激发子诱导拟南芥悬浮细胞的脱敏性反应.pdf
GFP-FABD2和GFP-MBD标记蛋白对拟南芥悬浮细胞培养及应激响应能力的影响
GFP-FABD2和GFP-MBD标记蛋白对拟南芥悬浮细胞培养及应激响应能力的影响时兰春;王伯初;杨兴艳;张运刚;王益川【摘要】以转GFP-FABD2和GFP-MBD基因的拟南芥为材料,研究了GFP-FABD2和GFP-MBD这两种细胞骨架标记蛋白对拟南芥愈伤组织诱导、悬浮细胞培养及应激响应能力的影响.结果表明:(1)GFP-MBD标记蛋白延长愈伤的出愈时间,改变愈伤形态,使转基因拟南芥种子的出愈量减少为野生型的59％、悬浮细胞的长短轴比缩小为1.20±0.21、第7天细胞活力下降为0.66±0.09,影响细胞的生长曲线.(2)GFP-FABD标记蛋白虽对愈伤生长影响不大,但却使悬浮细胞的长短轴比显著增加为2.49±1,18、第7天细胞的活力下降为0.87±0.06,造成悬浮细胞生长曲线的改变.(3)通过调整培养条件的激素水平,以上两种细胞骨架标记蛋白对悬浮细胞生长的影响可以得到修复.(4)检测优化条件下培养的GFP-FABD2或GFP-MBD悬浮细胞对温度、渗透压、机械应力等环境改变的应激响应能力,结果未发现与野生型有明显区别.%The effects of the plant cytoskeleton labels,GFP-FABD2 and GFP-MBD were investigated on Arabidopsis callus induction, suspension cells cultivation and capacity of response to stress. The results showed that the expression of these two fusion proteins diversely effected the callus induction and suspension cell growth. (l)GFP-MBD expression extended the time of callus induction,altered the callus morphology, reduced the quantity of callus to 59% of wild type,decreased the major/minor axial ratio of suspension cells to 1. 20±0. 21,reduced the relative viability of 7-day-old suspension cultures to 0. 66±0. 09 an d altered cell growth curve.(2)GFP-FABD2 expression had no apparent effects on callus,but itsignificantly increased the major/minor axial ratio of suspension cells to 2. 49±1. 18,reduced the relative viability of 7-day-old suspension cultures to 0. 87 ± 0. 06 and effected cell growth curve. (3)These effects can be restored by adjusting the hormone level. (4)In the optimized condition, we did not score any significant deviation in temperature,osmotic pressure,mechanical stress and other stress from those found in wild type Arabidopsis suspension cells.【期刊名称】《西北植物学报》【年(卷),期】2012(032)005【总页数】9页(P931-939)【关键词】GFP-FABD2;GFP-MBD;拟南芥;悬浮细胞;应激响应【作者】时兰春;王伯初;杨兴艳;张运刚;王益川【作者单位】重庆大学生物工程学院,重庆400044;白求恩军医学院,石家庄050081;重庆大学生物工程学院,重庆400044;重庆大学生物工程学院,重庆400044;重庆大学生物工程学院,重庆400044;重庆大学生物工程学院,重庆400044【正文语种】中文【中图分类】Q789细胞骨架（cytoskeleton，CSK）是位于细胞膜内侧的蛋白质纤维网架系统，与细胞形态建成、细胞运动、物质运输、能量转换、细胞分化等多种生命活动密切相关［1］.细胞骨架是高度动态结构，其排布与功能有着密切关系.因此细胞骨架的观察方法在细胞骨架研究中具有关键性作用.目前，GFP蛋白标记具有分子量小、无生物毒性、灵敏度高等诸多优点而非常适合于活体细胞的骨架动态研究，因而通过GFP蛋白标记细胞骨架已成为主要趋势［2］.GFP－FABD2（green fluorescent protein－the second actin－binding domain of Arabidopsis fimbrin 1）是一种微丝骨架的荧光标记蛋白，它是由GFP基因与拟南芥丝束蛋白1（Fimbrin1）的第二肌动蛋白结合结构域的基因相融合构建而成［3］.利用GFP－FABD2融合蛋白，Sano等［4］实时观察了BY－2（Nicotiana tabacumL.cv.Bright Yellow 2cell line）细胞在整个细胞周期中微丝骨架的动态，Staiger等［5］发现拟南芥皮层微丝骨架的动态是由快速生长和其他相关蛋白所介导的剪切活性主导.GFP－MBD（green fluorescent protein －the microtubule binding domain of microtubule associated protein 4）是一种微管骨架的荧光标记蛋白，它是由GFP基因和源自哺乳动物的微管结合蛋白4（MAP4）的微管结合结构域的基因融合构建而成［6］.借助GFP－MBD融合蛋白，Bruaene等［7］对拟南芥根毛发育过程中微管的动态排布进行了研究，Hamant等［8］发现了植物发育过程中组织机械应力对微管排布的指导作用.目前，这两种融合蛋白已在拟南芥细胞微丝和微管骨架的动态观察中得到广泛应用［9］.有一些文献报道了这两种外源性蛋白表达对拟南芥植株生理和形态影响的研究结果，如Sheahan等［3］报道GFPFABD2没有对拟南芥的形态和发育造成影响，Voigt等［10］认为GFP－FABD2融合蛋白不会干扰拟南芥植株对光、黑暗和重力的生长响应；Granger等［11］观察到GFP－MBD转基因型拟南芥除了根以外，其叶片的尺寸、数量、分支、长角果的数量，平均高度等都与野生型差别不大.但这两种融合蛋白对悬浮细胞形态及应激响应的研究却鲜有报道，仅Granger等［12］在GFP－MBD转基因BY－2细胞的微管骨架研究中，观察到GFP－MBD 细胞不仅长短轴比略小于野生型，并且其S型的生长曲线也与野生型不完全相同.悬浮细胞是植物细胞生长的微生物化，具有形状和细胞团大小大致相同，生长迅速，重复性强，培养条件容易控制等优点［13］，以转基因悬浮细胞为原料研究细胞骨架在应激响应中的动态变化，便于对细胞所受环境刺激进行调控和量化分析，有助于深入了解植物细胞骨架在应激感受和响应中的作用机制.一个良好悬浮细胞系的建立不仅受到愈伤质量、继代周期、激素水平、转速、光照水平等因素的影响，也与基因型有密切的关系［13］.而GFP－FABD2和GFP－MBD转基因型悬浮细胞的生理状态和应激响应能力是对细胞骨架在应激响应中作用分析的统计学意义的重要影响因素，因此，本实验通过激素调整建立状态相对良好的转基因悬浮细胞系，并考察其对温度、渗透压、外源性机械刺激的响应情况.1.1 悬浮细胞系的建立本课题中所使用的GFP－FABD2拟南芥种子由德国波恩大学的Voigt教授无偿提供，GFPMBD拟南芥种子由美国加利福尼亚技术研究院的Meyerowitz无偿赞助. 取适量拟南芥种子先用75%乙醇浸泡1min，弃去乙醇.再用10%次氯酸钠浸泡10min，弃去次氯酸钠.最后再以无菌水反复冲洗3次［14］.无菌条件下将处理后的种子接种于灭菌后的MS固体培养基（含有20g／L蔗糖、7g／L琼脂、100mg／L肌醇、150mg／L谷氨酰胺、2.0mg／L 2，4－D和0.05mg／L KT，pH 5.8）上.将接种好的培养瓶放于恒温光照培养箱中培养，温度23℃，16h日光照，相对湿度70%～80%.4周后，将生长出的愈伤取适量继代.继代培养的培养基和培养条件与诱导培养相同.出愈量的计算方法如下：出愈量＝愈伤鲜重／接种的种子重量愈伤组织继代培养4周后，用镊子轻轻夹碎，在无菌条件下称重，将1g左右的愈伤接入50mL液体MS培养基（含100mg／L肌醇、150mg／L谷氨酰胺、30g／L蔗糖、2mg／L 2，4－D、0.05mg／L KT，pH 5.8）中.将装有培养基的三角瓶置于恒温振荡培养箱内，于120r／min、23℃条件下黑暗培养.每隔7d，以新鲜MS液体培养基继代一次.继代时，将10 mL起始悬浮细胞培养液添加到40mL 新鲜MS培养基中［14］.1.2 悬浮细胞培养系的优化为得到状态更好的转基因悬浮细胞系，在参考文献［14～16］的基础上，采用MS＋100mg／L肌醇＋150mg／L谷氨酰胺＋30g／L蔗糖为基础培养基，以2，4－D、NAA和KT激素为3种因素，设计正交实验如表1.继代后第7天细胞的相对活性作为比较基准.1.3 悬浮细胞生长状态的评估1.3.1 细胞鲜重的测定方法［17］将悬浮细胞培养液充分振荡均匀，吸取1mL悬浮细胞液注入预先称重的1.5mL eppendorf管，12 000r／min高速离心10min，真空吸去上清液后，室温下敞口自然风干24h，称重，减去已知的空管重量即为1mL悬浮细胞液中细胞的鲜重，重复3次.1.3.2 细胞形态的检测将继代7d后的悬浮细胞培养液充分振荡均匀，吸取20μL悬浮细胞液滴于载玻片上，轻轻压上盖玻片.将样品置于配备有CCD的显微镜（Leica DMI 4000B）载物台上，使用40倍镜头，任意选取多个视野进行拍摄.Image prove plus（IPP）软件分析所摄细胞的长短轴比率.1.3.3 悬浮细胞活力的测定采用氯化三苯基四氮唑（triphenyl tetrezolium chloride，TTC，Amresco－0765）法检测悬浮细胞活性.基本步骤参照Towill等［18］所述略有修改.取1mL悬浮细胞培养液和1mL 0.4%TTC溶液（0.05mol／L，pH 7.5磷酸缓冲液配制），充分混匀后于室温下避光反应6h.真空吸去TTC溶液，去离子水洗涤1遍.加入3mL的95%乙醇（95%乙醇缓冲液，pH 7.4，加0.05%（V／V）吐温80，充分混匀），置于振荡机上轻柔振荡提取9h.取乙醇提取液，在分光光度计上485nm处测定其分光光度值.按比例稀释乙醇提取液，使其OD值维持在1.0以下，空白提取液调零，重复3次.与此同时，按上述方法测定单位体积细胞鲜重.按下式估算细胞活性：悬浮细胞活性＝实际OD值×稀释倍数／细胞鲜重（g）继代后悬浮细胞相对活性用下式估算（起始细胞活性测定方法同上）：悬浮细胞相对活性＝被测悬浮细胞活性／起始悬浮细胞活性1.4 细胞骨架的观察分别吸取继代后1～7dGFP－FABD2或GFPMBD悬浮细胞100μL滴于共聚焦玻皿中，置于LEICA TCS SP5共聚焦显微镜（Leica，Wetzlar，Germany）下，观察细胞内微丝或微管骨架的荧光状态.1.5 悬浮细胞应激能力的检测1.5.1 悬浮细胞对外源性机械应力响应能力检测根据预实验结果，将继代3d后的悬浮细胞置于180r／min摇床中加速振荡30min后，测量细胞产生H2O2的情况.Amplex Red（Molecular Probes，A12222）法［19］分析H2O2含量.即将Amplex Red和辣根过氧化酶（Sigma P6782）在加速振荡前加入悬浮细胞培养基中，辣根过氧化酶和Amplex Red的终浓度分别为1U／mL和100μmol／L.加速振荡结束后，使用荧光光度计（PERKIN ELMER LS50B）测量培养基中的荧光值，荧光分光光度计的最大激发波长设为560nm，发射波长设为590nm.溶液中H2O2的含量根据标准曲线折算.悬浮细胞液中细胞的鲜重按照1.4所述测量. Amplex Red储藏液：分析纯DMSO配制，储存于－20℃.使用商用H2O2制定0～2μmol／L范围内的标准曲线，方法同上.悬浮细胞产生H2O2的量如下计算：H2O2（μmol／gFW）＝［（F／391.52）×d］／m式中，F是荧光光度计上读出的荧光值，d是稀释因子，m是每mL溶液中细胞的平均湿重.1.5.2 悬浮细胞对高渗的应激响应能力检测离心收集继代3d后的悬浮细胞（1 000r／min，5 min），调整悬浮细胞密度大致在1×105个／mL.将悬浮细胞与30℃～40℃的2%（W／V）低熔点琼脂（Sigma A6560）按照1∶1混匀.为了防止低熔点琼脂对细胞造成渗透冲击，使用含有30g／L蔗糖的MS溶液配制琼脂.将60μL琼脂与细胞的混合物迅速涂布于35mm的细胞培养皿底部形成均匀的琼脂薄层，然后将培养皿盖好保湿.将样品置于配有CCD的倒置显微镜（Leica DMI 4000B）下夹好固定，找到细胞后（镜头为40×），显微镜开始录像，随即打开培养皿盖轻轻滴入100μL 1mol／L甘露醇的高渗溶液，此后连续录像计时5min.滴加药品时动作轻微，防止样品移动.悬浮细胞对高渗应激响应的能力通过单位时间内的质壁分离率评估，具体如下：利用实时录像，分别计数1min内和1～5min内出现质壁分离现象的细胞个数，然后除以总细胞数，得到1min内和1～5min内的悬浮细胞质壁分离率.1.5.3 悬浮细胞的冷耐受实验将继代培养3d后的悬浮细胞转入4℃振荡培养箱中，120r／min，避光培养12h.然后重新放回23℃振荡培养箱中继续培养3d，随即按1.5所述测量细胞的相对活性.1.6 统计分析利用SPSS 19软件进行统计分析，P＜0.05为显著性差异，P＜0.01为非常显著性差异.2.1 愈伤组织的诱导连续观察多批次（n＝5）的3种基因型拟南芥愈伤的生长情况，发现3种基因型之间在出愈时间、出愈量以及愈伤形态等方面都存在一定的差异（图版Ⅰ）.从出愈时间来看，GFP－MBD的出愈时间明显晚于GFP－FABD2型和野生型（图版Ⅰ，a～c），后两者在第3天即可观察到子叶和毛状物，而GFPMBD在第5天才能观察到少量子叶（图版Ⅰ，a）.从愈伤形态来看，GFP－MBD的愈伤从第14天起出现明显颗粒状愈伤（图版Ⅰ，d），而GFP－FABD2和野生型则是先生成不定芽（图版Ⅰ，e、f），在第20天时才出现较多的愈伤（图版Ⅰ，g～i）.从出愈量看，GFP－MBD的出愈率明显低于GFP－FABD2和野生型，后两者则没有明显区别（图1）.4周后，取重量相当的3种基因型愈伤继代培养.继代培养过程中未发现三者的显著差异，4周后均能形成浅黄色质地疏松的愈伤.2.2 悬浮细胞培养体系的建立当3种基因型采用同样的激素水平（2，4－D 2.0 mg／L，KT 0.05mg／L）的MS培养基培养时，3种基因型在形态和活力上都有一定差异.在形态方面，野生型细胞大多呈椭圆形，其长短轴比为1.46，SD为0.40；FABD2型细胞明显比野生型偏长，其细胞长短轴比为2.49，SD为1.18；MBD型细胞则较为短圆，其细胞长短轴比为1.20，SD为0.21.统计分析表明三者之间差异显著，而FABD2型与其他两者之间为极显著性差异（表2）.测定继代第7天细胞的相对活性，可以看出三者之间也有显著性差异，其中野生型的相对活性最高，FABD2次之，MBD 的活性明显低于前二者（表2）.为了了解不同基因型悬浮细胞在一个继代周期内的生长情况，测定了3种悬浮细胞生长量的变化曲线，从图2可以看出，3种悬浮细胞虽都表现出S型曲线，但生长曲线之间还是有较为明显的区别，其中在第2天时，FABD2和MBD就与野生型之间有差异.第3天时，FABD2的生物量有明显的提升，而MBD的增长趋势则明显见缓。
木霉菌诱导植物抗病性研究新进展_陈捷
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木霉菌分泌蛋白与诱导植物抗性
木霉菌在与植物根系互作过程中产生各种分泌蛋白，主要包括诱导抗性相关的激发子（elicitor）或效 应因子（effector）以及防御反应的抑制因子等，如丝氨酸蛋白酶、22 kD 木聚糖酶、几丁质脱乙酰基酶、 几丁质酶 Chit42、SnodProt1 蛋白（SnodProt1、Sm1 和 EPI）、脂肽、棒曲霉素类蛋白、无毒基因蛋白等。 多数激发子/效应因子属于富含半胱氨酸的蛋白，可诱导植物发生 MTI（microbe trigger immunity）反应， 而一些专化性激发子具有无毒基因（avr）的功能，可与植物的抗性基因（R）特异互作，诱导免疫反应，
Abstract: Trichoderma spp. are widely used biocontol microbe against plant disease with multiple antagonistic mechanism. The significant advances in induced resistance mechanism have been made in recent years. Trichoderma can produce over 20 MAMPs or DAMPs, correspondingly plant roots have about 30 receptors or response genes. The Trichoderma colonization on roots is able to initiate interaction of MAMPs/DAMPs-root receptor or response gene, which then triggers long distance transduction of signals including salicylic acid and jasmonic acid/E tresponsible for induced expression of leaf defense genes against plant disease. Integration of information based on the changes of plant trancriptome, proteome and metabolome after Trichoderma colonization on roots can provide more comprehensive understanding to Trichoderma-plant beneficial interaction associated with the induced resistance against plant disease. Key words: Trichodema; biological control; induced resistance; MAMPs; metabolome 木霉菌 Trichoderma spp.是自然界广泛分布的真菌， 普遍应用于土传病害生物防治。 近年来随着以病原 菌相关分子模式/微生物相关分子模式 （PAMP/MAPM） 为核心的植物基础免疫学理论的提出和组学技术广 泛应用，使得人们对木霉菌生物防治植物病害机理的研究上升到一个新的阶段，尤其木霉菌诱导植物抗性 分子机理研究已成为生物防治基础研究的热点，为此本文重点综述国内外关于木霉菌−植物有益互作所诱 导的植物抗性的研究进展，丰富木霉菌诱导植物免疫的理论基础。
大丽轮枝菌蛋白激发子PevD1诱_省略_MV_系统获得性抗性及其分子机制_王炳楠
基金项目：国家重点基础研究发展规划（９７３）项目（Ｎｏ．２０１１ＣＢ１００７００）和中俄国际合作项目收稿日期：２０１１－０５－２７接受日期：２０１１－０７－３０研究报告Ｌｅｔｔｅｒ大丽轮枝菌蛋白激发子ＰｅｖＤ１诱导的烟草对烟草花叶病毒（ＴＭＶ）系统获得性抗性及其分子机制王炳楠＊王双超＊檀贝贝邱德文＊＊杨秀芬＊＊中国农业科学院植物保护研究所／生物防治农业部重点开放实验室，北京１０００８１＊同等贡献作者＊＊通讯作者，ｙａｎｇｘｉｕｆｅｎ＠ｃａａｓ．ｎｅｔ．ｃｎ，ｑｉｕｄｅｗｅｎ＠ｃａａｓ．ｎｅｔ．ｃｎ摘要从大丽轮枝菌（Verticillium dahliae ）的胞外分泌物中分离到一种蛋白激发子ＰｅｖＤ１（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢａｃｃｅｓｓｉｏｎＮｏ．Ｐ８６８４０）。
为了明确该蛋白激发子的特性以及诱导植物抗病的机制，本研究在大肠杆菌（Escherichia coli ）中表达了重组蛋白６Ｈｉｓ－ＰｅｖＤ１。
该重组蛋白激发子可以引起烟草（Nicotiana tabacum ｃｖ．Ｓａｍｓｕｎ－ＮＮ）悬浮细胞死亡，提高烟草植株对烟草花叶病毒（ＴＭＶ）的系统获得抗性（ＳＡＲ），枯斑抑制率最高可达４６．６４％。
重组蛋白激发子处理后的烟草叶片中的苯丙氨酸解氨酶（ＰＡＬ）、多酚氧化酶（ＰＰＯ）和过氧化物酶（ＰＯＤ）活性均有大幅度提高。
处理后１４４ｈＰＡＬ活性最大，是对照的３．３倍；处理后１２０ｈ，ＰＰＯ和ＰＯＤ活性分别增加２３６．８％和２０４．６％。
ＰｅｖＤ１可以诱导抗性相关基因酸性病程相关基因１（ａｃｉｄｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅ１，PR1－a ）、碱性病程相关基因１（ｂａｓｉｃｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅ１，PR1－b ）、病程相关基因非表达子１（ｎｏｎｅｘｐｒｅｓｓｏｒｏｆｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓ－ｒｅｌａｔｅｄｇｅｎｅ１，NPR1）和苯丙氨酸解氨酶基因（ｐｈｅｎｙｌａｌａｎｉｎｅａｍｍｏｎｉａｌｙａｓｅｇｅｎｅ，PAL ）的表达。
拟南芥PIN2介导的生长素极性运输调控植物根向地性
Ａ ｓ ａｔ Ａ ｘ ｆｕ ａｒ ｒ Ｉ ２ ＰＮ 一 ｅ ｉｔ ｏ ｒ ｕ ｉ ａ ｓｏｔ（ Ａ ）ａ ｄｉｄ ｃｄａ ｘ ｙ ｔ ． ｂ ｔ ｃ ： ｕｉ ｅ ｘｃｒｅ Ｎ ， Ｉ ２ｍ ｄａ ｄｐｌ ｘ ｔ ｎｐ ｒ Ｐ Ｔ ｎ ｕ ｅ ｕ ｉ ｓｎｈ ｒ ｎ ｆ ｌ ｉ Ｐ ｅ ａａ ｎｒ ｎ ｎ ｅ
可 进 一 步 理 解 生 长素 调 控 植 物 根 向 地 性 的 分 子 机 理 ．
关键词 ： 拟南芥 ； 生长素 ； Ｉ２ 极性 运输 ； 向地性 ＰＮ ； 根
中 图分 类号 ：９ ５ ７ Ｑ ４ ． 文 献 标 识 码 ： Ａ
ＰＩ Ｎ２－ ｅ ｉ ｔｄ ｌ ｒ ａ ｘ ｎ ｔ ａ ｐ ｒ ｅ ｕｌｔｏ ｆ ｍ ｄ ａ ｅ ｐｏａ ｕ ｉ ｒ ｎｓ ｏ ｔｒ ｇ ａ ｉ ｎ ｏ ｒ ｏ ｒ ｖ ｔ ｏ ｓ ｎ ａ ｉｏ ｉ ｈ ｉ ｎ ｏ ｔｇ ａ ｉｒ ｐｉｍ ｉ Ａｒ ｂｄ ｐｓｓｔ ａｌ ａ ａ
第３ ３卷第 １ 期 ２１ ０ ０年 ３月
浙江师范大学学报 （ 自然科学版 ）
Ｊｕｎｌ ｆ ｈｊ ｎ ｏ ｌ ｎ ｅｓｙ Ｎ ｔＳｉ） ｏｒａ ｏ ｅ ａｇＮ ｒ ｉ ｒｉ （ ａ．ｅ． Ｚ ｉ ｍａ Ｕ ｖ ｔ
Ｖｏ ． ３ １ ３．Ｎｏ １ ． Ｍａ ．２０１ ｒ ０
ｓｓｅｆ ｃ ｓｏ ｕ ｉ ｏ ｓ ｍｍ ｅｒｃ ｄ ｓｒｂｕ ｉｎ ａ ｄ ｇ ａ ｉｙ ｒ ｓ ｏ ｓ ｒ ｘ ｍｉ ｅ ｎ Ａｒ ｂｄ ｐ ｉ ｏ ｔ． Ｉ ｓ ｉ ｆｅ ｔ ｎ ａ ｘ ｎ ｎ ｎ ｙ ｔｉ ｉｔｉ ｔｏ ｎ ｒ ｖ ｔ ｅ ｐ ｎ ｅ ｗｅｅ ｅ ａ ｎ ｄ ｉ ａ ｉｏ ｓｓ ｒ ｏｓ ｔｗａ
生长 素极性 运输 （ｏａ ｕｉ ｔｎｐｒ，Ａ 在植 物 胚 胎 、 生器 官 的发 生 与 发 育 、 性 生长 （ｒ ． ｐｌ ａｘｎ ｒ ｓｏ Ｐ Ｔ） ｒ ａ ｔ 侧 向 ｔｐ ｏ ｉ 中起 了关 键性 的调控 作用 ， ｓ ｍ） 已成 为植 物发 育生 物学 领域 中的研 究热 点之 一． 长 素极性 运输 由定 位 生 于细 胞膜 上 的输 入 载 体 Ａ Ｘ１Ｌ Ｘ 家 属 （ｕｉ ｒｓ ｔ ｔＩｌ ｅＡ Ｘ１ｆ ｌ） 和 输 出载 体 ＰＮ家 属 Ｕ ／Ａ ａｘｎ ｅｉａ ／ｉ Ｕ ａ ｙ ｓｎ ｋ ｍｉ Ｉ
植物抗病性相关的WRKY转录因子的结构功能
植物抗病性相关的WRKY转录因子的结构功能1植物抗病相关转录因子转录因子(transcription factor，TF)是指能够直接或间接与启动子核心序列TATA盒特异结合，并启动转录的一类调节蛋白，通过调节目的基因的转录效率来调控植物的生理生化过程。
转录因子包含转录激活因子和转录阻遏因子两种，是基因表达的重要调节因子。
根据DNA结合区域的不同，如螺旋．环．螺旋、锌指结构、螺旋．转角．螺旋和亮氨酸拉链结构等等，植物的转录因子可划分成多个家族，如NAC家族、MYB家族、WRKY家族等。
转录因子在植物的抗病过程中起重要的作用。
近年研究发现，ERF、MYB、WRKY等家族中许多转录因子参与调控植物JA、ET、SA及不同病原菌侵染的信号转导途径。
在ERF家族中，ERFl和ORA59是JA/ET信号途径的激活调控因子，且ERFl基因过表达可以激活植物抗病相关基因PDF1.2和几丁质酶合成基因ChiB的表达，增加植物对灰葡萄孢的抗性；ERF2、ERFl4过表达也使PDF1.2的表达水平增加，而ERFl4是PDF1.2的负调控因子，这些研究表明ERF家族中的多数基因对植物抗病起负调控作用。
在MYB家族中，MYB30与植物磷脂酶相互作用，是拟南芥抗细菌的正调控因子；MYB72是拟南芥根部关键的调节因子，根际有益的细菌可诱导MYB72表达，激发拟南芥产生抗病性。
WRKY蛋白是近年来发现的植物特有的一类转录因子家族，在拟南芥中有74个家族成员，在水稻中有多于100个家族成员，参与生长发育、叶片衰老等，但主要功能是协助植物对抗各种生物或非生物胁迫。
2 WRKY转录因子概述WRKY转录因子最初是Ishiguro从甘薯中分离得到。
其后在野燕麦、皱叶欧芹、拟南芥、烟草、水稻、沙漠豆科植物、鸭茅草、大麦、棉花、油菜当中克隆到WRKY基因。
截止目前已经在20多种高等植物以及一些低等正和生物如肠兰波鞭毛虫、粘液菌盘基网柄菌、绿藻中发现该基因。
拟南芥免疫反应的研究及其在抗病技术中的应用
拟南芥免疫反应的研究及其在抗病技术中的应用拟南芥作为一种模式植物，是植物学中研究的热点之一。
随着技术的发展，研究人员们逐渐深入了解到拟南芥的免疫反应机制与抵抗病原体的能力。
本文将介绍拟南芥免疫反应的研究以及其在抗病技术中的应用。
一、拟南芥免疫反应的研究1. 拟南芥免疫反应的基本机制拟南芥在受到病原体入侵后，可以通过启动一系列的免疫反应来抵御病原体的攻击。
拟南芥的免疫反应主要分为两类：基于PTI（PAMP-triggered immunity）的免疫反应和基于ETI（effector-triggered immunity）的免疫反应。
PTI是一种非特异性的免疫反应，当拟南芥感知到病原体的PAMP（pathogen-associated molecular patterns）时，会启动PTI反应，例如：植物细胞表面的受体样蛋白RLP或LYK4接收到特定的细菌分子，便会激活PTI反应；而ETI则是一种高度特异的免疫反应，当拟南芥感知到病原体侵入后，它会分泌出一些抗生素质和毒素来抵御病原体的攻击。
2. 免疫反应信号途径的研究在拟南芥免疫反应的研究中，研究人员们发现了一系列的免疫反应信号途径，这些途径包括：宿主表观遗传学调控、miRNA的表达调控、蛋白质修饰以及抗病素的代谢。
这些信号途径之间是相互关联的，通过相互作用来完成对病原体的识别以及抗病反应。
3. 免疫反应基因的鉴定与表达调节为了更深入了解拟南芥免疫反应的机制，研究人员们鉴定和分析了一些与免疫反应相关的基因，包括PAMP受体、PAMP识别蛋白、转录因子、蛋白质修饰因子等。
同时，为了探究拟南芥免疫反应的发挥机制，研究人员们还分析了拟南芥中与先天性免疫机制相关的基因，以期揭示拟南芥体内免疫反应的网络结构和功能。
二、拟南芥在抗病技术中的应用1. 基于拟南芥的抗病品种研发拟南芥的研究不仅有助于理解植物自身免疫反应的机制，同时也为植物抗病育种提供了新的思路。
NADPH氧化酶NtrbohD参与烟草悬浮细胞ABA诱导的H2O2快速产生过程
导保 卫细胞 Ｈｚ ２ 快速产生 ，Ｈｚ ２ ｏ 介导 了 Ａ Ａ诱导 ｏ Ｂ 的气 孔 关 闭过 程 ．Ａ Ａ 不 仅 存 在 于保 卫 细 胞 ， Ｂ
Ｒ －Ｃ Ｔ Ｐ Ｒ和 蛋 白印迹 技 术分 析 了烟 草质 膜 ＮＡＤ Ｈ 氧 化酶 基 因 Ｎｔｂ ｈ 的表 达 水平 ，发 现 该基 因 Ｐ ｒｏ Ｄ 在 ｔＲ ｕ ＮＡ 和 蛋 白水 平 的表达 受 ＡＢ 上调 ，表 明 Ｎｔｂ ｈ Ａ ｒｏ Ｄ参 与烟 草悬 浮细 胞 ＡＢ 诱 导 Ｈｚ ｚ快速 Ａ Ｏ 产 生过程．结 果说 明，ＡＢ 能够诱 导 悬浮细 胞 通 过 ＮＡＤ Ｈ 氧 化 酶 快速 产 生活 性氧 ，提 示 ＮＡＤ Ａ Ｐ — Ｐ 氧 化 酶和 Ｈｚ ｚ可 能是植 物 细胞 中 ＡＢ 信 号转 导途 径 的重要 成分． Ｈ Ｏ Ａ 关 键词 Ａ Ａ 烟草悬浮细胞 Ｈ Ｏ Ｎ Ｄ Ｈ氧化酶 ＮｒｏＤ Ｂ ，２ Ａ Ｐ ｔ ｈ ｂ
干旱 、盐 、冷等反应 以及调节 发育如 营养生长 、种子
休 眠和成 熟 中起 重要作 用 ］ ．在拟 南芥 （ ａ ｉｏ ｓ Ａｒｂｄ ｐ ｉ ｓ
２ ０— ７２ ０ ７０ —６收 穑 ，２ ０— ９２ ０ ７０ —０收 修 改 稿
＊ 国 家 重 点 基 础 研 究 发 展计 划 （ 准 号 ：Ｇ１ ９ ０ １ ０ ，２ ０ Ｃ １ ４ ０ ） 国家 自然 科 学 基 金 （ 准 号 ：３ １ ０ ８ ，３ ３ ０ ２ ） 教 育 部 博 批 ９９１７０ ０３ Ｂ １３０ 、 批 ０７０８ ０７１０ 和 士 基 金 （ 准 号 ：２０ ０ １ ０ ０ 资 助 项 目 批 ０２０９３） ＊＊ 通 信 作 者 ，Ｅ ｍａｌ ｈ ｎａ ｐ ｂｉ ｂａ ｎｔｃ － ｉ ：ｃ ｅｊ＠ ｕ ｌ ． ｔ． ｅ．ｎ ｃ
一种快速检测激发子诱导植物抗病性效能的方法[发明专利]
![一种快速检测激发子诱导植物抗病性效能的方法[发明专利]](https://img.taocdn.com/s3/m/3a80dfebba1aa8114531d938.png)
专利名称：一种快速检测激发子诱导植物抗病性效能的方法专利类型：发明专利
发明人：张洪勋,彭霞薇
申请号：CN200410062532.4
申请日：20040701
公开号：CN1715913A
公开日：
20060104
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明提供一种用于快速检测不同激发子诱导植物抗病性效能的方法。
本发明使用恒温培养箱中黑暗条件下生长的黄瓜感黑星病品种的黄化苗植株，按下列方法制备和进行实验：首先，黄瓜种子经0.1％的升汞表面消毒后，再用蒸馏水冲洗，在25℃恒温箱中催芽24小时，黄瓜种子发芽后播种于下垫两层纱布的搪瓷盘中(20×30cm)，然后在23－25℃恒温箱中黑暗避光条件下培养5天，种壳脱落后用于实验。
将各种激发子以喷雾法处理上述培养好的黄瓜黄化苗，诱导处理48小时后，用黑星病菌孢子悬液接种黄化苗，4天后观察黄瓜黄化子叶发病情况，以确定各种激发子对诱导植物抗病性的效果。
用该方法检测各种激发子的诱导植物抗病活性，实验周期短、不受外界环境条件影响、实验重复性好、接种症状表现明显、易于分级和实验观察等优点。
申请人：中国科学院生态环境研究中心
地址：100085 北京市海淀区双清路18号
国籍：CN
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诱导抗性
诱导抗性除了自身具有的天然屏障，植物已经进化产生了不同的诱导防卫机制来保护自己免受病原菌侵害。
植物诱导抗病性，又称系统获得抗性或植物免疫，是植物在一定的激发子刺激后，对随后的病原菌侵染表现既快又强的防卫反应。
生物或化学激发子处理后，植物具备了比未诱导植物更快更强的表达防卫反应以应对生物与非生物胁迫的能力，这一过程被称为“Priming”，即为“植物敏化过程”或者“防御准备过程”。
激发子处理后，植物能够快速调配防卫反应的生理状态称为“primed state”，即敏感的或者准备就绪的状态。
目前，priming被证明成为植物免疫系统的共同特征，赋予植物在病原菌、昆虫以及非生物胁迫下自我保护的能力，也是植物诱导抗病性的重要细胞机制。
植物防卫反应激发子，如水杨酸及其功能类似物2, 6-二氯异烟酸、茉莉酸甲酯、苯并噻二唑、β-氨基丁酸、核黄素和硫胺素等等，都能够使植物处于敏感的状态，当病原菌侵染时引发更快更强的防卫反应。
目前，激发子诱导priming过程的细胞机制仍处于推测阶段。
一种观点认为，激发子诱导一个或多个信号蛋白的积累或翻译后修饰，而这些蛋白在被表达或修饰后仍保持失活状态。
当植物识别后来的胁迫后，另一个信号传导事件能够超激活信号蛋白，激发一个增强的信号传导途径，因而放大信号传导并导致更快或/和更强的激活防卫反应。
例如，激发子首先诱导一个Ca2+依赖的蛋白激酶的磷酸化并导致构象改变。
接着，胁迫能够引起自由Ca2+浓度的改变，因而激发激酶活性并快速启动下游信号传导和防卫基因的增强表达。
很多研究表明，蛋白激酶参与激发子诱导priming过程的信号通路，如β-氨基丁酸、核黄素和苯并噻二唑。
研究表明，核黄素启动了一个由蛋白激酶参与的植物抗病防卫信号传导通路。
目前，我们还不清楚哪类蛋白激酶参与这个过程、发生何种级联反应。
目前，本课题组正在鉴定核黄素诱导植物抗病防卫所需的蛋白激酶并揭示其生物学功能。
另外一个观点认为，激发子通过诱导关键转录因子的积累而加速防卫基因的表达。
植物防卫反应
▪ SAR由病原物诱导， 可以激活整个植株 抗性，与动物的免 疫机制相似，提供 对多种病原物广谱 的抗性。
▪ ISR是由促根生长 的根系微生物诱导 的，与SAR相似， 也能提供广谱的抗 性。
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植物被动抗性和主动抗性机制
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5
✓植保素
植物受到病原物侵染后，在植物体内合成并累积的低分子抗菌化合物
化学成分及分布
31科植物种发现了植保素 异黄酮类发现于豆科 倍半萜类存在于茄科
－－－－－－－－－－－－－－
生物合成
三条主要的途径： 莽草酸途径 乙酸－丙二酸途径 解
植保素是非特异性杀生物剂 病原物的毒性小种更耐植保素－解毒酶 使植保素亲水性增加，通过氧化、水合和脱甲基化
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✓富羟脯氨酸糖蛋白
植物细胞壁的重要组分 包括伸展蛋白、阿拉伯－半乳糖蛋白、富脯氨酸/羟 脯氨酸糖蛋白和茄科植物凝集素 组成性表达，但也受伤口和侵染诱导 尖孢镰刀菌侵染番茄，其根部有HRGP的累积 在烟草、菜豆过敏性死亡细胞周围的活细胞种累积 抗性机制是为木质素在乳突中积累提供模板
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植物保卫素
凝胶葡聚糖(24~168hr)
酚化合物渗入24~168hr 捕获胞子(0hr)
胼胝质沉积(8~48hr)
维管束组织和周 围细胞变化时间
和空间模式
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侵填体 tylose
与导管相邻的
纵 剖
薄壁细胞通过 面
纹孔膜在导管
腔内形成的膨
大球状体。
抵抗维管束病害
横
PP： perforation plate V:Xylem vessel
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✓系统诱导抗性（SAR)
与SAR的第2条条件不满足 不产生PR蛋白 不依赖水杨酸的积累
拟南芥干旱胁迫响应的生理学和分子生物学机制研究
拟南芥干旱胁迫响应的生理学和分子生物学机制研究近年来，全球气候变化对自然生态系统的影响日益凸显，其中干旱是最为严重的一种气候变化现象。
干旱环境下植物的生长发育和生存能力受到极大限制，为了适应这种环境，植物拥有了很多适应性措施和机制。
拟南芥（Arabidopsis thaliana）作为一种模式植物，在干旱胁迫响应的生理学和分子生物学机制研究中得到了广泛应用。
干旱胁迫对拟南芥的生理学特征产生了显著影响。
在干旱胁迫条件下，拟南芥的生长发育速度明显减缓，叶片开始脱水，蒸腾作用逐渐下降，从而影响光合作用的进行。
为了应对干旱胁迫，拟南芥启动了多种生理响应机制。
首先，拟南芥通过减少蒸腾作用来减少水分损失，这种反应反应主要通过气孔关闭来实现。
其次，拟南芥增加了根系的生长，从而增加了植物吸收水分的面积和吸收水分的效率。
此外，拟南芥还启动了积极的保护机制来避免细胞内外部分子的氧化损伤，比如增加抗氧化酶活性和积累可溶性糖等。
干旱胁迫引起了拟南芥生理特性的变化，这种变化是通过多种信号通路来调节的。
ABA（Abscisic Acid）作为主要的干旱信号分子，在调节拟南芥的干旱响应中起到了至关重要的作用。
ABA主要通过启动后续的逆境响应基因表达或调节离子进出等机制来实现干旱胁迫的应对。
此外，一些与ABA信号通路密切相关的转录因子，在调节逆境响应基因表达中也起到了重要的作用。
除了ABA信号通路外，还有其他信号通路在拟南芥的干旱响应中起到了重要作用。
其中，另一个重要的信号通路是涉及到钙离子调节的信号通路。
在干旱条件下，植物的Ca 2+离子浓度增加，从而启动了一系列与响应干旱胁迫相关的基因表达。
除此之外，拟南芥中还存在一些特定的基因、蛋白和RNA，它们在干旱响应过程中起到了重要的作用。
干旱胁迫的信号通路通过调节基因的转录和翻译水平来调节拟南芥的干旱逆境响应。
在拟南芥中与干旱响应相关的转录因子和酶在调节基因表达水平上起到了重要的作用。
拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织对潮霉素的反应
第26卷 第3期中 南 林 学 院 学 报V o l.26 N o.3 2006年6月JOU RNAL O F CEN TRAL SOU TH FOR ESTR Y UN I V ER S IT Y Jun.2006 Ξ[文章编号]1000-2502(2006)03-0042-05拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织对潮霉素的反应李建安,胡芳名,谭晓风(中南林业科技大学,湖南长沙410004)[摘 要] 研究了潮霉素对拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织的作用效果和特性.结果表明:潮霉素对拟南芥悬浮细胞生长、愈伤组织诱导及其生长均有极明显的抑制作用,但作用效果和特性均有所不同;拟南芥悬浮细胞继代培养阶段、愈伤组织诱导阶段和愈伤组织增殖阶段的临界致死质量浓度分别为25、2.5、1.5m g L,液体与固体培养条件下差异极大;潮霉素需要一定处理时间才能充分表现其抑制细胞生长或杀死细胞的效果,一般液体培养条件下3d以后、固体培养条件下5d以后效果趋于稳定,但不同的处理质量浓度有较大差异.还就液体与固体培养条件下作用效果差异的原因进行了讨论,并提出了对潮霉素抗性标记筛选的建议.[关键词] 拟南芥;悬浮细胞;愈伤组织;潮霉素;转化子选择[中图分类号] Q943.1 [文献标识码] AI m pact of Hygrom yc i n on A rabidop sis Suspen sion Cells and Ca ll iL I J ian2an,HU Fang2m ing,TAN X iao2feng(Central South U niversity of Fo restry&T echno logy,Changsha410004,H unan,Ch ina)Abstract:T he i m pact of H ygrom ycin B on A rabid op sis suspensi on cells and calli w as studied.T he results show that the grow th ofA rabid op sis thaliana cells in v itro w as significantly inh ibited w ith H ygrom ycin B,and different effects and characteristics of inh ibiti onw ere p resented among different culture stages,especially betw een liquid and so lid culture.O n suspensi on subculture,calli inducem ent and calli subculture,the lethal critical concentrati ons of H ygrom ycin B fo r A rabid op sis tha liana cells w ere25,2.5,1.5 m g L in turn.A long o r sho rt ti m e of treatm ent w ith H ygrom ycin B w as necessary to i m pact on A rabid op sis tha liana cells fully.T he inh ibiti on efficiency becam e stable in3days in liquid and in5days on so lid after treatm ent w ith H ygrom ycin B,but a considerable change p resented among different concentrati ons.Further mo re,the p robable causes of the different inh ibiti on efficiency betw een liquid and so lid culture conditi ons w ere discussed,and som e suggesti ons w ere m ade fo r the selecti on of hygrom ycin2resistance m arker on transfo r m ati on of A rabid op sis suspensi on cells.Key words:A rabid op sis tha liana;suspensi on cells;callus;hygrom ycin;selecti on of transfo r m ants拟南芥A rabid op sis tha liana是十字花科拟南芥属一种草本植物,是当今最重要的模式植物.拟南芥在植物基因克隆及基因转化研究方面有着极为重要的作用,现已分离克隆的大多数植物新基因是首先在拟南芥基因组中发现的,且大多数新基因的功能是通过基因转化获得拟南芥突变体鉴定的[1,2].基于根癌农杆菌A g robacterium介导的花浸法(flo ral di p)很容易将外源基因整合到拟南芥基因组,并且可以稳定表达和遗传[3].因此,这一方法目前被普遍采用.然而,由于嵌合体和有性世代性状分离的干扰,通过这一方法很难获得遗传背景稳定、一致的转化子(tran sfo r m an t).通过悬浮细胞基因转化的方法可以从根本上克服以上弱点,但悬浮细胞的细胞数量巨大,如何有效地进行转化子选择是制约这一技术的难点之一.借鉴微生物遗传操作技术,利用抗生素抗性标记筛选转化子是植物悬浮细胞转化子选择最可行的方法.潮霉素(hygrom ycin)抗性基因hp t是目前使用较多的选择标记基因(selectab le m arker gene)之一,其编码H PT 蛋白酶(潮霉素磷酸转移酶)通过磷酸化作用使潮霉素失活[4,5].潮霉素对植物细胞有强烈的杀灭作用,但hp tΞ[收稿日期]2006202221[基金项目]波兰华沙大学PM BE课题“T ransfo r m ati on of A rabid op sis tha liana suspensi on cells”的部分内容.[作者简介]李建安(1964-),男,教授,博士,主要从事经济林培育及林木细胞与分子育种研究.成功整合到宿主细胞基因组后,能够使宿主细胞产生潮霉素抗性.本研究的主要目的是确定潮霉素对野生型拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织的抑制效应,为拟南芥悬浮细胞转化子潮霉素抗性标记选择提供依据.1 材料和方法1.1 试验材料拟南芥起始悬浮细胞为野生型A rabid op sis tha liana 细胞株,由华沙大学A ndrzej Jerz m anow sk i 教授提供.所有材料均由华沙大学植物分子生物学实验室提供并在该实验室完成全部试验,其中,潮霉素(H ygrom ycinB )、商品B 5粉末培养基购于Sigm a 公司.1.2 液体条件下潮霉素处理试验拟南芥悬浮细胞培养基及培养方法参照Glab (1994)使用的方法[6].培养基为B 5+0.2m g L NAA (naph thalene acetic acid )液体培养基.每300mL 三角瓶中,取10mL 起始悬浮细胞液,接种于40mL 液体培养基,分别加入设计质量浓度的潮霉素(预先已灭菌),铝铂纸封口,置于光照培养室中振荡培养,培养条件:23℃,24h 光照,120r m .重复3次.T TC 法测定细胞活性或死亡率.1.3 固体条件下潮霉素处理试验培养基为B 5+0.2m g L NAA 固体培养基,琼脂含量8g L .常规灭菌后分装至一次性已灭菌培养皿,每皿约25mL 培养基,潮霉素在培养基冷却至尚未凝固前约60℃时加入.完全凝固并冷却至室温后接种.愈伤组织诱导阶段潮霉素处理试验按下述方法进行:每皿约接种1mL 继代后2d 的悬浮细胞,平板培养,培养条件:23℃,24h 光照.重复3次.根据平板上的细胞密度及分布,用记号笔在培养皿底部沿圆心等分出4～8个扇形区,每皿随机抽取1～2个扇形区统计诱导出的愈伤组织数量,根据愈伤组织颜色,可以判别其死活情况.一般活细胞为浅绿色到嫩黄色,死细胞为白色到浅灰色.由个别大细胞团顶部未接触培养基面的细胞诱导出的愈伤组织不计数.愈伤组织继代阶段潮霉素处理试验按下述方法进行:起始材料(外植体)来自常规方法诱导10～15d 长成的愈伤组织(此时愈伤组织长成适宜大小,太小即不好操作,又不容易成活或生长慢),挑取起源于同一细胞的单个愈伤组织团,接种于按上述方法制备的含有不同质量浓度潮霉素的新鲜固体培养基上,每皿接种10个,培养条件同上,重复3次.愈伤组织死活情况可以直接观察,必要时也可采用T TC 法定量测定.1.4 细胞活性T TC 法定量测定取1mL 悬浮细胞培养液或小块愈伤组织,加入1mL 0.4%T TC 溶液,充分混匀后于室温下暗反应3～6h ,此时活细胞染成红色,死细胞不染色.观察细胞染色情况,可以初步判别细胞活性.将溶液离心,抽吸(asp irati on )上层T TC 溶液,去离子水洗涤3遍.加入5mL 的95%乙醇,置于振荡机上轻柔振荡提取T T F (三苯基甲腙)9h .12000r m 离心5～10m in ,取乙醇提取液,在分光光度仪上485nm 处测定其分光光度值,以不同比例稀释乙醇提取液,使其OD 值维持在1.0以下,空白提取液调零,重复3次.真空吸去剩余提取液,室温下自然风干24h ,称取细胞质量(愈伤组织细胞活性定量测定时,在染色前称取质量为佳).按下式估算细胞活性(cell viab ility )及死亡率(death rate ): 细胞活性=实际OD 值×稀释倍数 细胞鲜质量, 细胞相对活性=处理组细胞活性 对照组细胞活性, 死亡率=(1-细胞相对活性)×100%.表1 不同质量浓度潮霉素处理后悬浮细胞密度和相对活性 Table 1 Cell den sity and relative v i ability of A rabidop sis suspen sion with differen t Hygro m yc i n B concen tration s 测定项目不同潮霉素质量浓度的细胞密度和相对活性0m g ・L -15m g ・L -110m g ・L -125m g ・L -150m g ・L -1细胞密度0 (Λg ・mL -1)128114735638相对活性1.0000.82350.30830.00520.000 0 各处理的初始细胞密度均为1475=25.4Λg mL .2 结果与分析2.1 液体条件下拟南芥悬浮细胞对潮霉素的反应各处理潮霉素质量浓度如下:0(对照),5,10,25,50m g L .起始悬浮液细胞浓度为147Λg mL ,接种时稀释5倍.培养6d 后测定其细胞密度及相对活性,结果见表1.34第3期李建安等:拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织对潮霉素的反应由表1可知,潮霉素对拟南芥悬浮细胞有极明显的抑制作用,随着培养基中潮霉素含量的增加,其细胞密度和细胞活性均急剧下降,至25m g L 时,其细胞密度和相对活性均极低.在显微镜下进一步观察,此时存活(染成红色)的极少数细胞均为数十个到上百个细胞组成的细胞团,单细胞及小细胞团均无染色现象.据此,可以认为25m g L 是潮霉素对野生型拟南芥悬浮细胞的临界致死质量浓度.图1和图2可以进一步看出不同质量浓度潮霉素对拟南芥悬浮细胞的作用效果.随着培养基中潮霉素用量的增加,悬浮细胞密度及其相对活性均呈现先急速下降然后再缓慢下降的变化规律.图1 潮霉素对拟南悬浮细胞密度的作用效果F ig .1 The effect of Hygro m yc i n B on cell den sity ofA rabidop sis tha liana suspen sion 图2 潮霉素对拟南悬浮细胞相对活性的作用效果F ig .2 The effect of Hygro m yc i nB on relative cell v i ability of A rabidop sis tha liana suspen sion图3 潮霉素(25m gL )致死拟南悬浮细胞的动态曲线 F ig .3 The trend cell death rate of A rabidop sis tha lianasuspen sion 为了进一步了解潮霉素对拟南芥悬浮细胞的作用特性,选择试验确定的临界致死浓度(25m g L ),研究其作用效果的时间变化规律,结果见图3.由图3可知,25m g L 潮霉素能迅速杀死野生型拟南芥悬浮细胞,其中前3d 作用效果最强,第3天的死亡率就高达97.25%.本试验第5天的死亡率回落至94.73%,这可能是因为取样误差造成的,例如,若取样时大细胞团比例高,则细胞死亡率的测定值会比实际平均值低.从死亡速率上来看,第2天明显大于第1天,这可能与潮霉素渗入到细胞内相应的作用部位需要一定的时间有关.而3d 后,少量大细胞团仍能存活,可能与潮霉素尚未渗入到内部细胞或产生一定的适应性有关.根据笔者对拟南芥悬浮细胞生长特性的观察,正常培养条件下,悬浮细胞生物量快速增长时期出现在继代后2～4d ,而25m g L 潮霉素能在前两天就已将大部分细胞(81.19%)杀死,这也是25m g L 以上潮霉素处理后细胞密度非常低的原因.从本试验可知,如果利用潮霉素抗性标记进行转化子选择,25m g L 质量浓度处理3d 便可获得很好的选择效果.图4 潮霉素对拟南芥悬浮细胞愈伤组织诱导的作用效果 F ig .4 The effect of Hygro m yc i n B on callus i nduction of A rabidop sis tha liana suspen sion2.2 拟南芥悬浮细胞愈伤组织诱导阶段对潮霉素的反应将拟南芥悬浮细胞转移到固体平板培养基上,正常条件下7d 左右便能诱导出愈伤组织.各处理潮霉素质量浓度如下:0(对照),1.0,2.5,5.0,10.0m g L .平板培养7d 后统计已诱导并存活的愈伤组织数量,并以对照组数据作参照,统计愈伤组织相对诱导率(见图4).由图4可知,拟南芥愈伤组织诱导阶段对潮霉素特别敏感,在质量浓度1.0m g L 下,其相对诱导率仅为5.4%;2.5m g L 处理,就几乎不能诱导出愈伤组织(0.3%),但2.5m g L 处理的相对诱导率回升至1.6%,估计由样品误差或处理时操作误差(如潮霉素在培养基中的分布不均匀等)造成.据此,可以认为,2.5m g L 是潮霉素对野生型拟南芥愈伤组织诱导阶段细胞的临界致死质量浓度.与液体培养下相比,其临界致死44中 南 林 学 院 学 报第26卷质量浓度要低得多,仅为液体条件下25m g L 的110.2.3 拟南芥愈伤组织继代增殖阶段对潮霉素的反应表2 潮霉素处理对拟南芥愈伤组织继代增殖阶段的影响 Table 2 The effect of Hygro m yc i n B on cell v i ability of A rabidop sis tha liana at the st age of calli subculture处理浓度(m g ・L -1)继代后不同天数平均每皿愈伤组织存活数量0d 1d 2d 3d 4d 5d 6d 7d 0.010101010101010100.510109.787.765.75.71.010108.3852.72.72.31.5109.77.743.30.70.30.32.010106.33.71.30.30.302.5108.7430.3000 各处理潮霉素质量浓度如下:0(对照),0.5,1.0,1.5,2.0,2.5m g L .继代后连续7d 直接观察并统计其存活情况,结果见表2、图5.由表2、图5可知,潮霉素对拟南芥愈伤组织有极明显的抑制作用,随着培养基中潮霉素含量的增加,其抑制效果越强.从图5还可以看出,需要一定处理时间潮霉素才能充分表现其抑制愈伤组织生长的效果,处理后2～5d 抑制作用最强,5d 后存活率基本平稳,但不同的处理浓度有较大差异.1.5m g L 处理组第7天时存活率仅7%(3个重复中仅存活1例),此时1.5m g L 以上质量浓度处理组均死亡,据此,可以认为,1.5m g L 是潮霉素对野生型拟南芥愈伤组织继代增殖阶段的细胞临界致死质量浓度.图5 潮霉素处理后拟南芥愈伤组织存活率变化动态 F ig .5 The trends of surv iv i ng rate of A rabidop sis tha liana calli af tertreat m en ts of Hygro m yc i n B 3 讨 论3.1 有关液体与固体培养条件下潮霉素作用效果差异从临界致死质量浓度来看,拟南芥悬浮细胞继代培养阶段的临界致死质量浓度为25m g L ,大大高于愈伤组织诱导阶段及其增殖阶段的2.5和1.5m g L ,液体与固体培养条件下的差异极大.一般认为,液体培养更有利于拟南芥细胞增殖、生长.有研究表明,正常培养条件下,拟南芥悬浮细胞生物量可以在继代后7d 内增长4～5倍,而愈伤组织固体培养时仅能增长1～2倍;悬浮细胞继代后2～4d 便出现快速增长,而悬浮细胞铺平板后还要有很长的时间才能适应固体条件.培养条件的不同和改变,是拟南芥对潮霉素不同反应的可能原因.一般认为,每个愈伤组织起源于同一个细胞,是选择转化子的良好材料,因此,基因转化中通常在这个阶段进行抗生素抗性标记选择.然而,本研究中,愈伤组织诱导阶段拟南芥对潮霉素反应太敏感,且各重复间差异较大,内外因素偶然的波动,均可能对其实际的临界致死质量浓度产生影响,从而影响转化子的选择效率;此外,这一阶段潮霉素的抑制作用太强烈,加之从液体条件到固体条件的巨大转变,即便是真正的转化子,也很可能会在选择压力和环境压力的双重胁迫下死亡.因此,在制定选择方案时,应该将潮霉素抗性标记选择的时机提前或推后.3.2 有关野生型拟南芥对潮霉素的耐受性和适应性不同基因型材料对潮霉素的敏感性存在较大差异.例如,潮霉素对小麦愈伤组织的适宜筛选质量浓度为110m g L ,对转基因小麦后代种子筛选以140m g L 较为适宜[7];潮霉素对粳稻品种愈伤组织的筛选质量浓度以50m g L 较为适合[8];谷子组织培养不同阶段(愈伤组织、分化再生苗和根)潮霉素抗性质量浓度均在5m g L ,明显敏感,最高临界质量浓度为10m g L ;米粒的潮霉素抗性质量浓度偏高,10m g L 开始敏感,最高临界质量浓度15m g L [9];棉花转化中潮霉素的筛选浓度范围为2.5～10m g L [10].多数植物的临界致死质量浓度在40～210m g L ,比本研究获得的结果要高,这说明离体条件下拟南芥细胞更为幼嫩,对潮霉素的耐受性差,反应敏感.即使如此,本研究结果暗示,拟南芥对潮霉素尚有一定的耐受性和适应性.其一表现在不同处理质量浓度作用效果的差异上.临界致死质量浓度以下处理,较长时间内不能使所有细胞致死.在试验中观察到,液体条件下10m g L 以下潮霉素处理7d ,重新转移到不含潮霉素的新鲜培养基上,能迅速恢复生长.其二表现在不同处理时间的作用特性上.以临界致死质量浓度处理,并不能在一两天内迅速杀灭细胞,通常要3d 以上54第3期李建安等:拟南芥悬浮细胞及其愈伤组织对潮霉素的反应64中 南 林 学 院 学 报第26卷才会出现细胞死亡高峰,且此后死亡速率逐步减慢,这与一些代谢旺盛的细胞逐渐调动适应机制不无关系.4 结 论潮霉素对拟南芥悬浮细胞生长、愈伤组织诱导及其生长均有极明显的抑制作用,但作用效果和特性均有所不同.拟南芥悬浮细胞继代培养阶段、愈伤组织诱导阶段和愈伤组织增殖阶段的临界致死质量浓度分别为25、2.5、1.5m g L.当采用潮霉素抗性标记筛选转化子时,应当分别采用相应阶段的临界致死浓度作为转化子选择浓度.与此同时,潮霉素的作用效果需要一定时间才能稳定,建议选择时间在液体培养条件下不少于3d,在固体培养条件下不少于5d.否则,假阳性率会很高,从而大大加重后续转化子检测的工作量.本研究所获结论仅供确定选择浓度和制定选择方案时参考,不同的材料来源、不同的培养条件、甚至不同的载体(vecto r)等因素,其作用效果和特性均会有所不同,具体操作时应该做进一步的浓度筛选等试验.致谢:本研究是在华沙大学实验生物学研究所植物分子生物学实验室(L abo rato ry of P lant M o lecular B i o logy at the Institute of Experi m ental P lant B i o logy,Faculty of B i o logy,U niversity ofW arsaw,Po land,简称“PM BE”)完成的,A ndrzej Jerz m anow sk i教授提供材料和多方面支持,A gnieszka SokóΣ博士协助部分实验,在此一并致谢.[参 考 文 献][1] F rederick M A.A rabidop sis Genom e:A m ilestaone in p lant bi o logy[J].P lant Physical,2000,124:1451-1454.[2] M einke D W,Cherry J M,D ean C.A rabidop sis thaliana:A model p lant fo r genom e analysis[J].Science,1998,282:662-682.[3] C lough S J,Bent A F.F lo ral di p:a si m p lified m ethod fo r A grobacterium2m ediated transfo r m ati on of A rabidop sis thaliana[J].T he P lantJournal,1998,16(6):735-743.[4] V en den E lzen P J M,Tow nsend J,L ee K Y,et al.A ch i m aeric hygrom ycin resistance gene as a selectable m arker in p lant cells[J].P lantM o l.B i o l.,1985,5:299-302.[5] B loch linger K,D iggel m ann H.H ygrom ycin B pho spho transferase as a selectable m arker fo r DNA transfer experi m ents w ith h ighereukaryo tic cells[J].M o l.Cel.B i o l.,1984,4:2929-2931.[6] Glab N,L abidiB,Q in L X,et al.O lomoucine,an inh ibito r of the cdc2 cdk2k inases activity,block s p lant cells at the G1to S and G2to Mcell cycle transiti ons[J].FEBS L etters,1994,353:207-2110.[7] 奚亚军,范学科,侯文胜,等.小麦遗传转化中潮霉素适宜筛选浓度的研究[J].西北农林科技大学学报(自然科学版),2003,31(1):39-42.[8] 周玲艳,姜大刚,吴 豪,等.潮霉素和PPT对水稻愈伤组织筛选效果的比较[J].仲恺农业技术学院学报,2003,16(2):10-15.[9] 王节之,郝晓芬,郑向阳,等.谷子潮霉素抗性浓度的筛选与研究[J].华北农学报,1999,14(4):60-62.[10] 岳建雄,张慧军,张炼辉.以对潮霉素抗性为筛选标记的棉花遗传转化[J].棉花学报,2002,14(4):195-199.[本文编校:谢荣秀]。
HY5通过PIF4基因控制高温诱导的拟南芥下胚轴伸长反应
HY5通过PIF4基因控制高温诱导的拟南芥下胚轴伸长反应郑兰兰;李琛;张璟璇;兰红梦;周蒙;张勇洪【摘要】Hypocotyl phenotype of wild type,hy5,pif4 and hy5pif4 were examined under 22℃ and 30℃. qRT-PCR was per-formed to compare PIF4 expression dynamics during the time course after heat treatment in wild type and hy5 mutant. The expression level of PIF4 was increased in hy5 mutant,suggesting that HY5 repress PIF4 to regulate hypocotyl elongation. Tis-sue level analysis of PIF4::GUS promoter reporter indicates that high temperature induced expression of PIF4 occurred in cotyledon but not hypocotyl. Moreover,PIF4 homolog gene PIF5,auxin synthesis genes YUC2,Y UC3,Y UC8,and auxin response gene IA A 29 were upregulated in hy5 mutant when compare to wild type during the time course after high temperature treat-ment. These suggest HY5 regulate PIF4 mediated auxin pathway to control hypocotyl elongation under high temperature condi-tion.%考察了拟南芥野生型、hy5、pif4及hy5pif4双突变体在22℃和30℃培养下的下胚轴伸长表型;利用qRT-PCR监测PIF4基因在野生型和hy5突变体30℃处理后持续多个时间点的动态表达.结果表明,HY5通过抑制下游基因PIF4调控高温诱导的下胚轴伸长.PIF4::GUS启动子融合报告基因株系的染色结果表明,高温对PIF4转录水平的诱导主要发生在子叶而不是下胚轴.通过qRT-PCR检测PIF4同源基因PIF5,生长素合成基因Y UC2、Y UC3、Y UC8和生长素反应基因IA A 29在野生型和hy5突变体的动态表达,HY5通过调控PIF4介导的生长素通路来控制拟南芥下胚轴的伸长反应.【期刊名称】《湖北农业科学》【年(卷),期】2017(056)018【总页数】5页(P3554-3558)【关键词】拟南芥(Arabidopsisthaliana);HY5;PIF4;生长素;高温;下胚轴【作者】郑兰兰;李琛;张璟璇;兰红梦;周蒙;张勇洪【作者单位】湖北医药学院基础医学院,湖北十堰 442000;湖北医药学院基础医学院,湖北十堰 442000;湖北医药学院基础医学院,湖北十堰 442000;湖北医药学院基础医学院,湖北十堰 442000;湖北医药学院基础医学院,湖北十堰 442000;湖北医药学院基础医学院,湖北十堰 442000【正文语种】中文【中图分类】Q943.2随着全球环境温度的升高，有必要了解和研究植物反应和适应环境变化的机制。
蛋白激发子Hrip1基因在拟南芥中表达可提高植株的耐盐耐旱能力
作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2013, 39(8): 1345−1351 /zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@DOI: 10.3724/SP.J.1006.2013.01345蛋白激发子hrip1基因在拟南芥中表达可提高植株的耐盐耐旱能力彭学聪杨秀芬邱德文曾洪梅郭立华刘峥*中国农业科学院植物保护研究所 / 农业部作物有害生物综合治理重点实验室, 北京 100081摘要: hrip1是从极细链格孢(Alternaria tenuissima)代谢物中分离的一种蛋白激发子。
将蛋白激发子基因hrip1转化到拟南芥，对5个T4代转基因拟南芥株系进行分子检测, 证明hrip1基因能够在拟南芥中转录和表达。
转基因植株对盐和干旱胁迫的抗性显著增强, 75 mmol L−1 NaCl和50 mmol L−1甘露醇渗透胁迫2 d, 转基因植株种子平均相对发芽率为32.1%和77.9%, 分别比野生型的增加3.72倍和5.61倍; 150 mmol L−1 NaCl和50 mmol L−1甘露醇处理拟南芥幼苗7 d后, 转基因植株平均相对根长为81.79%和93.25%, 分别是野生型的1.53倍和1.34倍。
3周龄的转基因植株在250 mmol L−1 NaCl条件下胁迫20 d, 平均存活率为67%, 显著高于野生型(42%)(P<0.05); 干旱胁迫25 d后, 复水5 d转基因植株平均存活率为72%, 而野生型仅为44%。
检测结果显示转基因植株叶片的抗氧化酶活性明显高于野生型, 用200 mmol L−1 NaCl和200 mmol L−1甘露醇处理24 h后, POD活性分别比野生型植株提高1.56倍和1.85倍, CAT活性分别比野生型植株提高1.64倍和1.86倍。
说明蛋白激发子hrip1基因在拟南芥中的表达能够改善和提高植株的耐盐抗旱能力。
拟南芥在植物抗病性分子机制研究中的作用
根据对抗病基因的蛋白产物结构分析， 有人将其 分成七组。第一组只有一个成员， 即 Ｐｔｏ， 是从番茄克 隆得到的。此蛋白具有苏氨酸 ／ 丝氨酸激酶催化结构 域和肉豆蔻醇酰化基元［３０］。第二组的成员最多， 来自各 种植物的 Ｒ 基因产物， 其蛋白有富含亮氨酸重复的结 构域（ ＬＲＲ） 、核苷酸结合域（ ＮＢＳ） 和 Ｎ－ 末端亮氨酸拉 链（ ＬＺ） 或卷曲螺旋（ ＣＣ） 。第三组与第二组相似， 但其 Ｎ－ 末端是 Ｔｏｌｌ 和白介素 －１ 受体（ ＴＩＲ） 。这几组的蛋白 质均位于细胞质中。第四组以番茄 Ｃｆ 蛋白为代表， 其 胞外有一个 ＬＲＲ 结构域、一个跨膜的结构域和一个胞 质尾， 这类蛋白被称为类受体蛋白。第五组成员是来自 拟南芥的 ＦＬＳ２ 和水稻的 Ｘａ２１ 蛋白。这类蛋白具有胞 质苏氨酸 ／ 丝氨酸激酶结构域、胞外的 ＬＲＲ 结构域和 跨膜域， 被称为类受体激酶。第六组是拟南芥的两个 ＲＰＷ８ 基因编码的蛋白， 为一个 Ｎ－ 端锚定在膜内的小 胞质蛋白， 并含有 ＣＣ 结构［３１］。第七组为 Ｒｐｇ１ 蛋白， 从 大麦中分离得到。是完全的胞质蛋白， 没有固定在膜 上， 含有两个串联的蛋白激酶结构域［３２（］ 图 １） 。
植物保护科学
中国农学通报 第 ２２ 卷 第 ５ 期 ２００６ 年 ５ 月 ｈｔｔｐ：／／ｚｎｔｂ．ｃｈｉｎａｊｏｕｒｎａｌ．ｎｅｔ．ｃｎ
·３５９·
发生亲和 ／ 或不亲和反应都取决于双方的基因型［１］。 弗洛从遗传学的概念上证明了 Ｒ 基因的存在， 但
植物蛋白激酶MAPK及其在病原信号传导中的作用
植物蛋白激酶ＭＡＰＫ及其在病原信号传导中的作用【摘要】：植物蛋白激酶在信号传递过程中越来越受到关注。
促细胞分裂剂激活性蛋白激酶（MAPK）是一类存在于各种真核生物体中的丝氨酸/苏氨酸型蛋白激酶。
它被上游激活因子MAPKK磷酸化而激活，并通过将底物蛋白上的丝氨酸和苏氨酸残基磷酸化而传递信号。
它与其他一些信号分子组成MAPK级联信号通路，接受外界刺激信号，将信号转入细胞内，影响特定基因的表达，它的作用受到不同因子的调节。
文章主要介绍了植物体中的MAPK的结构特点、分类以及其在病原信号传导中的作用。
【关键词】：植物蛋白激酶；MAPK；MAPK级联；信号传导蛋白质的磷酸化与去磷酸化过程是生物体中普遍存在的一种调节机制,几乎涉及所有的生理和病理过程,如糖代谢、细胞的生长发育、光合作用、基因表达、神经递质的合成与释放、不良环境的适应、甚至癌变等等,它在细胞信号转导中起重要作用[1] 。
蛋白质的磷酸化作用由蛋白激酶催化,这方面的研究最初集中在酵母和动物领域,植物蛋白激酶的研究起步较晚,但近年来发展很快。
1. 植物蛋白激酶的类型迄今已从拟南芥、烟草、小麦、玉米、水稻、黑麦、燕麦、豌豆、大豆、苜蓿、菠菜、番茄、苹果、土豆和十字花科等的植物中发现许多蛋白质激酶或其基因。
根据hanks 和hanter以及stone和walker的分析，可把这些酶归入4类蛋白质激酶之中（表1），但目前尚未在植物体系中发现第Ⅳ类蛋白质激酶。
表1 植物蛋白质激酶特性及可能作用2. MAPK的结构特点和分类植物MAPK 级联激酶的研究开始于90 年代初,但近几年发展很快[2] ,现已在植物中发现了大量MAPK家族成员,而且在植物中识别出的MAPK数量比在动物和酵母中还多,不少编码MAPK和一些编码MAPKK与MAPKKK的基因也已从植物中分离到。
MAPKs是一类丝氨酸，苏氨酸fSer，r1蛋白激酶．广泛存在于真核生物中。
与一些其他的信号分子组成MAPK级联途经。
激发子——植物过敏反应的信使
激发子——植物过敏反应的信使摘要：激发子(elicitor)是在植物原生质膜能和特异高度亲和的蛋白质受体结合从而诱导植物产生任何防卫反应的分子。
本文通过对激发子的阐述其分子机理的降解，对激发子这个概念有了全局的表述。
而且，简要描叙了激发子所介导的经典信号转导途径，在进化上具有一定和高等哺乳动物的免疫途径类似的特点。
关键词：激发子防卫反应蛋白质受体信号转导一、激发子概念简述凡是能与原生质膜上存在着其特异高度亲和的蛋白质受体结合从而诱导植物产生任何防卫反应的分子统称激发子。
激发子据其来源可分为生物激发子和非生物激发子。
前者指来自病原物、非病原物、寄主植物和非寄主植物的能够诱导植物产生防卫反应的物质，特别是从真菌菌丝细胞壁或培养滤液中提取的激发子。
非生物激发子包括一些非生物来源的化合物。
迄今为止，已鉴定了许多来自病原菌的激发子，按其化合物性质可以分成寡糖类、糖肽和糖蛋白类、多肽和蛋白类(Hahn，1996)。
目前在植物和其病原菌互作系统中已发现了许多蛋白和多肽类激发子，其中包括疫霉和腐霉属分泌的激发素(elicitin)、木聚糖酶以及与寄主单个显性抗病基因相对应的病原菌专化性无毒基因产物无毒蛋白等(王源超和李德葆，1999)。
科学研究中，最重要的的激发子是激发素(elicitin)。
它是疫霉属(Phytophthora)和腐霉属(Pythium)的植物病原卵菌产生的、在烟草上引起过敏反应和系统获得抗性的小分子量的胞外蛋白。
二、激发子与过敏反应过敏反应(hypersensitive response，HR)是植物最常见的抗病表现形式之一。
过敏反应的特征是在被侵染的寄主组织局部变褐，被感染细胞及其周围一部分细胞死亡，形成枯斑，从而可阻止病原物的进一步扩散。
这种局部的过敏性反应通常可激发整个植株产生系统获得性抗性(Systemic acquired resistance，SAR)，从而使植物体获得一定时期内对多种病原物的广谱抗性(Kombrink and Schmelzer，2001)。