分子克隆全过程
分子克隆的基本步骤
分子克隆的基本步骤嘿，各位科学小达人，今天咱们就来聊聊分子克隆的基本步骤，这可是实验室里的“高级魔术”，我保证，听完我的讲解，你也能变成一个“DNA巫师”。
首先，得准备好我们的“魔法材料”，也就是那些瓶瓶罐罐里的“液体宝贝”。
什么“PCR试剂”、“限制酶”、“连接酶”啦，这些都是我们“克隆大业”的必备良药。
第一步，来个“DNA热舞派对”，也就是PCR扩增。
把我们的目标DNA扔进“PCR机器”里，让它跟着高温曲线一起“热舞”，直到它“子孙满堂”，复制出成千上万的DNA副本。
第二步，给DNA来个“精致修剪”，这就是传说中的“酶切反应”。
我们用限制酶这个“分子剪刀”把DNA切成我们想要的形状，这可是个精细活儿，稍微手一抖，就可能变成“DNA碎片”。
接下来，是“DNA联姻”环节，也就是“连接反应”。
我们把修剪好的DNA片段和载体DNA“牵线搭桥”，让它们在连接酶的“见证”下，成为“一家人”。
这就像是在实验室里举办了一场“分子婚礼”。
然后，是“细胞变身”时间，也就是“转化反应”。
我们把连接好的DNA“送入”细菌细胞，让它们变成“DNA搬运工”。
这个过程就像是在细胞界搞了一场“特工行动”。
紧接着，得来个“D NA身份验证”，也就是“筛选转化子”。
我们把这些“可能怀孕”的细胞放在含有抗生素的培养基上，只有那些成功“怀孕”的细胞才能存活下来，这就像是在玩“细胞版”的“谁是卧底”。
最后，我们要进行“DNA产前检查”，也就是“DNA测序”。
通过测序，我们可以确认我们的克隆是否“健康成长”，没有出现“基因突变”这类“家庭悲剧”。
总之，分子克隆这事儿，听起来高大上，其实就是一场实验室里的“魔法表演”。
只要掌握了这些“咒语”和“魔法棒”，你也能在DNA的世界里，玩转“克隆大法”。
别忘了，每个科学家心里都住着一个小巫师，分子克隆，只是我们施展魔法的一部分！。
分子克隆
3.与反转录相关的PCR扩增
RT-PCR（reverse transcriptase-PCR,RT-PCR): 又称反转录PCR, 是以反转录的cDNA作模板所进行的PCR，
可对基因的表达和序列多态性分析。
ＲＴ－ＰＣＲ
反转录
逆转录酶
AAAnA mRNA
AAAnA
T T TnT
cDNA第一链
ＤＮＡ聚合酶 cDNA
目的基因的获取-----PCR技术:
定义： PCR技术又称聚合酶链式反应（polymerase chain reaction)，是通过模拟体内 DNA 复制的 方式，在体外选择性地将 DNA 某个特殊区域扩 增出来的技术。
Taq DNA多聚酶的发现
Heat-stable polymerase is vital to the ease of the process…
4.PCR反应程序
⑴94~96℃ ⑵94℃ ⑸ 25- ⑶50-60℃ 35个循 ⑷72℃ 环 ⑹72℃ ⑺4-10℃ 30’’-3’ 预变性（使模板DNA充分变性） 30’’ 变性 30’’-1’ 复性（使引物与模板充分退火） n’(按1’扩增1kb计算）延伸 3-7’ 总的延伸（使产物延伸完整） 保存
质粒自身含有复制起始点，与相应的顺式调控元件组成一个复制子(replicon)， 能利用细菌的酶系统进行独立的复制及转录。质粒具有多种遗传选择标记， 包括各种抗药基因或营养代谢基因等。
氨苄青霉素抗性(ampicillin resistance，ampr)基因：
此基因编码ß 内酰胺酶，该酶能 水解氨苄青霉素ß —内酰胺环，使之 失效而使细菌产生耐药。
1988年Saiki 等从温泉 （ Hot spring）中分离 的一株水生嗜热杆菌 (thermus aquaticus) 中提取到一种耐热DNA 聚合酶。
分子克隆的步骤及原理
分子克隆的步骤及原理分子克隆是利用重组DNA技术复制特定的DNA片段并将其插入到另一个DNA分子中的过程。
它是许多生物学和医学研究中常用的技术，例如用于研究基因结构和功能、制备重组蛋白以及研发基因治疗等。
第一步是选择并提取目标DNA片段。
一般情况下，需要从生物体中提取DNA，例如通过PCR扩增或酶切来获取所需片段。
PCR是一种酶链反应技术，通过引物引导DNA的聚合酶在一系列温度循环中合成DNA。
酶切是利用限制性内切酶切割特定的DNA序列来获得目标DNA片段。
第二步是将目标DNA片段插入载体DNA中。
载体DNA是一段能够自主在细胞中复制的DNA分子。
常用的载体包括质粒和噬菌体。
目标DNA片段需要与载体DNA进行连接，形成重组DNA。
连接主要通过DNA连接酶的作用，与连接酶反应的连接体包括连接酶本身、大肠杆菌DNA连接酶I（T4 DNA连接酶由细菌染色体T4噬菌体中提取的）、T4 ligation buffer （限制性内切酶的缓冲液通用成分+乙醇和内切酶）。
连接后的重组DNA 可以通过转化作用导入到宿主细胞中。
第三步是将重组DNA导入宿主细胞。
转化是将外源的DNA片段导入到细胞中的过程。
常用的转化方法包括化学转化和电转化。
化学转化是通过改变细胞的物理状态和细菌细胞表面的荷电状态，使其能够非特异性地吸附DNA质粒。
电转化则是通过电场作用使DNA穿透细胞膜，进入细胞。
最后一步是筛选和分离重组的细胞。
由于重组细胞中带有插入的目标DNA片段，因此可以通过筛选技术来判断哪些细胞中含有目标DNA。
常用的筛选方法包括抗生素耐药筛选和荧光蛋白筛选。
在抗生素耐药筛选中，重组细胞会在含有特定抗生素的培养基中生长，而未转化的细胞则会被抑制。
在荧光蛋白筛选中，以荧光蛋白为报告基因，使转化的细胞能够呈现出荧光信号。
分子克隆的原理主要依赖于DNA的重组和复制。
DNA连接酶通过其黏末端连接酶活性，可以将目标DNA片段连接到载体DNA中形成重组DNA。
分子克隆基本流程及技术原理
分子克隆基本流程及技术原理分子克隆是一种重要的实验技术，可用于制备大量的DNA和蛋白质，探索基因功能，研究生物学过程等。
其基本流程包括DNA片段选择、PCR 扩增、限制性内切酶切割、连接、转化和筛选等步骤。
以下将详细介绍分子克隆的基本流程及技术原理。
PCR扩增：接下来，使用聚合酶链反应（PCR）技术扩增DNA片段。
PCR是一种有效的DNA扩增方法，它通过反复复制DNA模板，生成大量的DNA片段。
PCR反应基本包括三个步骤：变性、引物结合和扩增。
-变性：将DNA模板加热至95°C，使其两个链分离，得到单链DNA。
-引物结合：将反应体系温度下调到适宜的引物结合温度，引物与DNA模板的互补序列结合，形成DNA-DNA复合物。
-扩增：在一定的温度下，聚合酶通过DNA-DNA复合物进行扩增。
扩增过程包括DNA链合成、DNA链延长、DNA链分离和DNA链结合。
多次循环后，可以得到大量的目标DNA片段。
限制性内切酶切割：在PCR扩增后，可选用特定的限制性内切酶切割目标DNA片段。
内切酶是一种具有特异性的酶，它能够在特定的DNA序列上切割产生特定的片段。
通过切割，可以克隆所需的片段，并在连接过程中提供黏性末端。
连接：将目标DNA片段与载体DNA（如质粒）连接起来。
连接可采用多种方法，如T4DNA连接酶方法、PCR重叠延伸法等。
连接时，需要确保目标DNA片段与载体DNA能够互补配对，并生成稳定的连接。
转化：将连接后的混合物转化到宿主细胞中。
转化可通过化学方法（如钙离子转化法）或生物方法（如细菌电穿孔法）实现。
转化后，将细胞培养在含有适当选择压力（如抗生素）的培养基中，这样只有转化成功的细胞才能存活。
筛选：根据实验目的选择合适的筛选方法。
通常，使用抗生素抗性标记和荧光蛋白等进行筛选，以识别并纯化所需克隆产物。
技术原理：-PCR技术：PCR技术是通过DNA聚合酶的模板依赖性合成，将DNA片段按特定序列进行扩增。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册【最新版】目录1.分子克隆技术的概念2.分子克隆技术的操作步骤3.分子克隆技术的应用4.分子克隆技术的优缺点正文一、分子克隆技术的概念分子克隆技术是一种生物技术方法，用于在体外将各种来源的 DNA 片段进行拼接组合，形成新的 DNA 分子。
这种技术可以在短时间内大量复制特定 DNA 序列，为基因工程、生物制药等领域提供重要的研究手段。
二、分子克隆技术的操作步骤分子克隆技术主要包括以下几个操作步骤：1.提取 DNA：从实验材料中提取 DNA，并通过特定方法进行纯化。
2.切割 DNA：使用限制性内切酶将 DNA 切割成特定大小的片段。
3.链接 DNA：将切割好的 DNA 片段通过 DNA 连接酶进行拼接组合。
4.转化细胞：将拼接好的 DNA 分子转化到受体细胞中，让细胞表达新的 DNA 序列。
5.筛选克隆：通过特定筛选方法，选出含有目标 DNA 序列的克隆细胞。
三、分子克隆技术的应用分子克隆技术在生物领域有广泛的应用，主要包括：1.基因工程：通过分子克隆技术，可以对特定基因进行拼接组合，研究基因的功能和调控关系。
2.生物制药：利用分子克隆技术，可以大量生产具有特定功能的蛋白质，用于药物研发和生产。
3.基因诊断：通过分子克隆技术，可以制备特定基因片段作为诊断试剂，用于疾病的早期诊断。
4.基因治疗：将正常或功能性基因通过分子克隆技术导入患者细胞，以治疗遗传性疾病。
四、分子克隆技术的优缺点分子克隆技术的优点包括：操作简便、效率高、可大量制备特定 DNA 序列。
但其缺点是：可能产生非特异性拼接、克隆产物可能不稳定、需要使用有毒的化学试剂等。
总之，分子克隆技术是一种重要的生物技术手段，广泛应用于基因工程、生物制药等领域。
分子克隆主要步骤
分子克隆主要步骤分子克隆是一种常用的分子生物学技术，用于复制DNA分子。
下面是分子克隆的主要步骤：1.DNA提取：首先需要从一个已知的DNA源（例如细菌、动物组织等）中提取所需的DNA。
这可以通过使用不同的提取方法（如酚/氯仿提取、自动提取仪等）来实现。
2.限制性内切酶切割：将目标DNA切割成片段。
此步骤可以通过使用限制性内切酶来实现，这些酶可以识别特定的DNA序列，并在这些序列中切割DNA，形成切割产物。
3.DNA修饰：如果需要，在第2步切割的DNA片段末端添加修饰，以便后续步骤的操作。
例如，可以在DNA片段的末端添加磷酸基团（通过激酶酶和ATP）或羟基（通过糖转移酶和dTTP）。
4.连接DNA片段：将目标DNA片段与载体DNA（通常是质粒）连接起来。
这可以通过使用DNA连接酶，如DNA连接酶I或T4DNA连接酶，将DNA片段与载体DNA的末端连接。
5.转化：将连接好的DNA导入到宿主细胞中。
这可以通过转化（常见的转化宿主细胞包括大肠杆菌和酵母）来实现。
转化可以通过热冲击法、电转化或使用化学方法来进行。
6.筛选：在经过转化的细胞中筛选出带有目标DNA的细胞。
这可以通过将转化后的细胞接种到含有适当选择标记的培养基上来实现。
只有带有目标DNA的细胞才能生长并形成克隆。
7.复制：选取带有目标DNA的细胞进行培养，并使其进行大量复制。
这可以通过将细胞培养在含有适当培养基和条件的培养皿中来实现。
8.提取：从大量复制的细胞中提取含有目标DNA的质粒。
这可以通过使用质粒提取试剂盒来实现，其中包含了一系列的化学试剂和步骤，用于纯化和提取目标DNA。
9.鉴定：验证提取的DNA是否为目标DNA。
这可以通过进行限制性内切酶切割、PCR扩增或测序等方法来实现。
分子克隆是一种重要的实验技术，可用于构建重组DNA分子、研究基因功能、制备蛋白质等。
虽然上述步骤描述了分子克隆的基本过程，但具体操作可能会因实验目的和需求而略有不同。
分子克隆详细步骤
分子克隆详细步骤分子克隆是通过重组DNA分子来产生大量完全相同的DNA序列的技术。
在分子克隆工作中，我们主要进行克隆载体的构建、目标DNA的扩增、将目标DNA插入克隆载体中、转化和筛选等步骤。
下面将详细介绍这些步骤：1.克隆载体的构建：克隆载体是用于插入目标DNA的DNA分子。
常用的克隆载体包括质粒、噬菌体和人工染色体等。
在构建克隆载体时，我们首先需要选择适合的载体，并提取载体的DNA。
然后，利用酶切酶对载体进行酶切，生成线性的载体DNA。
接下来，将目标DNA插入克隆载体的相应位点上，形成重组的载体。
2.目标DNA的扩增：目标DNA可以通过PCR（聚合酶链反应）来扩增。
首先，设计引物，使其与目标DNA的两端末端相互互补。
然后，在PCR反应中，通过DNA聚合酶的扩增作用，使目标DNA得以扩增。
PCR反应通常包括模板DNA、引物、核苷酸和聚合酶等成分。
3.目标DNA的插入：将扩增后的目标DNA与酶切后的载体进行连接，利用DNA连接酶催化目标DNA与载体之间的连接反应，生成重组的克隆载体。
连接后的载体含有目标DNA的序列。
4.转化：将克隆载体引入宿主细胞中进行复制。
这一步骤通常称为转化。
转化可以通过电击、热激、化学方法等方式进行。
宿主细胞通常是大肠杆菌等细菌。
5.筛选：利用筛选方法来选择包含目标DNA的克隆。
常用的筛选方法包括抗生素筛选、报告基因筛选和限制性内切酶酶切筛选等。
抗生素筛选是将带有选择性抗生素耐受基因的克隆引入含有相应抗生素的培养基中，只有带有目标DNA的克隆才能生长。
报告基因筛选是通过将报告基因插入克隆载体中，使之与目标DNA一起被转录和翻译，从而表达报告基因的蛋白质，以此来筛选包含目标DNA的克隆。
限制性内切酶酶切筛选是通过限制性内切酶对重组载体和目标DNA进行酶切，并通过凝胶电泳的方法来分离并检测含有目标DNA的克隆。
以上就是分子克隆的详细步骤。
通过这些步骤，我们可以获得大量完全相同的DNA序列，并用于各类分子生物学研究和应用中。
分子克隆实验指南
分子克隆实验指南分子克隆技术是一种常用的实验手段，常用于生物学和医学领域的研究中。
这种方法可以通过将DNA分子插入到载体DNA中来制备重组DNA分子，从而达到扩增特定的DNA序列或者表达生物活性分子的目的。
分子克隆技术的原理基于DNA的重组，重组的过程通常需要以下几个步骤：1、DNA的裂解和切割：要将DNA进行克隆，首先需要将待操作的DNA裂解并用酶切成适量的小片段。
2、载体的制备：载体是与待操作的DNA进行克隆的中介物，这种载体通常采用环状DNA分子质粒，也可以采用噬菌体等其它病毒。
3、DNA的连接：将切割后的DNA与载体对应的DNA片段通过酶的帮助连接起来，形成重组的DNA分子。
4、转化：将重组的DNA分子转化到细胞中。
5、筛选：对表达成功的细胞进行筛选，得到所需要的DNA片段。
下面是一份分子克隆实验指南，供研究人员参考：1、准备实验室条件：保持实验室的清洁和安全，坚持使用一次性的实验用品，保证环境的无菌。
2、准备所需材料：重组酶、DNA、载体、培养基、试剂、菌种等。
3、DNA的制备：使用DNA分离试剂盒将所需的DNA样本从细胞中提取出来，并通过酶的作用将其切割成适当的长度。
4、制备载体：将载体放入匀质的培养基中，通过质粒扩增技术制备大量的载体。
5、连接重组：使用重组酶将切割后的DNA与载体片段连接起来。
6、转化实验：将重组的DNA分子转化到感受态细胞中，如大肠杆菌，青霉素或氨苄青霉素选择性筛选能力。
7、筛选：将所需的表达目标转移到含有感光荧光素物质的培养基中，观察感光荧光，达到筛选的目的。
8、挑选合适的细胞：将所得的高荧光表达细胞进行挑选，进行康复培养。
9、提取所需重组蛋白：采取适当的提取方法对获得的细胞进行处理，得到所需的重组蛋白。
总之，分子克隆技术是一种非常重要的实验手段，该技术的应用范围很广，能够扩大DNA等分子，开启了生物医学研究的大门，为生命科学研究做出了重要的贡献。
DNA的克隆过程概述
DNA的克隆过程概述DNA的克隆是指在体外将含有目的基因或其它有意义的DNA片段同能够自我复制的载体DNA连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，因此DNA克隆又称分子克隆，基因操作或重组DNA技术。
DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等等。
一目的DNA片段的获得DNA克隆的第一步是获得包含目的基因在内的一群DNA分子，这些DNA分子或来自于目的生物基因组DNA或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链 cDNA分子。
由于基因组DNA较大，不利于克隆，因此有必要将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法有机械切割和核酸限制性内切酶消化。
若是基因序列已知而且比较小就可用人工化学直接合成。
如果基因的两端部分序列已知，根据已知序列设计引物，从基因组DN A 或cDNA中通过PCR技术可以获得目的基因。
二载体的选择基因工程的载体应具有一些基本的性质：1）在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力，这样才能使外源重组的DNA片段得以扩增。
2）分子量尽可能小，以利于在宿主细胞中有较多的拷贝，便于结合更大的外源DNA片段。
同时在实验操作中也不易被机械剪切而破坏。
3）载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性标记基因），以赋予宿主细胞的不同表型特征（如对抗生素的抗性）。
4）载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点，为避开外源DNA片段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。
若载体上的单一酶切位点是位于检测表型的标记基因之内可造成插入失活效应，则更有利于重组子的筛选。
DNA克隆常用的载体有：质粒载体（plasmid），噬菌体载体（phage），柯斯质粒载体（cosimid），单链DNA噬菌体载体（ssDNA phage ），噬粒载体（phagemid）及酵母人工染色体（YAC）等。
分子克隆技术操作手册
分子克隆技术操作手册（原创版）目录一、分子克隆技术的概念与意义二、分子克隆技术的基本原理三、分子克隆技术的操作步骤四、分子克隆技术在实践中的应用五、分子克隆技术的发展前景与挑战正文一、分子克隆技术的概念与意义分子克隆技术，又称为分子复制技术，是指在体外将特定 DNA 片段与载体 DNA 结合，然后通过转化等方式将重组 DNA 引入受体细胞，从而使得目的基因在受体细胞中得以表达和扩增的一种技术。
分子克隆技术的出现，为生物学、医学和基因工程等领域的研究提供了强大的支持，使得科学家们可以更加方便地研究和操控基因。
二、分子克隆技术的基本原理分子克隆技术的基本原理主要包括以下几个步骤：1.获取目的基因：从供体细胞中提取出需要研究的目的基因。
2.构建载体：将目的基因与载体 DNA 结合，构建成一个完整的克隆载体。
3.转化受体细胞：将构建好的克隆载体引入受体细胞中，使得目的基因在受体细胞中得以表达和扩增。
4.筛选克隆子：通过特定的筛选方法，从众多受体细胞中筛选出真正含有目的基因的克隆子。
5.提取和纯化目的基因：从筛选出的克隆子中提取和纯化目的基因，以供后续研究使用。
三、分子克隆技术的操作步骤分子克隆技术的操作步骤主要包括以下几个方面：1.提取目的基因：通过 PCR、限制性内切酶等方法从供体细胞中提取出目的基因。
2.构建载体：将目的基因与载体 DNA 结合，构建成一个完整的克隆载体。
这一步通常需要使用限制性内切酶和 DNA 连接酶等工具。
3.转化受体细胞：将构建好的克隆载体引入受体细胞中。
转化方法有很多种，如化学法、电穿孔法、热激法等。
4.筛选克隆子：通过特定的筛选方法，如抗生素筛选、荧光筛选等，从众多受体细胞中筛选出真正含有目的基因的克隆子。
5.提取和纯化目的基因：从筛选出的克隆子中提取和纯化目的基因，通常需要使用限制性内切酶和 DNA 连接酶等工具。
四、分子克隆技术在实践中的应用分子克隆技术在实践中的应用非常广泛，主要包括以下几个方面：1.基因工程：通过分子克隆技术，可以将目的基因与载体 DNA 结合，从而实现对基因的改造和调控。
分子克隆技术
载体特征： 1.能自主复制的复制子 2.可供筛选的遗传标记 3.适当大小的分子量 4.合适的限制性内切酶位点，方 便外源基因的插入 5.在受体细胞中高效复制
TA克隆的idea最初来自1994年。几位学者发现TaqDNA聚合 酶在PCR产物的3`末端加上一个脱氧腺苷（A），而且这种 特性与模板无关。之后，invitrogen公司发明了TA克隆技术， 并拥有全球TA cloning商标的专利权。线性化的T载体在3` 末端拥有一个脱氧胸苷（T），与PCR产物的A尾巴互补。
分子克隆中的关键技术： DNA分子的分离和富集技术；DNA分子的切割与连接技术； 载体构建技术；大肠杆菌转化技术； 重组DNA分子的筛选和鉴定技术
分子克隆的基本步骤： 1.目的基因的获得 2.目的基因与载体的连接 3.重组DNA分子导入受体细胞 4.筛选出含重组DNA分子的受体细胞克隆 5.克隆基因、克隆基因的表达
分子克隆技术
分子克隆（molecular cloning）
又称为基因克隆、基因工程、DNA克隆、重组DNA技术
克隆（Clone） 指通过无性繁殖过程所产生的与亲代完全相同的子代群体。
分子克隆 指按照人的意愿，在体外将某种生物的DNA片断插入到载体
（质粒、病毒等）中，形成遗传物质的新组合---重组DNA分子 （重组子），然后将重组子转移到宿主细胞中进行复制或表达， 即对DNA分子进行克隆，以获得该DNA分子的大量拷贝。
大肠杆菌转化体系的 建立：感受态菌制备
经氯化钙处理的大肠 杆菌能够摄r)重组 质粒DNA及双抗性转 化大肠杆菌细胞的获得。
2.真核动物非洲爪蟾 的基因在原核细胞中 转录
意义：1.解决了无复制能力的DNA片断在宿主 细胞中进行繁殖克隆的关键问题；2.质粒分子 可作为基因克隆的载体将外源DNA分子导入宿 主细胞；3.真核细胞的基因可被转移到原核细 胞中进行克隆及表达。
分子克隆技术步骤
分子克隆技术步骤第一步：选取目标DNA在开始分子克隆之前，需要从一个生物体中选择一个含有所需DNA序列的样本。
这可以是任何生物体的DNA，例如人类、动物、植物或微生物。
第二步：DNA提取从所选生物体提取DNA。
这可以通过使用一系列化学和物理方法来完成，例如细胞裂解、蛋白酶处理、DNA沉淀和洗涤等。
第三步：选择一个合适的载体载体是一种DNA分子，可以容纳目标DNA序列并将其复制。
在分子克隆中最常使用的载体是质粒。
质粒是圆形的双链DNA分子，存在于许多细菌和酵母种类中，并被广泛用于分子生物学研究。
第四步：限制性内切酶切割将目标DNA和载体同时使用限制性内切酶（Restriction Enzymes）酶切。
限制性内切酶是一种可以识别和切割特定DNA序列的酶。
通过在目标DNA和载体的特定位置上切割，可以为将两者连接提供互补的末端。
第五步：DNA连接将目标DNA和载体连接在一起。
将目标DNA和载体的DNA片段混合，并在其末端形成互补碱基，然后使用DNA连接酶将两者连接在一起。
连接后的DNA分子被称为重组质粒。
第六步：转化将重组质粒引入细菌或酵母等微生物细胞中，这个过程称为转化。
这可以通过将细菌细胞暴露在低温高压胁迫下来实现，使得细胞膜变得更加渗透性，可以将质粒引入细胞内。
第七步：筛选和鉴定筛选出含有重组质粒的细菌或酵母细胞。
一种常用的筛选方法是将细菌培养在含有抗生素的培养基上，只有携带重组质粒的细菌才能在含有抗生素的环境下存活。
此外，还可以使用标记基因和特定染色剂等方法来鉴定重组质粒。
第八步：扩增和纯化用培养液扩增含有重组质粒的细菌或酵母细胞。
随着细菌或酵母细胞的生长，它们会复制重组质粒并将其传递给后代细胞。
然后使用一系列纯化步骤，如离心、洗涤和电泳等手段，将其中的重组质粒提取纯化。
总结：分子克隆技术的主要步骤包括选取目标DNA、DNA提取、选择合适的载体、限制性内切酶切割、DNA连接、转化、筛选和鉴定，以及扩增和纯化。
分子克隆过程
分子克隆过程分子克隆，听起来是不是特别高大上？就好像是在分子的世界里当一个小小的造物主，把基因这个神奇的“小零件”按照我们的想法组合来组合去。
分子克隆其实就像搭积木。
我们知道，积木有各种各样的形状和颜色，基因呢，也有不同的类型和功能。
我们的目标就是把那些我们想要的“基因积木”挑出来，然后搭成一个新的“建筑”，这个“建筑”可能是一个新的蛋白质，或者是一种新的细胞功能。
那怎么开始这个神奇的分子克隆之旅呢？这得从找到我们想要的基因开始。
这就好比在一个巨大的仓库里找一个特别的小零件。
这个仓库就是生物体的基因组。
有时候这个基因很容易找，就像在一堆颜色鲜艳的积木里找那个红色的正方体一样简单。
但有时候，这个基因就像藏在一堆干草里的小针，特别难找。
我们可能要用到一些特殊的工具，比如说基因探针。
基因探针就像是一个带了导航的小机器人，专门去找那个我们想要的基因。
找到基因之后呢？就该把这个基因从它原来的地方取出来了。
这就像是从一个复杂的机械装置里小心翼翼地拆卸一个小零件。
我们会用到一种叫做限制性内切酶的东西。
这限制性内切酶可神奇了，它就像一把特别精准的小剪刀，只在特定的位置把基因剪下来，不会伤到其他的地方。
把基因取出来之后，得找个地方放呀。
这个地方就是载体。
载体就像是一辆小货车，把我们取出来的基因运到新的地方去。
常见的载体有质粒，这质粒就像是一个小巧的移动仓库，可以装载我们的基因。
把基因和载体连接起来就像是把货物小心翼翼地装到货车上，这个时候我们又需要一种工具，叫DNA连接酶，它就像一个超级胶水，把基因和载体牢牢地粘在一起。
然后就是把这个带着我们想要的基因的载体送进细胞里。
这细胞就像是一个小小的工厂，里面有各种各样的生产线，可以对我们送进去的基因进行加工。
把载体送进细胞的过程有点像把小货车开进一个有很多大门的大工厂。
有时候很顺利，就直接开进去了。
但有时候也会遇到困难，就像小货车的尺寸不符合大门的要求一样，我们就得想办法调整。
分子克隆实验流程
分子克隆实验流程分子克隆是将DNA分子从一个生物体中复制并插入另一个生物体中的过程。
这种技术广泛应用于生物学研究和生物工程领域。
下面将详细介绍分子克隆的实验流程。
1.提取DNA首先，需要从源生物体中提取所需的DNA。
这可以通过不同的方法来完成，例如琼脂糖凝胶电泳、菌落PCR和基因组DNA提取试剂盒等。
提取的DNA需要是目标基因的完整、纯净的样本。
2.回收DNA片段将提取的DNA片段和载体（例如质粒）切割，以回收想要克隆的DNA 片段。
常用的酶剪切酶包括限制性内切酶和退火酶。
将酶切割后的DNA片段与载体的切割端黏合，形成重组DNA。
3.转化纯化将重组DNA转化到宿主细胞中。
通常使用大肠杆菌作为宿主细胞。
这可以通过脉冲电击、热激转化或化学转化来实现。
这一步的目的是将重组DNA导入到宿主细胞中，以便宿主细胞可以复制和表达克隆的DNA。
4.鉴定克隆细胞通常，我们通过选择性培养、荧光染色、PCR检测等方法来鉴定具有克隆DNA的细胞。
在选择性培养基上生长可以表明细胞成功地接受了重组DNA。
此外，如果重组DNA带有可观察的荧光标记，可以使用荧光显微镜进行观察。
PCR检测可以验证目标基因的存在。
5.扩增克隆细胞选取鉴定出的克隆细胞进行扩增。
这可以通过将克隆细胞培养在含有选择性抗生素的培养基上来实现。
只有带有插入DNA的细胞可以在这种培养条件下生存。
选择性培养的目的是增加克隆细胞的数量，以便后续的实验。
6.提取插入DNA从扩增的克隆细胞中提取含有插入DNA的重组质粒。
通常使用薄膜过滤法将细菌细胞去除，然后使用DNA提取试剂盒从细菌残渣中提取质粒。
提取的质粒可以通过琼脂糖凝胶电泳等方法进行纯化和鉴定。
7.鉴定插入DNA使用不同的试验方法来鉴定插入DNA的准确性和完整性。
这可能包括核酸测序、酶切鉴定、PCR扩增等。
通过这些方法可以验证克隆的DNA是否与目标基因的序列完全一致。
8.进一步应用得到插入DNA后，可以进行进一步的应用，例如重组蛋白表达、基因改良、产生转基因生物等。
分子克隆的五个步骤
分子克隆的五个步骤1 选择载体：在分子克隆的过程中，首先需要选择一种合适的载体来实现这一过程。
载体是要被克隆的DNA片段，生物体中的某种大分子结构，可以为克隆提供容器。
一般来说，载体选择最好是含有可重复使用的重组信息，如使用多种重组酶克隆更为容易和可靠，能在实验室之间转移。
该步骤需要考虑选择对于试验类型最合理、在实验中表现最佳的载体，与之相符的必要条件是有可操作和稳定的复制介质，以及品质可靠、价格相对划算的供应商。
2 将载体与要克隆的DNA片段连接：接下来需要将载体与要克隆的DNA片段连接。
这样一来，DNA片段就会受到载体中的重组酶以及其余细菌特有的信息影响，从而生存，复制，得以分离，克隆出多个相同的DNA断片。
连接DNA片段和载体的技术有各种方法，最常见的方法为用复制酶切割载体的方法，这种技术利用重组酶将DNA片段片段插入载体结构中，实现载体与DNA片段的融合。
3 转化：经过第二步的操作，则可以将融合的载体片段转入细菌，进行转化，实现将载体片段覆盖到细菌细胞中，形成细菌外源DNA的转基因，从而使细菌体系内发生变化，从而开始转化过程。
4 筛选：经过第三步的转化，载体就可以移植到细菌体内，从而形成转基因细菌，这时候就可以采用测试细胞以及一些标记物质来进行筛选，将转基因细菌与其他细菌相区分开来，根据一些指定条件进行筛选，从而得到被克隆的特异性DNA片段，实现分子克隆的目的。
5 收集：经过第四步的筛选，就可以将特异性的DNA断片收集起来，被收集的DNA断裂片段就是分子克隆的结果，可以得到被克隆的特异性DNA 断片，将其用于进一步的研究。
最后，分子克隆是一种复杂的实验过程，需要经过以上5个步骤，才能实现分子克隆的目的，如正确选择载体、把该DNA片段片段插入载体结构、将融合的载体片段转入细菌、用测试细胞以及一些标记物质对转基因细菌进行筛选，从而得到被克隆DNA片段，最终收集被克隆的DNA断片，这样就可以实现分子克隆的目的，得出满意的实验结果。
分子克隆详细步骤
分子克隆步骤：一、贴壁细胞总RNA提取：1、吸掉培养液，用PBS洗一遍?2、往培养皿中加入1ml,TRIzol,吹打几次(每10cm2面积,即3.5cm直径的培养板加1ml)3、移至1.5mlEP管，静置5分钟4、加入200ul三氯甲烷，震荡混匀，室温静置5分钟5、4度12000r/min，离心15分钟，取上清，约600ul6、加入500ul异丙醇，混匀后，静置30分钟？7、4度12000r/min，离心15分钟，弃上清8、加入1ml70%预冷酒精洗涤沉淀物9、4度7500r/min，离心5分钟10、弃上清，自然晾干11、加入50ulDEPC水溶解，测OD值＊鼠尾基因组DNA粗提取：1、100ul lysis buffer for each tail,and 2ul 10mg/ml PK,55℃,overnight.2、Then,100℃ for 10min to denature the PK, use 0.5~1ul lysate as template to do PCR.Lysis buffer:(store at 4℃)KCl 0.5MTris 0.1MNP-40 1%Tween-20 1%二、RT-PCR：1、预变性体系12ul：Total RNA 2ulOligo（dT18）primer 1ulDH water 9ul65℃ 5min 速置冰上2、RT体系：20ul：预变性体系12ul5×buffer 4ulRNAase inhibiter 1ul10m dNTP 2ulMMLV 1ul42℃ 60min70℃ 5min12℃ forever3、PCR体系20ul：10×buffer 2ul10m dNTP 0.5ulPrimer(F+R) 1ul （0.5ul+0.5ul）稀释后cDNA（50ul）1ulPfu 0.2uldd water 15.3ul95℃3min、（95℃30s，55℃30s，72℃35s）×29cycle、72℃10min、12℃forever三、跑胶鉴定PCR产物：四、醇沉PCR产物：1、将PCR产物转移至1.5mlEP管中2、加入0.1倍体积预冷NaAC，3倍体积70%预冷乙醇，混匀3、—80℃静置30min4、4度14000r/min，10min离心弃上清，加1ml70%预冷乙醇洗涤沉淀5、4度14000r/min，10min离心弃上清，自然晾干6、加入25-20ul dd water 吹匀静置10-20min待溶解五、原始质粒/PCR醇沉产物双酶切体系50ul：Enzyme1 1ulEnzyme2 1ul10×Buffer 5ul （在体系中被稀释成1×）10×BSA 5ul （看需要）Template 1ugADD dd water to 50ul酶切过夜？六、单独鉴定质粒酶切产物：1、采用20ul体系：酶各0.5ul、buffer2ul、bsa0.5ul、template2ul）酶切2h2、跑胶鉴定七、电泳，切胶回收与纯化：使用DNA回收试剂盒（QIAquick Gel Extraction Kit Protocol）PCR酶切产物纯化：1.将PCR产物于需要的电压和电流下跑电泳2. 紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶，置1.5ml离心管中，称重。
分子克隆实验标准步骤
分⼦克隆实验标准步骤分⼦克隆实验标准步骤⼀、常规分⼦克隆实验流程：⼆、分⼦克隆实验标准步骤（含实验编号）：1. PCR 扩增⽬的基因（编号Clone SOP-1）以本实验室常⽤酶KOD-Plus-Neo （TOYOBO ）为例体系（50ul ）：10×KOD buf 5uldNTP(2mM) 5ulMg 2+ 3ulPrimer1 1ulPrimer2 1ulTemplate50-200ngKOD0.5ulddH 2O up to 50ul程序：95℃2min98℃10s58℃30s 35cycle68℃2kb/min68℃7min12℃∞2.PCR产物的琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶的制备（编号Clone SOP-2）琼脂糖溶液的制备：称取琼脂糖，置于三⾓瓶中，按1%-1.5%的浓度加⼊相应体积的TBE或TAE缓液，将该三⾓瓶置于微波炉加热⾄琼脂糖溶解。
胶板的制备：①取有机玻璃内槽，洗净、晾⼲；②将有机玻璃内槽置于⼀⽔平位置模具上，安好挡板，放好梳⼦。
在距离底板上放置梳⼦，以便加⼊琼脂糖后可以形成完好的加样孔。
③将温热琼脂糖溶液倒⼊胶膜中，使胶液缓慢地展开，直到在整个有机玻璃板表⾯形成均匀的胶层。
④室温下静置30min左右，待凝固完全后，轻轻拔出梳⼦，在胶板上即形成相互隔开的上样孔。
制好胶后将铺胶的有机玻璃内槽放在含有0.5～1×TAE（Tris-⼄酸）或TBE（Tris-硼酸）⼯作液的电泳槽中使⽤，没过胶⾯1mm以上。
3.试剂盒回收DNA⽚段（编号Clone SOP-3）以本实验室常⽤DNA凝胶回收试剂盒（天根）为例使⽤前请先在漂洗液PW中加⼊⽆⽔⼄醇，加⼊体积请参照瓶上的标签。
①柱平衡步骤：向吸附柱CA2中（吸附柱放⼊收集管中）加⼊500µl平衡液BL，12,000rpm(~13,400×g)离⼼1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收集管中。
（请使⽤当天处理过的柱⼦）②将单⼀的⽬的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放⼊⼲净的离⼼管中，称取重量。
分子克隆以及蛋白纯化流程
分子克隆以及蛋白纯化流程分子克隆是利用重组DNA技术将感兴趣的基因从一个生物体中复制并插入另一个生物体中的过程。
它是现代生物技术中最常用的技术之一，被广泛用于基因工程、基因治疗、药物研发等领域。
蛋白纯化则是从复杂的混合物中分离和纯化目标蛋白质的过程，用于蛋白质的进一步研究和应用。
分子克隆的步骤通常包括：1.获取目标基因：从目标生物体中提取DNA，或通过合成DNA片段获得目标基因。
2.DNA片段的处理：将目标基因与载体DNA进行酶切，利用酶切酶切割酶将片段粘贴到载体DNA上。
3.载体构建：将连接好的基因载体转化到适当的宿主细胞中，如大肠杆菌等。
4.选择与鉴定：利用抗生素等筛选方法，筛选带有目标基因的转化细胞，并通过PCR、酶切等方法验证克隆是否成功。
5.大规模培养：将带有目标基因的细胞进行大规模培养，以获取足够数量的重组蛋白质。
蛋白纯化的一般流程如下：1.细胞裂解：使用各种方法如超声波、高压等将菌体或细胞破裂，释放目标蛋白质。
2.清除杂质：通过离心等方法去除琼脂、酶、核酸等杂质。
3.选择性分离：利用特异性亲和剂、柱层析、电泳等方法将目标蛋白质分离出来。
4.蛋白质的浓缩和纯化：通过滤膜、浓缩柱、洗脱缓冲等方法将目标蛋白质浓缩并进一步纯化。
5.成品蛋白质的储存和保存：将纯化得到的目标蛋白质进行储存，以备后续研究和应用。
需要注意的是，以上仅为分子克隆和蛋白纯化的一般流程，具体的步骤可能会因实验设计、目标蛋白质的性质和要求等而有所不同。
此外，实验过程中还需要配制相应的缓冲液、培养基和试剂，操作注意安全和操作规范。
分子克隆和蛋白纯化是复杂而精细的实验技术，需要仔细操作和合理设计实验方案，以确保实验的成功和结果的准确性。
分子克隆主要步骤
笔记3（分子克隆2——主要步骤）分子克隆可以分为以下几个步骤：分离制备待克隆的DNA片段————将靶DNA片段与载体在体外进行连接————重组DNA分子转入宿主细胞————筛选、鉴定阳性重组子————重组子的扩增。
1.带有目的基因的DNA片段的获得：可以用限制内切酶降解基因组DNA，再配合使用其他实验手段得到待定的DNA片段，可以用超速离心的方法分离出具有特定核苷酸组成的DNA片段，可以用mRNA做模板，用反转录酶合成互补DNA，即cDNA，也可以用化学合成的方法直接合成一段DNA。
2.重组DNA分子的构建：重组DNA分子中包括两部分，一部分是外源DNA，即目的DNA片段，另一部分是载体DNA。
用作载体的，有质粒、噬菌体或病毒DNA。
它们的基本特征是能够独立复制。
如果用同一种限制性内切酶切割这两种DNA，则它们的末端完全相同，由于有互补的单链末端序列存在，在连接酶的作用下，就可以形成重组DNA 分子。
在没有互补单链末端的情况下，也可以用酶学方法造成一个互补单链末端之后再进行连接。
3.重组DNA分子的转化和重组克隆的筛选：重组DNA分子必须进入宿主细胞中，才能得到扩增和表达．这个过程叫做转化。
大肠杆菌是目前使用最广泛的宿主细胞。
除此以外．其他细菌、酵母、哺乳动物细胞等也可作为宿主细胞，可以根据实验的需要加以选择。
在被转化的宿主细胞中，不同的单个细胞(在平板上表现为单个菌落，亦称克隆)中可能含有不同的重组质粒或非重组质粒，因此必须进行筛选，以便确定哪些是重组克隆。
筛选可以使用抗菌素抗性或其他方法，依载体的性质而定。
4.特定重组克隆的鉴别：由于重组克隆往往是较多的，而在某一克隆实验中，我们感兴趣的目的克隆只有一个或几个，所以需要进一步鉴别。
使用的方法主要有核酸杂交法和免疫化学法。
此外，找出了目的克隆之后，还需要根据实验的目的，进一步弄清目的克隆中外源DNA片段上的基因的结构和功能。
主要有酶切图谱的制定，基因在DNA 片段上的精确定位，确定是否有内含子，DNA序列分析，离体翻译实验，外源基因在某些宿主细胞中的表达及产物的提纯等。
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本文以大肠杆菌DH10B为例介绍外源基因在大肠杆菌中表达全过程
克隆步骤包括：模板制备（基因组DNA提取）-感受态细胞的制备-PCR-纯化回收-酶切-连接-转化-挑菌摇菌-质粒抽提-酶切鉴定-测序
1) 基因组DNA提取（以家蚕为例）
1. 取家蚕五龄后部丝腺约0.5g，于10ml匀浆器内，加2mlDNA抽提缓冲液，在
冰上充分研磨，转入5ml的离心管；
2. 加入RnaseA（10ul）至终浓度20ug/ml，37℃水浴1h；
3. 加入ProteinaseK（25ul）至终浓度100ug/ml，55℃水浴2h；
4. 分装到1.5ml eppendorff管，0.6ml/管；
5. 加入等体积的平衡酚（pH8.0），充分混匀，5000g，15min，取上清；
6. 重复5，再抽提1次；
7. 用等体积的酚/氯仿（1/1，v/v），氯仿各抽提1次
8. 将上清移入新离心管，加入1/10体积的3mol/L NaAc（pH 5.2），2倍体积的
无水乙醇，充分混匀，4℃过夜
9. 用牙签将絮状沉淀物挑出。
用75%冰酒精洗涤3次，37℃控干；
10. 200µl 0.1 TE(pH8.0)溶解DNA；
11. 检测OD值；
12. 做好标记，以供进一步实验之用。
2) 感受态细胞的制备
1. -20℃冻藏的DH10B甘油菌在LB平板上复苏（划板），37℃，8-12小时；
2. 用灭菌牙签挑取单菌落，放入3ml LB培养基中，37℃振荡培养过夜；
3. 取100μl过夜培养物接种到另一3 ml LB培养基中，37℃振荡培养2∼2.5 h，
使OD值在0.6左右（把握好浓度，OD值可以不用测）；将菌液分装到1.5ml EP 管中（在超净台完成）
4. 5000 g离心4 min收集菌体，将菌体重悬于800 μl 75 mmol/L冷CaCl2中，
冰浴30 min；（CaCl2要用高纯度的，切记！）
5. 4℃，5 000 g离心4 min，弃上清；
6. 加入200μl 75 mmol/L冷CaCl2，轻轻敲打管壁，使混合均匀，冰上放4 h
后用于转化，或加0.1倍体积甘油混匀，－70℃保存备用。
可以保存至少6个月。
3) PCR
1、PCR反应体系：
ddH2O 37.7 μL
10×PCR buffer 5 μL （25mM）
dNTP 4 μL
引物1/2 1μL/1μL
Taq酶 0.3μL
模板 1μL
PCR反应体系总体积 50 μL
充分混匀，稍离心。
2、PCR反应条件
Step 1 94℃ 5min
Step 2 94℃ 30s;
Step 3 55℃ 1 min;
Step 4 72℃ 1 min 30 s;
Go to step2 35 cycles;
72℃ 10 min ；
4℃保温
3、PCR完成后，取3μL电泳检测大小是否正确。
玻璃奶法纯化回收DNA片段，-20℃保存供进一步实验之用。
4) 玻璃奶纯化回收
1.对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；
2.电泳后的胶在紫外光下切割目的片段；
3.放入EP管称重（此步可以大概估计一下，称重太麻烦），加入3倍体积的6M NaI;
4.65℃水浴至胶完全溶解；
5.加入glass-milk充分混匀。
冰上放置10分钟（中间摇2-3次）；
6.12000rmp5-10S，去上清；
7.沉淀用600μlNewWash或75%乙醇洗3次（充分弹起）；
8.37℃烘干，0.1×TE溶解（30μl左右），37℃5-10min促进溶解；
9．12000rmp 2min,上清即为回收的DNA，用时不要动沉淀。
5) 酶切
酶切体系：
PCR产物 12 μl
10×K buffer 3 μl
EcorI/BamHI 1/1 μl
DdH2O 13 μl
Total30 μl
37℃ 2h酶切; 65℃ 15min,使酶失活
6) 连接
连接体系：
10×Ligase buffer 1 ul
PGEM4Z（EcorI/BamHI酶切）0.2 ul
目的片段（酶切产物） 7.8 ul
T4DNA Ligase 1 ul
Total 10 ul
16℃ 9h左右。
注：所有试剂、PCR、酶切、连接体系均为本实验所用，别的实验请自行调整！
7) 质粒DNA的转化
1. 连接混合物5 μl加到200 μl上述制备的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴
30 min；
2. 再进行热休克，42℃保温2 min，迅速置冰上1∼2 min，加入1 ml已温育至
37℃的LB培养基；
3. 37℃振荡培养1－2 h，3000rmp/min稍离心，去部分上清（800μl左右，确
保够涂板用）后涂布于数个含80 μg/ml Amp的LB平板上。
37℃倒置培养过夜。
8) 挑菌摇菌
挑取单菌落于3mlLB液体培养基中，加入5ulAmp,37℃震荡培养10h左右（根据菌液混浊程度而定）。
9) 质粒抽提
1. 取过夜培养液1.5 mL 于Eppendorf中,5000 rpm,5 min，收集菌体细胞
2. 真空吸去上清后，向沉淀中加150 μL SolutionⅠ，振荡器混匀，室温放置15
min，
3. 加300 μL Solution Ⅱ,150 μL氯仿，轻轻混匀，冰上放置5 min。
4. 加450 μL的Solution Ⅲ，充分混匀后，冰浴10 min或更长的时间。
5. 4 ℃，12000 rpm离心5 min，将上清转移到新的1.5 mL 的Eppendorf中，
加入0.6倍体积的异丙醇，冰浴10 min或更长时间。
6. 4 ℃，12000 rpm离心5 min，去掉上清，沉淀用250 μL的TER溶解，（TER：
1×TE中含20μg/mLRNase）,37 ℃保温20 min。
7. 再加入300 μL的PPT沉淀Buffer，4℃沉淀20 min，
8. 12000 rpm,5 min，沉淀用75%的酒精洗一次，37℃烘干直到没有酒精味道，
9. 用0.1×TE溶解DNA，-20℃备用。
10) 酶切鉴定
酶切体系：
DNA 4 μl
10×K buffer 1.5 μl
EcorI/BamHI 0.5/0.5 μl
ddH2O 8.5 μl
Total 15 μl
37 ℃2h.
进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。
11) 测序
对鉴定正确的细菌做成甘油菌寄到生物公司测序
甘油菌制备：
1. 取100ul鉴定正确的菌液于3mlLB液体培养基中，加入5ulAmp,37℃震荡培
养7h左右（根据菌液混浊程度而定）；
2. 分装至EP管中，每管加入3-4滴甘油，摇匀。
用封口膜封装。