高性能CdTeCdS核壳型量子点的制备及应用于小麦面粉中呕吐毒素的荧光免疫检测

2011年第69卷化学学报V ol. 69, 2011第6期, 687～692 ACTA CHIMICA SINICA No. 6, 687～692zaijunli@.*E-mail:Received July 30, 2010; revised October 9, 2010; accepted November 10, 2010.国家自然科学基金(Nos. 20771045)、国家高技术计划“863” (No. 2007AA10Z428)、浙江省自然科学基金(No. Y407321)和江苏省“青蓝工程”资助项目.688化学学报V ol. 69, 2011value of CdTe/CdS quantum dots-antibody complex deposited different time at 4 ℃ were measured before and after imcubated with deoxynivalenol. The results showed that the antibody can remain good stability at least 7 d. Based on the high performance of glutathione stabilized CdTe/CdS quantum dots, we developed a novel method for determination of deoxynivalenol by fluoroimmunoassay in the work. When concentration of deoxynivalenol is in the range from 0 to 0.9 ng•mL－1, its relative luminescent intensity has a good linear range relationship against the concentration of deoxynivalenol with a 0.9992 of the correlation coefficients (R2), and the detection limit was found to be 0.038 ng•mL－1, that is obviously better than other methods in literatures such as GC-ECD, HPLCand HPLC-MS. Proposed method has been successfully applied to de-oxynivalenol analysis in real wheat.Keywords CdTe/CdS quantum dots; deoxynivalenol; fluoroimmunoassay; glutathione; wheat flour呕吐毒素是一种主要由禾谷镰刀菌和大刀镰刀菌产生的B型单端孢酶烯族化合物[1]. 1972年, 日本Morooka等[2]首先从发霉的大麦中分离出呕吐毒素, 后来人们相继在谷类作物和粮食制品中也发现呕吐毒素, 目前世界各地均有呕吐毒素污染的报道. 呕吐毒素能抑制蛋白、DNA和RNA的合成, 对人和动物有广泛的毒性效应[2]. 动物实验表明, 摄入了被呕吐毒素污染的食物或饲料后, 将导致厌食、呕吐、腹泻、发烧、站立不稳、反应迟钝等急性中毒症状, 严重时可能损害造血系统而造成死亡[3]. 由于呕吐毒素强的毒性, 世界各国都高度重视对呕吐毒素的监控, 并制定出严格的限量标准.目前, 测定痕量呕吐毒素的方法主要是薄层色谱法(TLC)[4], 酶联免疫吸附法(ELISA)[5], 气相色谱法(GC)[6], 气相色谱-质谱联用(GC-MS)[7], 高效液相色谱(HPLC)[8], 高效液相色谱-质谱联用(HPLC-MS)[9], 电化学检测等[10]. 在这些方法中, TLC操作简单, 曾被广泛应用, 但方法灵敏度差, 样品前处理的工作量大, 且需要使用大量的有机溶剂. ELISA具有快速、灵敏、简便, 适合大批量样品的筛检等特点, 因此发展十分迅速, 但因免疫所使用的酶活性不稳定, 在实际操作过程中易受条件的影响, 出现误判. GC和HPLC是目前检测呕吐毒素最常用的方法, 能完成样品中痕量的呕吐毒素的定性定量分析. 由于GC和HPLC分析对样液的纯度要求高, 往往需要进行繁杂的样品净化处理. GC-MS和HPLC-MS具有非常好的灵敏度和选择性, 是目前最为理想的分析方法, 但它们需要昂贵的仪器设备和熟练的操作人员. 电化学检测法快速、灵敏, 但抗干扰性仍须改进. 量子点荧光免疫法是将免疫反应的特异性和荧光检测的高灵敏度相结合而发展起来的一种新的分析方法, 它突出的选择性和灵敏度引起人们极大的关注.量子点荧光免疫法是基于量子点修饰的抗体与分析物结合后产生的荧光强度改变进行定量检测, 这要求所使用的量子点必需有非常高的量子产率, 所联接的抗体具有良好的稳定性. 因此, 制备高性能的量子点和改善其亲生物性是量子点荧光免疫法的两个重要研究课题. 水相制备的量子点, 因方法简单、成本低廉、绿色安全和所制得的量子点具有水溶性好的优势成为目前量子点合成的主要方法[11]. 然而, 水相制备的量子点量子产率相对较低. 人们发现, 在量子点表面修饰一层宽带隙的无机材料壳层, 可以消除量子点表面上的大量非辐射复合中心, 从而大大提高量子点的发光效率, 如CdTe/CdS核壳结构的量子点[12～15]. 与有机合成法相比, 水相制备CdTe/CdS核壳型量子点的报道相对较少, 而且工作集中在提升量子点的光谱性质, 很少关注核壳型量子点的稳定性和生物相容性[16 ].我们的目的是水相制备高性能的CdTe/CdS核壳型量子点, 并将其应用于痕量呕吐毒素的快速检测. 研究表明, 以谷胱甘肽稳定的CdTe/CdS核壳型量子点在发光效率、稳定性和亲生物性方面均显著优于巯基乙酸. 基于该量子点的呕吐毒素免疫荧光法具有很好的灵敏度和重现性, 已成功应用于小麦面粉样品中痕量呕吐毒素的测定.1 实验部分1.1 主要试剂及仪器谷胱甘肽、CdCl2•5H2O、硼氢化钠(纯度＞96%)、碲粉(纯度99.9%)和牛血清蛋白购于国药集团化学试剂有限公司. 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)购于Alfa Aesarh公司.2.0 mmol•L－1磷酸缓冲溶液(PBS, pH7.4)由NaHPO4• 12H2O-KH2PO4•2H2O配制. 实验用水均为二次蒸馏水, 由普通蒸馏水再经高纯石英亚沸蒸馏器蒸馏制得. 呕吐毒素购于Sigma公司. 呕吐毒素抗体按文献的方法制备[17].恒温气浴振荡器(THZ-82B), RF-5301型荧光分光光No. 6 杨淑平等：高性能CdTe/CdS核壳型量子点的制备及应用于小麦面粉中呕吐毒素的荧光免疫检测研究689度计(日本岛津), JEM-2100 (HR)透射电子显微镜(JEOL), DZF-6020型真空干燥箱(上海新苗), 调速多用振荡器(金坛医疗仪器总厂), 80-2离心沉淀器(金坛医疗仪器总厂).1.2 CdTe/CdS核壳型量子点的制备在10 mL的三角烧瓶中, 依次加入0.1 mmol Te粉、0.3 mmol NaHB4、3 mL无水乙醇和1 mL蒸馏水, 通氮气15 min后密封, 将其转移至恒温气浴振荡器中, 在40 ℃下反应, 直至Te粉完全消失, 制得NaHTe(上层清液). 加100 mg固体CdCl2至250 mL的三口烧瓶, 用200 mL 水将其溶解, 加入270 mg谷胱甘肽(GSH), 磁力搅拌20 min, 用1 mol•L－1的NaOH溶液调节溶液的pH为8.5～9.0, 在剧烈搅拌下快速加入上述新制的NaHTe, 溶液颜色由无色变成橙黄色. 装上冷凝管, 升温到100 ℃回流反应1 h得到CdTe量子点溶液. 在此量子点溶液中加入异丙醇使其沉淀析出, 然后离心分离. 固体CdTe置于真空干燥箱中避光保存[18].先将固体CdTe分散于200 mL含有Cd2＋和GSH的溶液(Cd2＋: 2.0 mmol•L－1, GSH: 4.4 mmol•L－1, pH 9.0), 在磁力搅拌下慢慢滴加与CdTe等摩尔的硫代乙酰胺溶液. 加毕, 升温至100 ℃回流反应1 h制得CdTe/CdS核壳型量子点溶液. 制得的CdTe/CdS核壳型量子点用过量异丙醇沉淀, 离心, 重复以上操作3次. CdTe/CdS核壳型量子点置于真空干燥箱中避光保存备用.1.3 量子点-抗体的共价偶联取150 µL谷胱甘肽稳定的CdTe/CdS量子点(5× 10－4 mol•L－1)水溶液, 加入10 µL的EDC/NHS磷酸缓冲溶液(pH 7.4). 在室温下于气浴振荡器中反应45 min后, 加入呕吐毒素抗体, 再反应 2 h[19]. 最后, 加入浓度为1%的BSA对CdTe/CdS量子点修饰的抗体封闭.1.4 呕吐毒素的免疫及荧光检测在200 µL量子点-抗体偶联物溶液中, 加入呕吐毒素标准样品或样品溶液后在37 ℃下恒温振荡孵育2 h, 用磷酸缓冲溶液稀释至总体积3.5 mL, 摇匀, 倒入1 cm 的石英比色皿中, 在RF-5301型荧光分光光度计选择激发波长为350 nm测定575 nm处的荧光强度或在460～660 nm之间进行荧光光谱扫描.2 结果与讨论2.1 制备条件选择与优化考察了硫源、壳/核摩尔比和稳定剂种类对CdTe/CdS量子点核壳型的荧光性质影响. 分别以硫代乙酰胺和硫化钠为硫源在CdTe裸壳量子点的外面包覆CdS壳层制备出CdTe/CdS核壳型量子点, 它们的荧光光谱列于图1. 图1显示, 以硫代乙酰胺为硫源制得的CdTe/CdS量子点的荧光光谱尖而强, 在595 nm处有一个最大荧光发射峰. 然而, 以硫化钠作为硫源的CdTe/ CdS量子点, 它的荧光光谱形状呈平而低, 出现两个荧光发射峰位. 以上事实说明以硫代乙酰胺为硫源制得的CdTe/CdS量子点的粒径小且相对均匀, 具有较高的发光效率. 产生以上不同结果的原因是由于两种硫源在水溶液中释放S2－速度上存在显著差异造成的. 硫代乙酰胺在水溶液中是通过水解缓慢释放出S2－离子. S2－取代CdTe量子点表面上的稳定剂分子后与吸附在其表面的Cd2＋反应形成CdS壳层, 这种核壳型量子点的荧光光谱上只有一个核壳型量子点的发射峰. 不同于硫代乙酰胺, 硫化钠在水中完全离解成S2－和Na＋, S2－与溶液中的Cd2＋快速反应产生大量新的CdS核, 最终的CdTe/CdS产品实际是CdTe和CdS两种核的混合体, 因此它的荧光光谱中有两个独立的发射峰(分别对应于两种不同核的量子点). 因此, 硫代乙酰胺被选择作为硫源制备发光效率高的CdTe/CdS核壳型量子点.图1不同硫源制备的CdTe/CdS 量子点的荧光光谱Figure 1 Fluorescence spectra of CdTe/CdS quantum dots syn-thesized using thioacetamide (a) and Na2S (b) as sulfur source不同壳(CdS)/核(CdTe)摩尔比制备的CdTe/CdS量子点的荧光光谱图列于图2. 从图2可知, 壳/核物质的量比是影响CdTe/CdS核壳型量子点荧光强度的重要因素. 随着n(CdS)∶n(CdTe)物质的量比的增大, CdTe/CdS 量子点的荧光强度反而会降低. 这是由于当溶液中存在过多的S2－, 会使CdTe/CdS量子点表面的S2－增多, 形成新的缺陷[20]. 此外, 过多S2－的存在也可能对体系的荧光有一定的猝灭作用. 因此, 实验中CdS/CdTe物质的量比选择为1∶1.以巯基乙酸和谷胱甘肽为稳定剂制备的CdTe/CdS 量子点的荧光光谱列于图3. 从图3可以看出, 谷胱甘肽690化 学 学 报 V ol. 69, 2011图2 不同CdS ∶CdTe 物质的量比制备的CdTe/CdS 量子点的荧光光谱图Figure 2 Fluorescence spectra of CdTe/CdS quantum dots syn-thesized using different CdS to CdTe molar ratio, (a) 1∶1, (b) 2∶1 and (c) 3∶1为稳定剂明显优于巯基乙酸. 谷胱甘肽为稳定剂的量子点荧光强度是巯基乙酸为稳定剂的量子点的1.5倍以上. 这是由于谷胱甘肽比巯基乙酸具有更长的碳链, 能对CdTe/CdS 核壳量子点进行更好的包覆和修饰, 从而提高其发光性能.图3 巯基乙酸(a)和谷胱甘肽(b)稳定的CdTe/CdS 量子点的荧光光谱Figure 3 Fluorescence spectra of CdTe/CdS quantum dots syn-thesized using thioglycolic acid (a) and glutathione (b) as stabi-lizer2.2 形貌及光学性质采用透射电镜对以谷胱甘肽为稳定剂制备的CdTe/CdS 核壳型量子点以及它与抗体形成的共价偶联物的形貌进行分析, 结果列于图 4. 从图4(a)中可以看出, CdTe/CdS 量子点分散性较好, 尺寸分布较为均匀, 近似球形, 粒径为10～20 nm 左右. 图4(b)显示, 抗体被量子点修饰后其粒径CdTe/CdS 量子点稍有增大, 这说图4 CdTe/CdS 核壳量子点(a)和量子点-抗体偶联物(b)的透射电镜图Figure 4 TEM image of CdTe/CdS core/shell quantum dots (a) and the quantum dots combined with antibody (b)明CdTe/CdS 量子点已经与抗体发生了共价连接, 形成了偶联复合物.以谷胱甘肽为稳定剂制备的CdTe 和CdTe/CdS 量子点的荧光光谱列于图5. 从图5可以看出, CdTe 量子点经过包覆CdS 壳层形成核-壳结构后, 荧光强度大大增强, CdTe/CdS 量子点的最大荧光强度是CdTe 量子点最大荧光强度的6倍多. 这是由于裸核CdTe 量子点的图5 CdTe (a)和CdTe/CdS (b)量子点的荧光光谱Figure 5 Fluorescence spectra of CdTe (a) and CdTe/CdS (b)No. 6杨淑平等：高性能CdTe/CdS 核壳型量子点的制备及应用于小麦面粉中呕吐毒素的荧光免疫检测研究691表面缺陷比较多, 用带隙较宽的半导体材料CdS 进行包覆, 能钝化CdTe 量子点表面缺陷, 降低非辐射跃迁几率, 从而增强荧光强度.量子点的荧光强度稳定性直接影响到测定结果的重现性. 为了研究谷胱甘肽修饰的CdTe 量子点和CdTe/CdS 核壳量子点的荧光稳定性, 我们取相同浓度谷胱甘肽稳定的CdTe 量子点和CdTe/CdS 核壳量子点在365 nm 的紫外灯下照射, 间隔1 h 取样检测荧光强度, 然后绘制荧光强度保持率与时间的关系曲线. 从图6清楚地显示, 经过5 h 照射后裸核CdTe 量子点荧光强度仅剩初始值的13%, 下降了87%, 而CdTe/CdS 核壳量子点下降43%. 与CdTe 量子点相比, CdTe/CdS 核壳量子点荧光稳定性高出2倍. 因此, CdTe/CdS 核壳型量子点的抗光氧化的能力要比裸核CdTe 量子点强, 具有较好的稳定性.图6 CdTe (a)和CdTe/CdS (b)量子点的稳定性Figure 6 The stabilities of the CdTe (a) and CdTe/CdS (b)2.3 抗体稳定性抗体与量子点共价偶联后抗体是否稳定, 这对后面的荧光免疫检测尤为重要, 也是影响量子点荧光检测法能否被广泛应用的最关键因素之一. 实验中, 我们采用在量子点-抗体偶联复合物中加入抗原, 进行抗体抗原间特异性反应, 根据免疫前后荧光强度变化值, 以此来判断抗体的稳定性. 图7是在4 ℃下保存不同时间的量子点-抗体偶联物与相同浓度呕吐毒素免疫后的相对荧光强度变化情况. 从图7可以看出, 谷胱甘肽修饰的CdTe/CdS 量子点与抗体共价偶联后, 在7 d 之内, 相对荧光强度下降很少, 这一结果与未标记的抗体相当. 这一事实提示CdTe/CdS 量子点具有良好的亲生物性. 一方面, 由于谷胱甘肽碳链较长, 减少了量子点对抗体尤其是活性位点处的空间构型影响, 从而大大提高抗体的稳定性. 另一方面, 以谷胱甘肽为稳定剂制得的核壳 CdTe/CdS 量子点表面有大量的羧基, 在交联剂(EDC/NHS)的作用下量子点表面的羧基能与抗体的氨基发生化学反应生成酰胺键, 从而以共价键的方式实现两者的连接. 与静电吸附相比, 这种共价偶联的方式会使量子点与生物分子这两者之间结合更牢固, 不易脱落.图7 抗体的稳定性Figure 7 The stability of the antidoy2.4 分析特征分别配制一系列不同浓度的呕吐毒素标准溶液, 按1.4节所述的实验方法操作测定荧光光谱或在575 nm 处的荧光强度, 然后, 以免疫前后荧光强度的减少值为纵坐标, 呕吐毒素浓度为横坐标绘制工作曲线(图8). 从图8可以可知, 呕吐毒素的浓度在0～0.9 ng•mL －1之间,荧光强度的减少值与呕吐毒素浓度符合线性关系, 回归方程为: △F ＝6.8216C (ng•mL －1) (△F 为免疫前后在575 nm 处的荧光强度之差值, C 是呕吐毒素浓度), 相关系数0.9992, 检测限为0.038 ng/mL. 方法的灵敏度高于文献报道的其它方法, 如GC-ECD (2.0 ng•g －1)[21]、HPLC图8 工作曲线Figure 8 Calibration curveThe concentration of deoxynivalenol (a →m) are 0.0, 0.142, 0.286, 0.571, 0.857, 1.43, 2.0, 2.57, 3.71, 4.29, 5.71, 8.571, 11.43 (ng•mL －1)692化学学报V ol. 69, 2011(380 ng•g－1)[22]、HPLC-MS (0.39 ng•g－1) [23]和HPLC-MS-MS (1.1 ng•g－1) [24].2.5 小麦面粉中呕吐毒素测定分别称取5 g购于超市来自不同产区的小麦面粉,加入25 mL乙腈-水溶液[V(乙腈)∶V(水)＝21∶4], 置于摇摆振荡器振荡45 min, 过滤, 去掉残渣, 将所得的滤液用活性炭柱净化处理, 收集滤液并定容. 取出部分滤液按1.4节所述的实验方法操作测定575 nm处的荧光强度, 然后将相对荧光强度代入线性回归方程得呕吐毒素的浓度, 再计算出小麦面粉中呕吐毒素的含量, 结果列于表1. 从表1可知, 呕吐毒素加标回收率在95%～103%之间, 表明方法具有高的准确度.表1小麦面粉中呕吐毒素的测定结果(n＝5)Table 1 Results for determination of deoxynivalenol in wheatflour (n＝5)Sample Added/(ng•g－1) Found/(ng•g－1) Recovery/%RSD/%Sample 1 0.010.033.0243.3 102.8 3.3Sample 2 0.0100.0105.68206.0 100.4 4.0Sample 3 0.0100.0286.06385.2 99.1 3.9Sample 4 0.010.010.3220.44 101.2 5.2Sample 5 0.0100.0157.31260.1 102.8 4.23 结论用带隙较宽的半导体材料CdS包覆CdTe量子点, 钝化了CdTe量子点表面缺陷, 降低非辐射跃迁几率, 使CdTe/CdS核壳量子点的荧光强度和稳定性显著提高. 谷胱甘肽作为稳定剂的CdTe/CdS量子点, 易与呕吐毒素抗体结合生成稳定的共价偶联物. 因谷胱甘肽碳链较长, 减少了量子点对抗体尤其是活性位点处空间构型的影响, 量子点标记的抗体仍保持高的活性和稳定性. 基于高性能CdTe/CdS核壳量子点的呕吐毒素荧光免疫法表现了突出的重现性和灵敏度, 可广泛应用于食品等样品中痕量呕吐毒素的常规分析.References1Müller, H. 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