压灭菌20 min,备用｡实验采用的仪器有ABI 7300实时荧光PCR仪,核酸蛋白分析仪,台式高速冷冻离心机｡1.2方法1.2.1基因组DNA的抽提采用宝生物工程(大连)有限公司生产的DNA提取试剂盒(货号:DV811A)并按其操作说明进行抽提样品的DNA｡1.2.2DNA浓度和纯度的测定取5 μL DNA溶液加ddH2O梯度稀释至1 mL,使用核酸蛋白分析仪或紫外分光光度计测260 nm和280 nm处的吸光值｡DNA的浓度按照公式C=A×N×50÷1000计算获得,式中C为DNA浓度(μg/μL),A为260 nm 处的吸光值,N为核酸稀释倍数｡OD260=1.0表示双链DNA浓度为50 μg/mL｡当OD260/OD280比值为1.7~1.9时,适宜于PCR扩增｡1.2.3引物和探针设计根据NCBI上已公布的小麦管家基因GAG56D和Wx012基因的核酸序列,在引物的设计上对小麦管家基因检测引物和探针的退火温度的一致性､GC含量的相似性等因素进行了充分的考虑,采用DNAMAN 8.0软件设计了小麦管家基因GAG56D和Wx012基因的引物和探针｡检测GAG56D基因的引物和探针序列中正向引物为:5′-CAA CAA TTT TCT CAG CCC CAA CA-3′;反向引物为:5′-TTC TTG CAT GGG TTC ACC TGT T-3′;探针为:5′-FAM-TTC CCG CAG CCC CAA CAA CCG C-Eclipse-3′｡检测Wx012基因的引物和探针序列中正向引物为:5′-GTC GCG GGA ACA GAG GTG T-3′;反向引物为:5′-GGT GTT CCT CCA TTG CGA AA-3′;探针为:5′-FAM-CAA GGC GGC CGA AAT AAG TTG CC-Eclipse-3′｡1.2.4实时PCR反应体系和反应程序实时PCR反应体系为:10×PCR buffer(含Mg2+)5 μL､正反向引物(10 μmol/L)各 1 μL､探针(10 μmol/L)1 μL､dNTPs(10 μmol/L)2 μL､Taq DNA聚合酶(2.5 U/μL)0.2 μL､模板DNA(0.1~2.0 μg/μL)2 μL,加ddH2O补足至25 μL｡实时PCR反应程序为:95℃､10 min,1个循环;95℃､15 s,60℃､1 min,40个循环,在每次循环的退火时收集荧光｡检测结束后,根据扩增曲线和Ct 值判定结果｡1.2.5结果判断同时进行的阴性､阳性､空白对照实验结果正常,检测样品有明显的荧光增幅曲线,且Ct值≤35,则判断样品中检出过敏原小麦成分｡若检测样品荧光增幅曲线的Ct值为35~40,则应重新进行实时荧光PCR反应｡再次扩增后的结果Ct值仍为35~40,可判断样品中检出过敏原小麦成分,否则可判断样品中未检出过敏原小麦成分｡1.2.6特异性实验选取与样品同科同属的物种,用于待测样品的特异性实验｡1.2.7灵敏度实验将小麦样品研磨粉碎处理后,按照不同的重量比分别添加到不含小麦过敏原基因的植物为原料的米粉基质中,制备成20.0､10.0､ 5.0､2.0､1.0､0.5､0.2､0.1､0.0 mg/kg共9个梯度含量的添加样品｡应用本方法分别进行检测,以确定本方法的检测灵敏度｡2结果与分析2.1特异性分析结果采用小麦管家基因GAG56D和Wx012基因引物和探针进行检测,26种样品经TaqMan 探针实时PCR扩增,只有小麦产生荧光信号,其余样品均未产生荧光信号(图1)｡可见,本研究所采用的小麦管家基因GAG56D和Wx012基因检测引物和探针具有很好的特异性｡2.2灵敏度实验结果检测结果表明(图2),含量分别为20.0､10.0､5.0､2.0､1.0 mg/kg的小麦过敏原添加样品均能很好地检出荧光信号,而低于0.5 mg/kg含量的添加样品则p3讨论目前针对食品过敏原的检测方法,主要有体内检测的皮肤实验和双盲安慰剂对照激发实验､体外检测的血清IgE实验和组胺释放实验,PCR检测以及实时荧光PCR检测方法等[4]｡传统的体内检测实验直接检测是否存在过敏蛋白质,由于过敏蛋白质通常痕量存在而被食品基质掩盖,造成实验结果假阴性｡DNA比蛋白质更耐受热处理和压力作用,尤其是对于一些过敏原很难获得相应的血清抗体｡PCR方法中,在热变性条件下目标DNA可以有效提取而不像蛋白质提取时受食物基质的影响较大;它的另一个优点是它的稳定性,它不像蛋白质组成那样受地理条件和季节变化的影响｡实时荧光PCR技术与常规PCR相比,它具有特异准确､可有效解决PCR污染问题､自动化程度高等特点｡可以通过在PCR扩增过程中检测产物的荧光信号积累实时监测整个PCR进程｡因此可以通过实时荧光PCR方法更快更准确地检测出食品过敏原成分基因,从而判断食品中是否存在过敏原[5]｡本研究采用实时荧光PCR技术,建立了食品中过敏原小麦成分快速检测方法,方法的灵敏度高,检测低限可达到1.0 mg/kg;方法特异性强,与对照组25种样品无交叉反应｡在实际应用检测中,共检测280份样品,阳性符合率为100%,具有较好的应用效果｡该方法操作步骤简单,检测时限短,结果判断准确,适用于小麦过敏原的快速诊断和大量样品的检测｡参考文献:[1] 黄峙,郭宝江. 食品过敏原检测与评价技术研究进展[J]. 食品科学,2003,24(8):240-244.[2] 毛炜翔,高金燕,陈红兵.小麦过敏研究进展[J].食品科学,2007, 28(8):87-90.[3] HEID C A,SREVRNS J. Real time quantitative PCR[J]. Genome Research,1996,6(10):986-994.[4] 顾可飞,李春红. 食物过敏原及检测技术的研究进展[J]. 食品科技,2006,31(8):42-44.[5] HIRD H,LLOYD J,GOODIER R, et al. Detection of peanut using real-time polymerase chain reaction[J]. Eur Food Res Technol,2003,217(3):265-268.。