SNP分型方法及在法医学等领域的应用_郭宏

３ Ｓ ＮＰ 分型方法
ＳＮＰ 的分型方法没有最完美的， 技术是否合适取决于 试验的要求。就法医学而言， 这些要求应当包括良好的 复合扩增体系和较高的准确度， 还应当包含高通量和低 成本。
依据分子生物学原理， 绝大多数的 ＳＮＰ 分型试验属 于以下四类： 等位基因特异性杂交、引物 延伸法、寡核苷 酸连接反应和内切酶酶切技术， 每种分型实验的产物现分 述如下。 ３．１ ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅ ｒ Ｒ （ Ｒｏｃｈｅ ）
这种方法是把等位基因特异性探针（ ＡＳＯ） 与实时定 量 ＰＣＲ 技术综合起来。等位基因特异杂交又可以称为等 位基因特异寡核苷酸杂交， 通过杂交可以对两个仅有一
个 碱 基 差 别 的 目 标 ＤＮＡ 进 行 区 分 。 ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｒ （ Ｒｏｃｈｅ） 法设计了两种带荧光染料的序列特异性探针， 一 条探针在 ３＇ 端有荧光基团， 另一条探针在 ５＇ 端有荧光基 团（ ＬＣＲｅｄ） ， 这两条探针分别与 同 一 模 板 链 上 相 邻 的 序 列杂交， 杂交后两个荧光基团紧密相邻。当 ３＇ 端荧光基 团被激发出绿色荧光后， 由于两个荧光基团的位置非常 近， 激发的部分能量传递给邻近的 ＬＣＲｅｄ， 这种能量传 递， 也就是 荧 光 共 振 能 量 传 递（ ＦＲＥＴ） ， 对 两 种 染 料 分 子 间的距离要求比较高。为了获得最佳能量传递， 两个探针 之间的空间距离应在 ５ｂｐ 以内。ＬＣＲｅｄ 发出的荧光， 被 ＬｉｇｈｔＣｙｃｌｅｒ Ｒ 仪 的 光 学 管 过 滤 并 检 测 ， 荧 光 量 的 增 加 与 ＰＣＲ 过程中增加的 ＤＮＡ 量成正比。只有当两种探针都 杂交后ＬＣＲｅｄ 才能发出荧光信号。
在法医学领域， ＳＮＰ 也越来 越受到大家的重视。第 一， ＳＮＰ 大都表现为二等位基因标记， 即人群中只有二个 等位基因， 易于分型和确定基因频率， 适于混合样品的分 析。第二， 突变率非常低， 在父权鉴定中非常有利。第三， 适合高通量技术分析， 有利于数据库的建立和实现自动 化。特别有意义的是， 由于扩增产物的片段大小对于分析 降解检材的成功与否至关重要， ＳＮＰ 基因座的片段更短， 识别序列可以为 ４５－ ５５ｂｐ［５］， 因而引物可以设计得距 ＳＮＰ 位点很近， 更适合分析降解 ＤＮＡ。 当然， ＳＮＰ 也有一些 局限性。首先， 要达到与目前所用 ＳＴＲ 试剂盒一样的识 别 率 ， 至 少 要 ５０ 个 ＳＮＰ 位 点［６］， 这 大 大 超 过 了 目 前 法 医 物证专业的多重扩增能力。第二， 比商用试剂盒分析 ＳＴＲ 成本低的优势并不确定。目前， 用 ＳＴＲｓ 来进行父权鉴定 还是简便有效的。在法医学领域， 标准化和实验室之间的 验证手段将成为应用 ＳＮＰ 的关键 。
２ Ｓ ＮＰ ｓ 的应用
２．１ 疾病相关性研究 疾病基因研究策略主要是通过全基因组的扫描进行
基因定位克隆。微卫星标记图谱基础上的连锁分析， 由于 对凝胶电泳等手段的过度依赖使之较难达到完全的自动 化， 而对于大样本的全基因组扫描， 并不是所有的实验室 都能够办到的。应对这些难题与挑战， 人们把目光投向
１ 引言
ＳＮＰ（ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ） 是 单 核 苷 酸 多 态性的简称， 指基因组内特定的核苷酸位置上存在有两 种不同的碱基， 一般表现为单碱基的颠换或替换。ＳＮＰ 实 质是一种 碱 基 序 列 的 多 态 ， 其 数 目 庞 大 ， 约 占 人 类 ＤＮＡ 多态性的 ９０％， 。在不同的公共或私人数据 库已经收集 到了 ５００ 万以上的 ＳＮＰ 位点， 其中约 ４００ 万已经在一个 或多个主要人群中被验证具有多态性。虽然单个 ＳＮＰ 位 点 的 个 体 识 别 能 力 、非 父 排 除 率 、多 态 信 息 含 量 等 极 为 有 限， 但目前各种新技术和手段的进步可以允许人们高通 量地检测大数量的 ＳＮＰ 来弥补其不足。ＳＮＰ 的开发对于 遗传学领域和医药工业领域的研究具有极大的潜力， 同 时， ＳＮＰ 在法医生物学领域的应用也有广阔的前景。
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Ｔ鉴 定 科 学 ｅｃｈｎｉｃａｌ Ｐａｐｅｒ
鉴 中 国 司 法 鉴 定
ＣＨＩＮＥＳＥ ＪＯＵＲＮＡＬ ＯＦ ＦＯＲＥＮＳＩＣ ＳＣＩＥＮＣＥＳ
啶（５ － ＦＵ）和 ６ － 巯基嘌呤（６ － ＭＰ）是许多 癌症化疗的常 用药。研究发现，５ － ＦＵ 分解代谢的限速酶二氢嘧啶脱氢 酶 基 因［３］、６ － ＭＰ 分 解 代 谢 酶 巯 嘌 呤 甲 基 转 移 酶（ ＴＰＭＴ） 基 因 ［４］都 可 能 产 生 一 些 突 变，以 致 一 些 患 者 在 治 疗 过 程 中 会发生 ５ － ＦＵ 和 ６ － ＭＰ 的致命性毒害。 ２．３ 在法医学中的应用
药物基因组学是表明遗传多态性与个体对药物的治 疗 效 应 、不 良 反 应 、药 代 动 力 学 参 数 等 之 间 关 系 的 一 门 新 的学科， 为药物治疗中的多态性和新药开发提供了理论 依 据 。多 种 基 因 对 确 定 药 物 反 应 具 有 重 要 意 义，比 如：药 物 特异性靶点、细胞表面受体、细胞内信号转导 蛋白、药物 的转运载体、细胞色素 Ｐ４５０ 系统等药物代谢酶以及一些 转录因子等。ＳＮＰｓ 图 谱 可 以 精 细 地 反 映 个 体 的 遗 传 差 异，将 ＳＮＰｓ 位点与个 体 的 药 物 反 应 进 行 相 关 分 析，从 而 确定基因在药物作用中的功能和意义。例如：５ － 氟尿嘧
其中一个探针要跨越 ＳＮＰ 突变位置， 另一个探针必 须与其紧挨这样才能发生荧光共振能量传递。如果样品 基因型存在突变， 探针与靶序列有一个碱基发生错配， 都 会导致该探针的熔解温度显著下降， 并且降低幅度取决 于探针的长度和错配发生的位置。这种熔解温度的变化 可以通过熔解温度曲线分析。当然， 这种方法也可以设计 为探针与突变体匹配。
Ｓｃｉｅｎｃｅ， Ｍｉｎｉｓｔｒｙ ｏｆ Ｊｕｓｔｉｃｅ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００６３， Ｃｈｉｎａ； ３．Ｄｅｐａｒｔ－ ｍｅｎｔ ｏｆ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ Ｍｅｄｉｃｉｎｅ， Ｓｈａｎｇｈａｉ Ｍｅｄｉｃａｌ Ｃｏｌｌｅｇｅ， Ｆｕｄａｎ Ｕ－ ｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｈａｎｇｈａｉ ２０００３０， Ｃｈｉｎａ） ［Ａｂ ｓ ｔｒａｃｔ］ Ｄｕｅ ｔｏ ｔｈｅ ｈａｐｌｏｔｙｐｅ ｍａｐ， ＳＮＰｓ ｓｈｏｗ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｄ－ ｖａｎｔａｇｅ ｎｏｔ ｏｎｌｙ ｏｎ Ｘ－ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｎｄ ａｕｔｏｓｏｍａｌ ｂｕｔ ａｌｓｏ ｏｎ Ｙ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ａｎｄ ｍｔＤＮＡ． Ｉｎ ｔｈｅ ｆｏｒｅｎｓｉｃ ｆｉｅｌｄ， ｔｈｅ ｉｎｔｅｒｅｓｔ ｏｆ ＳＮＰｓ ｉｓ ｃｏｎｔｉｎｕｏｕｓｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｉｎｇ ｂｅｃａｕｓｅ ｏｆ ｔｈｅ ｌｏｗ ｍｕｔａｔｉｏｎ ｒａｔｅｓ ａｎｄ ｓｕｉｔａｂｉｌｉｔｙ ｆｏｒ ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｄｅｇｒａｄｅｄ ＤＮＡ． Ｔｈｉｓ ｒｅｐｏｒｔ ｍａｉｎｌｙ ｄｅ－ ｓｃｒｉｂｅ ｔｈｅ ＳＮＰｓ ａｎｄ Ｘ－ ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅ ＳＮＰｓ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ， ｇｅｎｏ－ ｔｙｐｉｎｇ ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ ｉｔｓ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｉｎ ｆｏｒｅｎｓｉｃ ｍｅｄｉｃｉｎｅ． ［Ｋｅｙ ｗｏ ｒｄ ｓ ］ ｓｉｎｇｌｅ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ｐｏｌｙｍｏｒｐｈｉｓｍ （ＳＮＰ）； Ｘ－ ｃｈｒｏｍｏ－ ｓｏｍｅ； ＳＮＰ ｇｅｎｏｔｙｐｉｎｇ
鉴中 国 司 法 鉴 定
Ｔ Ｃ．ＨＩＮ．ＥＳＥ．ＪＯＵ．ＲＮＡ．Ｌ Ｏ．Ｆ ＦＯ．ＲＥＮ．ＳＩＣ．ＳＣＩＥ．ＮＣＥ．Ｓ ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． ． 鉴． ． 定． ． 科 ． ． 学 ． ． ｅｃｈｎｉｃａｌ Ｐａｐｅｒ
大体上看，人们对 ＳＮＰ 的研究可分为两个层面， 第一 层面， 对 ＳＮＰ 位点进行筛选， 用于数据库的建立， 第二层 面， 对 ＳＮＰ 位点的功能进行研究。当然在法医学领域也 不例外， 例如， Ｋｉｄｄ 等［５］和 Ｄｉｘｏｎ 等［７］对 ＳＮＰ 位点的筛选， 目的都是为日常工作建立有效的数据库。关于 ＳＮＰ 位点 的功能， Ｇｒｉｍｅｓ 等［８］对红色头发的研究中， 通过对犯罪现 场 罪 犯 所 遗 留 的 生 物 检 材 的 特 殊 ＳＮＰ 位 点 进 行 分 型 ， 可 以 提 供 罪 犯 的 一 些 外 在 特 征 ， 如 头 发 的 颜 色 、眼 睛 的 颜色等。
ＳＮＰ 分型方法及在法医学等领域的应用
郭 宏 １，２， 畅晶晶 ２，３， 李 莉 ２
（ １．苏州大学基础医学院， 江苏 苏州 ２１５００６； ２．司法部司法鉴定科学技术研究所， 上海 ２０００６３； ３．复旦大学上海医学院法医学系， 上海 ２０００３２）
［摘 要］ 随着单倍型图的产生， ＳＮＰ 越来越受到关注。不仅仅在 Ｙ 染色体和线粒体， 常染色体和 Ｘ 染色体上的 ＳＮＰｓ 的应用潜 能也将被发现。ＳＮＰｓ 具有比较低的突变 率和适合于降解 ＤＮＡ 分析的特点， 在法医学领域也受到关注。本文综合介绍了 ＳＮＰｓ 和 Ｘ－ ＳＮＰｓ 的一般特性、分型方法及其在法医学的应用。 ［关键词］ 单核苷酸多态性； Ｘ－ 染色体； ＳＮＰ－ 分型 ［中图分类号］ ＤＦ７９５．２ ［文献标识码］ Ａ ［文章编号］ １６７１－ ２０７２－ （ ２００７） ０６－ ００２２－ ０４ Ｓ ＮＰ Ｔｙｐ ｉｎ ｇ Ｍｅｔｈ ｏ ｄ ｏ ｌｏ ｇ ｙ ａｎ ｄ Ｉｔｓ Ａｐ ｐ ｌｉｃａｔｉｏ ｎ ｉｎ Ｆｏ ｒｅｎ － ｓ ｉｃ Ｓ ｃｉｅｎ ｃｅ ＧＵＯ Ｈｏｎｇ１，２， ＣＨＡＮＧ Ｊｉｎｇ－ ｊｉｎｇ２，３， ＬＩ Ｌｉ２（１．Ｍｅｄｉｃａｌ Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｓｏｏ－ ｃｈｏｗ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ， Ｓｕｚｈｏｕ ２１５１２３， Ｃｈｉｎａ； ２．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｆｏｒｅｎｓｉｃ
［收稿日期］ ２００７－ ０５－ ２１ ［第一作者简介］ 郭宏（１９８０－ ）， 女， 硕士研究生。