苏教版选修一生物成分的分离与测定技术学案(2)

思考1:分离生物大分子的基本思路是什么？ 思考2 :蛋白质的分离和提取的原理是什么？
思考3:高温灭菌和酒精灭菌分别利用蛋白质的何种作用，作用结果是什么被破坏？
思考4:人们用鸡的 红细胞提取 DNA 用人的红细胞提取血红蛋白的原因是什么？ 一、基础知识： ㈠凝胶色谱法（分配色谱法）：
1、概念：根据被分离蛋白质的
，利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用，来分离蛋白质的有
效方法。

2、 原理：当不同的蛋白质通过凝胶时，相对
的蛋白质容易进入凝胶内部
的通道，路程 _________________ ，移动速度 _______________________ ，而 _________________________________________ 的蛋白质无法
进入凝胶内部的通道，只能在 移动，路程
，移动速度
，相对分子
质量不同的蛋白质因此得以分离。

3、 具体过程：
B. （ 1）
混合物上柱；
（2）洗脱开始，
的蛋白质扩散进入凝胶颗粒内;
排阻于凝胶颗粒之外；
（3） __________________ 的蛋白质被滞留； _________________________ 的蛋白质被向下移动。

（4） ___________________ 不同的蛋白质分子完全分开； （5）
的蛋白质行程较短， 已从
中洗脱出来，
的蛋白质还在行进中。

㈡缓冲溶液：
1、概念：在一定的范围内，能对抗外来少量强酸、强碱或稍加稀释不引起溶液
作用，具有缓冲作用的溶液叫做缓冲溶液。

2、 作用：能够抵制
的对溶液的
的影响，维持PH 基本不变。

3、 缓冲溶液的配制
通常由 ________________________ 种缓冲剂溶解于水中配制而成。

调节缓冲剂的 ________________ 就可以制
得 ______________________ 使用的缓冲液。

第一节生物成分的分离与测定技术
血红蛋白的提取和分离
教学目标
1. 尝试对血液中血红蛋白的提取和分离
2. 提取生物大分子的基本过程和方法
教学重难点
重点：凝胶色谱法的原理和方法。

难点：样品的预处理；色谱柱填料的处理和色谱柱的装填
课 题
课型 新授
【导学诱思】 (5)
的蛋白质由于
作用
胶颗粒内部而被滞留；
___________________________的蛋白质被
PH 发生明显变化的作用叫做缓冲
的蛋白质被排阻在凝胶颗粒外面，在了里之间迅速通过。

(1)
2
(2)
^00
OO'O
2
(3) OOC
OO ooo O0 OOO
思考：说出人体血液中缓冲对？ 思考：在血红蛋白整个实验室中用的缓冲液是什么？它的目的是什么？
使用的是磷酸缓冲液，目的是利用缓冲液模拟细胞内的 PH 环境，保证血红蛋白的正常结构和功能，便于观 察（红色）和材料的科学研究（活性） ㈢电泳： 1、 概念：指 2、 原理：许多重要的生物大分子，如 下，这些基团会带上 移动。

电泳利用了待分离样品中各种分子 的不同使带电分子产生不同的 3、 分类： 发生迁移的过程。

等都具有 电泳 电泳。

。

在电场的作用下，这些带电分子会向着与其 _ 以及分子本身 ，从而实现样品中各种分子的分离。

带电性质、分子大小和形
测定（ 聚丙稀酰胺凝胶电泳 蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中的迁移率取决于它所带静电荷的 多少以及分子的大小等因素。

为了消除静电荷对迁移率的影响可以在凝胶中加 入 。

SDS 能使蛋白质发生完全变性。

由几条肽链 组成的蛋白质复合体在 SDS 的作用下会解聚成单条肽链，因此 测定的结果只是 。

SDS 能 与各种蛋白质形成蛋白质一 SDS 复合物，SDS 所带负电荷的量 大大超过了蛋白质分子原有电荷量。

因而掩盖了不同种蛋白质间的电荷差别，使电 于 二实验操作 蛋白质的提取和分离一般分为四步： 样品处理一一粗分离一一纯化一一纯度鉴定 1.样品处理
（1）红细胞的洗涤
① 目的：去除 ② 方法： 离心（速度越高和时间越长会使白细胞和淋巴细胞等一同沉淀达不到分离的 效果），然后用胶头吸管吸出上层透明的 ，将下层 的红细胞液体倒入 再加入用 _______________________ 的 ________________质量分数为0.9 %的氯化钠溶液洗涤 ⑤ 低速离心（低速短时间） ⑥ 重复4、5步骤 __________ 次，直至上清液中已没有 不可洗涤次数过少。

血红蛋白的释放 ）通常用十二烷基硫酸钠（ SDS — 凝胶电泳原理示意图 泳迁移率完全取决 ，表明洗涤干净。

利于后续血红蛋白的分离纯化,
⑵ 加
于 ⑶ 分离血红蛋白溶液: ____ 至U _________________ 体积，再加40%体积的 __________________________ 溶解细胞膜） ，置
________ 上充分搅拌10分钟（加速细胞破裂）,细胞破裂释放出血红蛋白• 将搅拌好混合液转移到离心管内，以 2000r/min 的速度离心10 min ，试管中的溶液分为 4层： 第1层 第2层
第3层 第4层 ⑷透析 （最上层） 仲上层） 仲下
层） （最下层） :其它杂质 -甲苯层
_______ 的沉淀层, 的水溶液层， 色薄层固体 的液体
的沉淀层
2.凝胶色谱制作 1）凝胶色谱柱的制作 ① 取长40厘米，内径 ② 底塞的制作：打孔
1.6厘米的玻璃管，两端需用砂纸磨平。

挖出凹穴
安装移液管头部
覆盖尼龙网，再用 100目尼龙纱包好。

a 、选择合适的的橡皮塞，中间打孑L ；
度。

如果凝胶色谱柱装填得很成功、
分离操作也正确的话， 能清楚地看到血红蛋白的红色区带均匀、
狭窄、平整,
随着洗脱液缓慢流出；如果红色区带歪曲、散乱、变宽，说明分离的效果不好，这与凝胶色谱柱的装填有关。

讨论：如何测定蛋白质的分子量？
使用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳测定蛋白质的分子量时，可选用一组已知分子量的标准蛋白同时进行电泳， 根据已知分子量的标准蛋白的电泳区带位置，用电泳迁移率和分子量的对数作标准曲线，可以测定未知蛋白质的 分子量。

课堂练习1.用凝胶色谱法分离蛋白质时，分子量大的蛋白质
()
A .路程较长，移动速度较慢
B .路程较长，移动速度较快
C .路程较短，移动速度较慢
D .路程较短，移动速度较快 2.蛋白质提取和分离分为哪几步 ()
A. 样品处理、凝胶色谱操作、
SDS —聚丙烯酰胺凝胶电泳 B
C.
样品处理、粗分
离、纯化、纯度鉴定
D
血红蛋白的整个提取过程中，不断用磷酸缓冲液处理的目的是
(
C .防止血红蛋白被 02氧化
D .让血红蛋白处在稳定的 pH 范围内，维持其结构和功能 4•在盛有红褐色的Fe(OH)3，胶体的U 形管的两个管口，各插一个电极，通直流电后，发现阴极附近的颜色逐渐
A. 加样前，打开色谱柱下端的流出口，使柱内凝胶面上的缓冲液缓慢下降到凝胶面的下面
B. 加样后，打开下端出口，使样品渗入凝胶床内
C. 等样品完全进入凝胶层后，关闭 下端出口
D. 用吸管小心的将1ml 透析后的样品加到色谱柱的顶端，不要破坏凝胶面
•样品处理、凝胶色谱操作、纯化 •样品处理、纯化、粗分离、纯度鉴定
)
3.在
A •磷酸缓冲液会加速血红蛋白的提取过程
B •血红蛋白是一种两性物质，需要酸中和 加深，这说明()
A . Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，向阴极移动
C . Fe(OH)3胶体粒子带正电荷，向阳极移动
5.样品的加入和洗脱的操作不正确的是( B . Fe(OH)3胶体粒子带负电荷，向阳极移动 D . Fe(OH)3胶体粒子带负电荷，向阴极移动 )。