分子克隆全过程

本文以大肠杆菌DH10B为例介绍外源基因在大肠杆菌中表达全过程

克隆步骤包括：模板制备（基因组DNA提取）-感受态细胞的制备-PCR-纯化回收-酶切-连接-转化-挑菌摇菌-质粒抽提-酶切鉴定-测序

1) 基因组DNA提取（以家蚕为例）

1. 取家蚕五龄后部丝腺约0.5g，于10ml匀浆器内，加2mlDNA抽提缓冲液，在

冰上充分研磨，转入5ml的离心管；

2. 加入RnaseA（10ul）至终浓度20ug/ml，37℃水浴1h；

3. 加入ProteinaseK（25ul）至终浓度100ug/ml，55℃水浴2h；

4. 分装到1.5ml eppendorff管，0.6ml/管；

5. 加入等体积的平衡酚（pH8.0），充分混匀，5000g，15min，取上清；

6. 重复5，再抽提1次；

7. 用等体积的酚/氯仿（1/1，v/v），氯仿各抽提1次

8. 将上清移入新离心管，加入1/10体积的3mol/L NaAc（pH 5.2），2倍体积的

无水乙醇，充分混匀，4℃过夜

9. 用牙签将絮状沉淀物挑出。用75%冰酒精洗涤3次，37℃控干；

10. 200µl 0.1 TE(pH8.0)溶解DNA；

11. 检测OD值；

12. 做好标记，以供进一步实验之用。

2) 感受态细胞的制备

1. -20℃冻藏的DH10B甘油菌在LB平板上复苏（划板），37℃，8-12小时；

2. 用灭菌牙签挑取单菌落，放入3ml LB培养基中，37℃振荡培养过夜；

3. 取100μl过夜培养物接种到另一3 ml LB培养基中，37℃振荡培养2∼2.5 h，

使OD值在0.6左右（把握好浓度，OD值可以不用测）；将菌液分装到1.5ml EP 管中（在超净台完成）

4. 5000 g离心4 min收集菌体，将菌体重悬于800 μl 75 mmol/L冷CaCl2中，

冰浴30 min；（CaCl2要用高纯度的，切记！）

5. 4℃，5 000 g离心4 min，弃上清；

6. 加入200μl 75 mmol/L冷CaCl2，轻轻敲打管壁，使混合均匀，冰上放4 h

后用于转化，或加0.1倍体积甘油混匀，－70℃保存备用。可以保存至少6个月。

3) PCR

1、PCR反应体系：

ddH2O 37.7 μL

10×PCR buffer 5 μL （25mM）

dNTP 4 μL

引物1/2 1μL/1μL

Taq酶 0.3μL

模板 1μL

PCR反应体系总体积 50 μL

充分混匀，稍离心。

2、PCR反应条件

Step 1 94℃ 5min

Step 2 94℃ 30s;

Step 3 55℃ 1 min;

Step 4 72℃ 1 min 30 s;

Go to step2 35 cycles;

72℃ 10 min ；

4℃保温

3、PCR完成后，取3μL电泳检测大小是否正确。

玻璃奶法纯化回收DNA片段，-20℃保存供进一步实验之用。

4) 玻璃奶纯化回收

1.对PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳；

2.电泳后的胶在紫外光下切割目的片段；

3.放入EP管称重（此步可以大概估计一下，称重太麻烦），加入3倍体积的6M NaI;

4.65℃水浴至胶完全溶解；

5.加入glass-milk充分混匀。冰上放置10分钟（中间摇2-3次）；

6.12000rmp5-10S，去上清；

7.沉淀用600μlNewWash或75%乙醇洗3次（充分弹起）；

8.37℃烘干，0.1×TE溶解（30μl左右），37℃5-10min促进溶解；

9．12000rmp 2min,上清即为回收的DNA，用时不要动沉淀。

5) 酶切

酶切体系：

PCR产物 12 μl

10×K buffer 3 μl

EcorI/BamHI 1/1 μl

DdH2O 13 μl

Total30 μl

37℃ 2h酶切; 65℃ 15min,使酶失活

6) 连接

连接体系：

10×Ligase buffer 1 ul

PGEM4Z（EcorI/BamHI酶切）0.2 ul

目的片段（酶切产物） 7.8 ul

T4DNA Ligase 1 ul

Total 10 ul

16℃ 9h左右。

注：所有试剂、PCR、酶切、连接体系均为本实验所用，别的实验请自行调整！

7) 质粒DNA的转化

1. 连接混合物5 μl加到200 μl上述制备的感受态细胞中，轻轻混匀，冰浴

30 min；

2. 再进行热休克，42℃保温2 min，迅速置冰上1∼2 min，加入1 ml已温育至

37℃的LB培养基；

3. 37℃振荡培养1－2 h，3000rmp/min稍离心，去部分上清（800μl左右，确

保够涂板用）后涂布于数个含80 μg/ml Amp的LB平板上。37℃倒置培养过夜。

8) 挑菌摇菌

挑取单菌落于3mlLB液体培养基中，加入5ulAmp,37℃震荡培养10h左右（根据菌液混浊程度而定）。

9) 质粒抽提

1. 取过夜培养液1.5 mL 于Eppendorf中,5000 rpm,5 min，收集菌体细胞

2. 真空吸去上清后，向沉淀中加150 μL SolutionⅠ，振荡器混匀，室温放置15

min，

3. 加300 μL Solution Ⅱ,150 μL氯仿，轻轻混匀，冰上放置5 min。

4. 加450 μL的Solution Ⅲ，充分混匀后，冰浴10 min或更长的时间。

5. 4 ℃，12000 rpm离心5 min，将上清转移到新的1.5 mL 的Eppendorf中，

加入0.6倍体积的异丙醇，冰浴10 min或更长时间。

6. 4 ℃，12000 rpm离心5 min，去掉上清，沉淀用250 μL的TER溶解，（TER：

1×TE中含20μg/mLRNase）,37 ℃保温20 min。

7. 再加入300 μL的PPT沉淀Buffer，4℃沉淀20 min，

8. 12000 rpm,5 min，沉淀用75%的酒精洗一次，37℃烘干直到没有酒精味道，

9. 用0.1×TE溶解DNA，-20℃备用。

10) 酶切鉴定

酶切体系：

DNA 4 μl

10×K buffer 1.5 μl

EcorI/BamHI 0.5/0.5 μl

ddH2O 8.5 μl

Total 15 μl

37 ℃2h.

进行琼脂糖凝胶电泳鉴定。

11) 测序

对鉴定正确的细菌做成甘油菌寄到生物公司测序

甘油菌制备：

1. 取100ul鉴定正确的菌液于3mlLB液体培养基中，加入5ulAmp,37℃震荡培

养7h左右（根据菌液混浊程度而定）；

2. 分装至EP管中，每管加入3-4滴甘油，摇匀。用封口膜封装。