中华绒螯蟹血淋巴抗菌活性的初步研究
中华绒螯蟹血淋巴内磺胺甲基异恶唑的测定及药代动力学研究
Agilent - 1100型高效液相色谱仪 ,配备紫外检 测器 ; - 80 ℃低温冰箱 ;微型匀桨机 ;漩涡混合器 ; 电子天平 ;台式离心机等 。 114 流动相及色谱条件
在蟹空白血淋巴中添加磺胺甲基异 唑标 准 溶 液 , 使 其 理 论 浓 度 分 别 为 210、510、1010、 2010μg /mL ,按“血样处理 ”后 ,根据实测浓度和理 论浓度计算出回收率 (表 1) ,磺胺甲基异 唑四个 浓度下平均回收率为 (9715 ±212) %。
9
组别
1 2 3 4
日间精密度 :在空白血淋巴中添加磺胺甲基异 唑标准溶液 (血药浓度为 510 μg /mL ) ,在一周内 重复测定 3 次 ,计算其标准偏差和相对标准偏差 。 日间相对标准偏差 (RSD )为 2110% (表 2) 。
表 2 磺胺甲基异 唑含量检测的 日内精密度和日间精密度
项 目
日内精密度
血样采集 从蟹背部心区用抗凝剂 ACD[ 1 ] 润 湿管壁的注射器抽取血淋巴 ,每只蟹抽取 015 mL , 放入已经加入 015 mL 抗凝剂 ACD 的小离心管中 , 立即漩涡震荡 2 m in, 3000 r/m in离心 10 m in, 取 上清液于小离心管中 , 于 - 80 ℃低温保存直至使 用。
药代动力学模型拟合及参数计算采用 MCPKP 药代动力学软件分析 。 2 试验结果 211 磺胺甲基异 唑的色谱行为
在 114 所设计的色谱条件下 , HPLC 基线走动 平稳 ,磺胺甲基异 唑的保留时间为 2159 m in,样品 血淋巴中虽有少量杂质峰出现 ,但无干扰峰 ,与药峰 分离良好 (图 1) 。
中华绒螯蟹主要致敏原的分离纯化与免疫学鉴定的开题报告
中华绒螯蟹主要致敏原的分离纯化与免疫学鉴定的开题报
告
题目：中华绒螯蟹主要致敏原的分离纯化与免疫学鉴定
一、研究背景
中华绒螯蟹是中国的地方特色水产资源之一，深受人们的喜爱，但同时也是一种常见的食物过敏源。
其导致的过敏反应程度不同，表现为轻微的局部皮肤瘙痒、红斑、水肿等症状，或者是严重的过敏性休克等反应。
目前已有研究报道了中华绒螯蟹对人
体过敏原的表征，主要包括溶血素、蟹肉球蛋白和蜕皮蛋白等，但还没有进行深入的
分离纯化与免疫学鉴定。
二、研究目的
本研究旨在分离纯化中华绒螯蟹主要致敏原，探究其分子结构及其与人体血清蛋白的相互作用，为防治食物过敏提供新思路。
三、研究内容
1. 分离纯化研究：通过蟹肉球蛋白、溶血素和蜕皮蛋白的差凝聚、离子交换和凝胶过滤等技术进行分离纯化，确定主要致敏原的分子质量和纯度。
2. 结构和特性鉴定：通过电泳、Western blotting等方法进行致敏原的特异性鉴
定和其相关蛋白的同源性分析，从而确定其结构和特性。
3. 免疫学鉴定：借助ELISA、SDS-PAGE等技术探究其与人体血清蛋白的相互作用机制，分析不同吸附剂对致敏原抗原活性的影响等。
四、研究意义
本研究以中华绒螯蟹主要致敏原为研究对象，研究其分子结构、特性以及与人体血清蛋白的相互作用机制，深入探究其导致的过敏反应的发生机制。
结论可以为食品
工业的生产和消费安全提供科学依据和参考，有助于提高人们对食品过敏症的认识和
预防能力。
中华绒螯蟹在不同pH下氨氮排泄和血淋巴含氮成分的变化
螯 蟹 氨 氮排 泄 的影 响 ， 探 讨 了 在 不 同 ｐ 条 件 下 并 Ｈ
血 淋 巴含 氮物 质 的 组 成 。
１ 材 料 与方 法
１１ 实 验 材 料 成 熟 的 中华 绒 螯 蟹 雌 蟹 （ 重 ． 均
（ １ ． ± ．） ） 自安 徽合 肥 市 郊 的池塘 。将 购 回 １２ １ ５ ４ ｇ 购 的蟹 养 于 经 充 分 曝 气‘ 自来 水 中 ， 实 验 室 驯 化 的 在 １ ｄ 实 验前 ２天 和试 验 过 程 中均 不 投 喂 饲 料 ， ０， 以减 少摄 食 对氮排 泄 的影 响 。
国一些 地 区的酸 雨频 繁 活 动会 导 致 水 体 ｐ Ｈ下 降 到
５ ０以 下 ［ 。 ．
在 ， 们 直接 影 响 了 甲壳 类 血 淋 巴 的构 成 ， 短 沟 它 如
对虾 （ ｅａｕ ａ ｌ ｓ ） 血 淋 巴构 成 受 到 环 境 氨 Ｐ ｎｅｓ ｕｅ ｉ 的 ｐ ｎｓ 氮 、 态氮 、 硝 亚硝 态 氮 和盐 度 的 广 泛 影 响 ｌ １ 。但 目前 有关 环 境 因 子 对 淡 水 甲壳 类 氮 排 泄 和血 淋 巴 的影 响研 究 很 少 。本 文 研 究 了 环 境 ｐ 对 中 华 绒 Ｈ
关键 词 ：中 华 绒 螯 蟹 ；Ｈ； 氮 ； 淋 巴 ｐ 氨 血
中 图 分 类 号 ： ９ ８ １ Ｑ ５ ．１ 文 献 标 识 码 ： Ａ 文 章 编 号 ：０ ０３ ０ （ ０ ８ ０ —０ ２０ １０ —２ ７ ２ ０ ） １ ６ — ０ ６
中华绒 螯 蟹 （ ｒ ｃｅ ｎｎｉ） 我 国 重要 的淡 Ｅｉ ｈｉ ｓ ｅｓ 是 ｏ ｒｉ ｓ
样， 中华绒 螯 蟹 为 排 氨 动 物 ， 代 谢 终 产 物 主 要 氮
2014年度上海海洋大学大学生创新计划项目立项公示名单(上
实验师
21
临港地区高校防雨通道的设计—以上海海洋大学为例
薛琳杰
1219131
陈厉婧（1363207）
庄静
徐灿
讲师
讲师
22
发光细菌的连续培养与应用研究
罗火青
1313119
胡沛男（1313109）
刘蓓蕾（1313308）
沈天昊（1313118）
桂朗
讲师
23
基于地标点法的大洋性柔鱼角质颚形态学分析
钟佳明
张广鹏
1311121
尚跃勇(1311125)
刘毅庆(1311119)
王星火(1311129)
刘其根
教授
15
洋山港海域生物体内多环芳烃污染与食用风险评价
陈晨
1313201
张欣(1313217)
李佳妮(1313209)
李娟英
副教授
16
节水养殖模式下不同微藻对凡纳滨对虾生长性能的影响
郑晓龙
1311328
王鹏飞(1311324)
王安(1311501)
鹿曼(1311412)
谭洪新
孙大川
教授
讲师
10
鱼类的迁徙与线粒体基因的关系
王添祯
1313321
潘筱倩(1413209)
张东升
副教授
11
荧光双染色法在船舶压载水检测中的应用
王钰婷
1213507
魏海涛(1311321)
王一帆(1313329)
黄强(1313316)
吴惠仙
副教授
12
利用生物絮凝技术进行卤虫营养强化的关键技术研究
梁富（1222423）
张丽珍
教授
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中华绒螯蟹螺原体对中华绒螯蟹和RAW264.7细胞免疫反应研究
中华绒螯蟹螺原体对中华绒螯蟹和RAW264.7细胞免疫反应研究孟庆国;黄艳青;靳明建;顾伟;王文【摘要】中华绒螯蟹螺原体是一种引起中华绒螯蟹颤抖病的新型病原微生物,对中华绒螯蟹养殖业造成了很大的损失.虽然很多无脊椎动物免疫反应的研究已经报道,但是螺原体引起宿主免疫反应的研究目前还未见报道.中华绒螯蟹螺原体既可以感染中华绒螯蟹,也可以感染乳鼠.本文在动物个体水平上研究了中华绒螯蟹螺原体与中华绒螯蟹的免疫关系,中华绒螯蟹经螺原体刺激后,其体内抗脂多糖因子、酚氧化酶原、酚氧化酶原激活因子、消极素轻链等基因的mRNA的表达水平显著上升,而抗氧化蛋白Prx 6的表达量显著下降.本文还在细胞水平研究了中华绒螯蟹螺原体与小鼠巨噬细胞之间的免疫关系,中华绒螯蟹螺原体刺激后,细胞中CD40、IL-1β、IL - 10基因的mRNA表达量显著下降,而TGF -β1和TNF -α等基因的表达量上升.本实验结果说明螺原体可以引起寄主很广泛的免疫反应.%Spiroplasma eriocheiris is a new kind of pathogen in aquaculture and causes mass mortality of Chinese mitten crab Eriocheir sinensis, but little is known about the immune responses in E. sinensis challenged with this agent. Although immune responses in invertebrates have been widely studied, spiroplasma-induced innate immune responses have not been reported. The mRNA expressions of anti-lipopolysaccharide factor ( ALF) , prophenoloxidase (proPO) , proph-enoloxidase-activation factor (PPAF) , pacifastin light chain (PLC) and peroxiredoxin 6 (Prx6) immune-related genes were examined in order to estimate the effects of S. eriocheiris on the innate immunity of E. sinensis. All of the mRNA expressions of abovegenes except for Prx6 were significantly up-regulated after S. eriocheiris challenge. But the mRNA expression of Prx6 was significantly down-regulated after the same treatment. S. eriocheiris not only cause tremor disease of E. sinensis, but also can cause suckling mouse cataract just like Spiroplasma mirum. So we chose RAW264. 7 cell line, a murine macrophage-like cell, to study the relationship between the S. eriocheiris and the host in cell level. The expression levels of CD40 IL-1β IL-10 in RAW264. 7 cells were up-regulated after challenge with S. eriocheiris, while the expression levels of TGF-β1 and TNF-α were down-regulated. The results suggested that broad-spectrum immune re-sponses could be induced by S. eriocheir in both E. sinensis and RAW264. 7cell.【期刊名称】《南京师大学报（自然科学版）》【年(卷),期】2012(035)002【总页数】7页(P77-82,88)【关键词】中华绒螯蟹;RAW264.7细胞;螺原体;免疫反应【作者】孟庆国;黄艳青;靳明建;顾伟;王文【作者单位】南京师范大学生命科学学院,江苏省生物多样性与生物技术重点实验室,江苏省水生甲壳动物病害重点实验室,江苏南京210046;中国水产科学研究院东海水产研究所,农业部海洋与河口渔业资源及生态重点开放实验室,上海200090;江苏省如东县渔业技术推广站,江苏南通226400;南京师范大学生命科学学院,江苏省生物多样性与生物技术重点实验室,江苏省水生甲壳动物病害重点实验室,江苏南京210046;南京师范大学生命科学学院,江苏省生物多样性与生物技术重点实验室,江苏省水生甲壳动物病害重点实验室,江苏南京210046【正文语种】中文【中图分类】Q936中华绒螯蟹(俗称河蟹)是中国淡水养殖业中重要的养殖品种，但是病害一直危害其健康发展，其中“颤抖病”是最严重的一种病害，对江苏、安徽、浙江等长江中下游地区的河蟹养殖业造成了极大的危害［1，2］，前期研究表明螺原体是中华绒螯蟹“颤抖病”的致病菌［3］．通过系统分类学、血清学等方面的研究，命名该菌株为螺原体的新种Spiroplasma eriocheiris sp．nov［4］，这是首个被命名的淡水甲壳动物螺原体．螺原体(Spiroplasma)是一类缺乏细胞壁、呈高度多形性、能通过220 nm孔径滤器、能运动的、可在无生命培养基中生长繁殖的最小原核细胞型微生物，属于柔膜体纲(Mollicutes)、虫原体目(Entomoplasmatales)、螺原体科(Spiroplasmataceae)、螺原体属(Spiroplasma)［5］．传统上认为螺原体只与昆虫和植物有关，而最近从甲壳类动物分离到螺原体的事实改变了我们对螺原体宿主范围的认识［6］．通过16S rDNA序列制作的系统进化树来看，中华绒鳌蟹螺原体与非凡螺原体(Spiroplasma mirum)亲缘关系最近［2］．而前期研究证实，中华绒鳌蟹螺原体不仅能引起河蟹的“颤抖病”，还能像非凡螺原体一样引起乳鼠产生白内障症状［7］，最近研究发现非凡螺原体与疯牛病、羊瘙痒病等脑部的严重疾病相关联［8］．因此本论文中不仅选择无脊椎动物中华绒螯蟹作为感染对象，还以脊椎动物小鼠RAW264.7细胞为对象，在河蟹个体水平和小鼠RAW264.7细胞水平上，研究螺原体感染后2个宿主免疫相关基因表达量的变化情况．本文的研究为初步探索螺原体的分子致病机理和建立有效的防治技术奠定基础．螺原体按照本实验室建立的方法［2］分离自患病中华绒螯蟹体内，用R2培养基在30℃条件下培养．健康的中华绒螯蟹购自南京某水产品市场(50±3)g，经PCR、ELISA和显微镜检测无螺原体等病原菌，分成2组(每组40只中华绒螯蟹)，暂养1周后分别注射PBS(对照组)或培养至对数期的螺原体(10 μg/只，0.1 mg/mL)(实验组)．期间每天投喂人工配合饲料、每天换水．分别在感染后的0 h、1 h、3 h、6 h、12 h、24 h、48 h、72 h用1 mL医用无菌一次性注射器从中华绒螯蟹附肢关节结合处抽取约0.2 mL血淋巴，加入等体积的抗凝剂(葡萄糖，2.05 g;柠檬酸，0.8g;NaCl，0.42 g;双蒸水定容至100 mL)，5只中华绒螯蟹的样品混合，样品4℃1 000 g离心10 min以收集血细胞．应用Trizol(Invitrogen，USA)方法参照试剂盒说明书提取中华绒螯蟹血细胞的总RNA，利用Prime-Script RT reagent Kit试剂盒(Takara，Japan)反转录总RNA 为cDNA．应用SYBR Premix Ex Taq试剂盒(Takara，Japan)进行Realtime PCR实验对免疫相关基因进行定量．PCR反应采用25 μL反应体系:12.5 μL2×SYBR Premix Ex Taq，上下游引物分别1 μL，1 μL 反转录的 cDNA 和9.5 μL DEPC 处理过的双蒸水．Realtime PCR程序如下:95℃预变性2 min，接着40个循环的PCR反应(95℃ 10 s、60℃ 30 s)．用于定量的河蟹免疫基因有ALF、proPO、PPAF、PLC和Prx6，同时选择β-actin基因作为内参基因，引物序列见表1．不同基因的相对表达水平用 2－ΔΔCT方法进行计算，数据分析采用t测验方法，当p＜0.05时被判定为差异显著．小鼠巨噬细胞株RAW264.7在37℃、5%CO2条件下，用含10%胎牛血清和抗生素(100 U/mL青霉素和100 μg/ml链霉素)的1640完全培养液培养．培养好的RAW264.7细胞加入S．eriocheiris至终比例为1∶100，分别在诱导刺激后0 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、6 h 从细胞中提取总 RNA，反转录成 cDNA，具体操作如上所述．用于荧光定量PCR的反应体系和程序如上．基因相对表达采用2－ΔΔCt法计算，以0 min处理组作为空白对照组，次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因(HPRT)作为内参基因．为了研究S．eriocheiris诱导刺激对宿主免疫相关因子表达的影响，利用从中华绒螯蟹中克隆得到ALF［9］，proPO［10］，PPAF［11］，PLC［12］和 Prx6［13］ 5 个因子的基因序列，用 S．eriocheiris进行刺激中华绒螯蟹，收集血淋巴细胞并提取总RNA，Realtime RT－PCR分析各基因的表达，同时设置PBS刺激组作为对照．如图1所示，对照组0 h～72 h表达量变化不大，差异不显著;S．eriocheiris诱导刺激后，ALF mRNA表达量逐渐增加，在3 h时达到最大值(2倍)，3 h后表达量逐渐减少，24 h后又逐渐增加至正常值(48 h)，72 h时为最小值;proPo mRNA 表达量存在2个峰值，1 h为最大值(2.7倍)，1 h后表达量逐渐减少，6 h后表达量逐渐增加，24 h为第2个峰值，而后逐渐减少;PPAF mRNA表达量在1 h达到最大值(2倍)，1 h后逐渐减少，6 h后又增加至12 h、24 h为正常值，24 h后又开始减少;PLC mRNA表达量逐渐增加，在3 h达到最大值(1.3倍)，3 h后逐渐减少，12 h后又增加至24 h、为正常值，24 h后又开始减少;Prx6 mRNA表达量一直下调并处于较低水平．利用小鼠的CD40、IL－1β、TGF－β1、TNF－α和IL－10等先天性免疫相关基因，研究S．eriocheiris刺激小鼠巨噬细胞后这些基因表达量的变化情况．由图2可以看出，经S．eriocheiris刺激后，小鼠巨噬细胞中IL－1β(0 h～6 h)和IL－10(0 h～6 h)的表达量显著降低到极低水平(0.02倍);CD40的表达量(0 h～6 h)也显著降低(0.7倍)，它们的表达量都稳定在一个较低的水平;TGF－β1的表达量(0 h～6 h)一直处于上调状态，并在2 h和4 h达到峰值(2.6倍);TNF－α的表达量在2 h和4 h时显著上调，但幅度不大(1.6倍)．螺原体作为最小的能自我复制的微生物之一，是一种新发现的水生甲壳类病原微生物［6］．除了是中华绒螯蟹等淡水甲壳动物的病原微生物，还是海水甲壳动物南美白对虾Lifopenaeus vannamei的病原微生物［14，15］．S．eriocheiris不仅能感染中华绒螯蟹、克氏原螯虾和南美白对虾等甲壳动物，引起“颤抖病”等重大流行病，还可以像S．mirum一样能引起乳鼠的白内障［7］，并且研究发现S．mirum与疯牛病、羊瘙痒病等脑部的严重疾病相关联［8］．为应对日益严峻的动物疾病，除了要利用传统的生物学技术研究病原微生物自身的特征，还要针对寄主的免疫特性进行研究，研究寄主和病原微生物之间的免疫关系．不仅要研究微生物与动物机体之间的免疫关系，还要研究微生物与动物在细胞水平上的免疫关系．中华绒螯蟹感染S．eriocheiris后，体内ALF、proPO、PPAF、PLC和Prx6基因的表达发生了变化．这些基因都是中华绒螯蟹的主要免疫基因，并且这些基因全序列已经被发现［16，17］．本文首次研究螺原体和甲壳动物之间的免疫关系．ALF在甲壳动物先天性免疫中是一个重要的调节因子，它首先被发现作为一种潜在的抗凝剂，可以抑制外毒素介导的激活凝集通路［18］．随后的研究显示，ALF既具有强大的抗革兰氏阴性细菌的活性，又能抑制革兰氏阳性细菌的生长［19］．在目前研究的甲壳动物中，白斑综合病病毒(WSSV)可以引起龙虾Pacifastacus leniusculus ALF基因的上调，RNA干扰试验表明，ALF基因可以保护P．leniusculus以对抗 WSSV 的感染［20］．近期研究显示，双链 RNA ［21］和鳗弧菌(V．anguillarum)［9］都可以引起中华绒螯蟹ALF基因的上调．本次试验结果表明，S．eriocheiris刺激中华绒螯蟹后，也能引起ALF的上调．由此可以看出，ALF不仅能抑制含有细胞壁细菌的活性，对无细胞壁的螺原体也有作用．虽然经S．eriocheiris刺激后ALF表达量上升的具体机理还不清楚，但是ALF基因对增强中华绒螯蟹免疫力以对抗S．eriocheiris的感染具有正向调节作用．酚氧化酶原系统(proPO system)是无脊椎动物体内非常重要的先天性免疫系统，一旦病原侵入机体，酚氧化酶原系统会在丝蛋白酶的催化下使酚氧化酶前体(proPO)转变为有活性的酚氧化酶(phenoloxidase，PO)．在无脊椎动物体内，丝蛋白酶和丝蛋白酶抑制剂起到非常重要的生理作用，它们起到相互克制和动态平衡的作用，例如:食物消化、血淋巴凝结、胚胎发育和免疫反应．一旦它们之间的平衡被打破，生物体正常的新陈代谢出现紊乱，丝蛋白酶以及下游的反应对组织甚至机体起到破坏作用［22］．在甲壳动物中，罗氏沼虾(Macrobrachium rosenbergii)经CpG寡核苷酸刺激后［23］，锯缘青蟹(Scylla serrata)经 LPS刺激后［24］，梭子蟹(Portunus trituberculatus)经溶藻弧菌(V．alginolyticus)刺激后［25］，proPO 基因都明显上调．中华绒螯蟹经鳗弧菌刺激后，proPO基因也会上调［10］．S．eriocheiris刺激中华绒螯蟹后，proPO基因明显上调．酚氧化酶前体激活因子(Prophenoloxidase-activation factor，PPAF)可以激活酚氧化酶原变化为有活性的酚氧化酶．S．eriocheiris刺激中华绒螯蟹后，PPAF基因上调．同样，嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)刺激中华绒螯蟹后，血细胞中的PPAF基因也会上调．消极素(Pacifastin)是由一系列的丝蛋白酶抑制剂组成的大家族，它由重链和轻链2部分组成．在本实验中，S．eriocheiris刺激中华绒螯蟹后，血细胞中的PLC基因表达量会上调．同样在鳗利斯顿氏菌(Listonella anguillarum)刺激中华绒螯蟹后［12］，PLC基因表达量也会上调．考虑到酚氧化酶原系统是一个多功能的系统，它可以在寄主与病原作用的不同阶段起作用［23］．因此，一般病原刺激后酚氧化酶原相关基因的变化比较复杂．抗氧化蛋白(Peroxiredoxin)是一类无硒的过氧化酶家族，它能有效地减少或去除过氧化氢、过氧化亚硝基和其他一系列的过氧化物以保护机体器官对抗外界的氧化压力［26］．S．eriocheiris刺激中华绒螯蟹后，血细胞中的Prx6基因表达量显著下调，而对照组无明显变化．同样的情况还发生在中国对虾(Fenneropenaeuschinensis)经鳗弧菌刺激后［27］、斑节对虾(Marsupenaeus japonicus)经肽聚糖刺激后［27］和中华绒螯蟹经鳗利斯顿氏菌刺激后［13］．病原与整个动物有机体之间的关系非常复杂、难以深入研究，而在细胞水平的研究相对简单．鉴于中华绒螯蟹细胞的培养条件不是很成熟，我们选择小鼠巨噬细胞这一免疫相关细胞作为研究对象，研究S．eriocheiris在细胞水平与寄主之间的免疫反应．在这一部分中，我们研究了小鼠巨噬细胞被S．eriocheiris刺激后，TNF－α、TGF－β1、IL－1β、IL－10和CD40等先天免疫相关基因的表达变化情况．结果显示，S．eriocheiris都可以引起这些基因的显著变化．合并发酵支原体(Mycoplasma fermentans)脂蛋白刺激RAW264.7细胞后能引起促炎症因子IL－1β和TNF－α的过表达［29］，然而IL－10和TGF－β1在应对不同螺原体脂蛋白刺激时有不同的变化［30，31］．因此，我们可以看出RAW264.7细胞在应对不同病原刺激时，其细胞因子的反应大不相同．在本文中我们研究了S．eriocheiris刺激后，中华绒螯蟹和小鼠巨噬细胞免疫反应的变化，包括脊椎动物和无脊椎动物的免疫反应．同鳗弧菌、鳗利斯顿氏菌、嗜水气单胞菌和双链RNA一样，S．eriocheiris也可以引起中华绒螯蟹体内血细胞中ALF、proPO、PPAF、PLC和Prx6等免疫相关基因表达量的剧烈变化．S．eriocheiris还可以引起小鼠巨噬细胞RAW264.7中TNF－α、TGF－β1、IL－1β、IL－10和CD40等细胞因子的显著变化．这是首次研究螺原体与寄主之间的免疫关系，因此这方面的研究必将对螺原体致病机理的研究起到很大的推进作用．［1］ Wang W，Chen J X，Du K H，et al．Morphology of spiroplasmas in the Chinese mitten crab Eriocheir sinensis associated with tremor disease ［J］．Research in Microbiology，2004，155(8):630-635．［2］ Wang W，Wen B H，Gasparich G E，et al．A spiroplasma associatedwith tremor disease in the Chinese mitten crab(Eriocheir sinensis)［J］．Microbiology，2004，150(9):3 035-3 040．［3］ Wang W，Rong L W，Gu W，et al．Study on experimental infections of Spiroplasma from the Chinese mitten crab in crayfish，mice and embryonated chickens［J］．Research in Microbiology，2003，154(10):677-680．［4］ Wang W，Gu 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haemocytes ［J］．Aquaculture，2009，287(3/4):297-303．［18］ Tanaka S，Nakamura T，Morita T，et al．Limulus anti-LPS factor:An anticoagulantwhich inhibits the endotoxin-mediated activation of coagulation system ［J］．Biochemical and Biophysical Research Communications，1982，105(2):717-723．［19］ Somboonwiwat K，Marcos M，Tassanakajon A，et al．Recombinant expression and anti-microbial activity of anti-lipopolysaccharide factor(ALF)from the black tiger shrimp Penaeus monodon［J］．Developmental and Comparative Immunology，2005，29(10):841-851．［20］ Liu H P，Jiravanichpaisal P，Soderhall I，et al．Antilipopolysaccharide factor interferes with white spot syndrome virus replication in vitro and in vivo in the crayfish Pacifastacus leniusculus［J］．Journal of Virology，2006，80(21):10365-10371．［21］ Dong C，Zhao J，Song L S，et al．The immune responses in Chinese mitten crab Eriocheir sinensis challenged with doublestranded RNA［J］．Fish and Shellfish Immunology，2009，26(3):438-442．［22］ Simonet G，Claeys I，Broeck J V．Structural and 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Laboratory for Biodiversity ＆ Biotechnology and Jiangsu Key Laboratory for Aquatic Crustacean Diseases，School of Life Sciences，Nanjing Normal University，Nanjing 210046，China)(2．Key and Open Laboratory of Marine and Estuary Fisheries，Ministry of Agriculture of China，East China Sea Fisheries Research Institute，Chinese Academy of Fishery Sciences，Shanghai 200090，China)(3．Rudong Station for Fisheries Technology Extension，Nantong 226400，China)Abstract:Spiroplasma eriocheiris is a new kind of pathogen in aquaculture and causes mass mortality of Chinese mitten crab Eriocheir sinensis，but little is known about the immune responses in E．sinensis challenged with this agent．Although immune responses in invertebrates have been widely studied，spiroplasma-induced innate immune responses have not been reported．The mRNA expressions of anti-lipopolysaccharide factor(ALF)，prophenoloxidase(proPO)，prophenoloxidase-activation factor(PPAF)，pacifastin light chain(PLC)and peroxiredoxin 6(Prx6)immune-related genes were examined in order to estimate the effects of S．eriocheiris on the innate immunityof E．sinensis．All of the mRNA expressions of above genes except for Prx6 were significantly up-regulated after S．eriocheiris challenge．But the mRNA expression ofPrx6 was significantly down-regulated after the same treatment．S．eriocheiris not only cause tremor disease of E．sinensis，but also can cause suckling mouse cataract just like Spiroplasma mirum．So we chose RAW264.7 cell line，a murine macrophage-like cell，to study the relationship between the S．eriocheiris and the host in cell level．The expression levels of CD40、IL-1β、IL-10 in RAW264.7 cells were up-regulated after challenge with S．eriocheiris，while the expression levels of TGF-β1 and TNF-α were down-regulated．The results suggested that broad-spectrum immune re-sponses couldbe induced by S．eriocheir in both E．sinensis and RAW264.7cell．Key words:Spiroplasma eriocheiris，RAW264.7cell，eriocheir sinensis，immune response。
中华绒螯蟹（eriocheirsinensis）c型凝集素的抗菌功能研究
论文摘要作为模式识别受体，C型凝集素家族（CTLs）在识别和清除病原物的过程中扮演重要角色。
在本研究中，在中华绒螯蟹中发现一种新的CTL。
根据从肝胰腺cDNA文库里分离得到的ESTs克隆得到该基因的全长。
该基因全长为685bp 含开放阅读框（ORF）468bp，可编码155个氨基酸。
氮端含有信号肽和糖类识别结构功能域（CRD）。
通过实时定量PCR技术，检测该基因mRNA大量存在于肝胰腺中，在其他组织中很少甚至没有。
经过脂多糖（LPS）的免疫刺激，该基因mRNA水平明显上调。
该重组蛋白（rEsLecD）可以结合多种微生物，包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌和真菌。
同时，钙离子的存在可以增强该重组蛋白对细菌的结合能力，但钙离子在结合实验中不是必须的。
该重组蛋白与细菌的结合继而诱导病原微生物的凝集。
另外我们检测到这种重组蛋白能够抑制细菌的生长，并且有一定的杀菌作用。
更有趣的是，该重组蛋白可以引发血细胞体外包裹。
总之本研究结果预示着，该凝集素蛋白作为抗菌模式识别受体分子，在无脊椎动物的非特异性免疫系统中，扮演重要角色。
Lectins 作为一种模式识别受体（PRR），以细胞表面受体或者游离的可溶蛋白存在。
在识别异己和清除病原菌方面扮演重要角色。
他们识别并非特异性结合到细菌表面的糖残基，从而引发细菌的凝集。
Lectin因为不同的糖类识别结构域类型可以分为很多种。
其中C型凝集素是用来描述一种依赖钙离子的糖类结合蛋白。
C型凝集素通过典型的糖类识别结构域（CRD）与细菌表面糖残基结合并诱发一系列免疫应答。
关键词：中华绒螯蟹，先天免疫，C型凝集素ABSTRACTC-type lectins as one of pattern recognition receptors play great roles in recognizing and eliminating pathogens in innate immunity.In this study, a novel C-type lectin (EsLecD) was identified from Eriocheir sinensis. The cloning of full-length EsLeD cDNA were based on the initial expressed sequence tags (EST) isolated from a hepatopancreatic cDNA library .The full-length cDNA of EsLecD was 686bp with an open reading frame of 468 bp encoding a putative protein of 155 amino acids with a N-terminal signal peptide and a single carbohydrate-recognition domain (CRD). The mRNA transcripts of EsLecD was mainly detected in hepatopancreas but not in other tissues by Reverse transcription-PCR analysis and post LPS immune challenge, the mRNA expression level in hemocytes significantly up-regulated. The recombinant EsLecD(rEsLecD) protein can bind to some Gram-positive, Gram-negative bacteria and Yeast and Calcium (Ca2+) can increase the binding activity, but not essential. rEslecD may bind to pathogen with a wide range. The recombinant protein can inhibit the grouth of the microorganism we tested at absent of Ca2+. Our results showed rEsLecD agglutinated some microorganism in a Ca2+-dependent manner. Except for the binding activities, rEsLecD could induce the aggregation but does not happen in the absence of Ca2+. It has been shown that the rEsLecD could also stimulate hemocyte encapsulation. In conclusion, our study suggested that rEsLecD as a significant PRR have a part in recognizing invading pathogens in crabs and play a great role in innate immunity.Keywords:Eriocheir sinensis, innate immunity, C-type lectin目录论文摘要 (V)ABSTRACT ................................................................................................................. V I 第一章综述 (1)第一节甲壳动物动物免疫系统 (1)第二节C型凝集素简介 (5)第三节本研究的意义及技术路线 (12)第二章EsLecD基因的序列以及表达模式分析 (14)第一节EsLecD基因全长的克隆 (14)第二节EsLecD基因的序列分析 (20)第三节EsLecD表达模式分析 (24)第三章EsLecD的抗菌机制探讨 (28)第一节重组载体构建以及重组蛋白的表达和纯化 (28)第二节rEsLecD与细菌的结合以及钙离子依赖性分析 (35)第三节rEsLecD抑菌和杀菌活性的分析 (44)第四节rEsLecD凝集细菌活性分析 (46)第五节rEsLecD参与血细胞包裹作用的分析 (48)第四章总结及展望 (51)参考文献 (53)附录 (61)致谢 (62)第一章综述第一节无脊椎动物免疫系统免疫系统一般分为天然免疫（natural immunity）和获得性免疫（acquried immunity）,或者被称为先天免疫（innate immunity）和适应性免疫（adaptive immunity）。
中华绒螯蟹雌性亲蟹血淋巴生化指标与盐度的关系
中华绒螯蟹雌性亲蟹血淋巴生化指标与盐度的关系贾小燕;庄平;冯广朋;王瑞芳;卢俊;黄晓荣【摘要】设定淡水对照组和两个盐度组(盐度12,盐度25),分别在第0、3、6、12、24、48、72、96、144小时取样,研究盐度对中华绒螯蟹雌性亲蟹6项血淋巴生化指标的影响.结果表明,在0～144h内,盐度组中华绒螯蟹雌性亲蟹血淋巴总蛋白(TP)含量在前6h显著高于对照组(P＜0.05),96h后高低盐度组TP水平趋于一致,并保持在略高于对照组的稳定水平.葡萄糖(GLU)含量随盐度的升高而增大,盐度组GLU均呈先升高后降低趋势,盐度25组GLU在72 h达到最大值且显著高于盐度12组和对照组(P＜0.05).盐度12组甘油三酯(TG)含量呈降低趋势且在6 ～144 h显著低于对照组(P＜0.05),72 h后显著低于盐度25组(P＜0.05),盐度25组TG呈先下降后上升趋势,且在72 h后恢复至对照水平.盐度组碱性磷酸酶(ALP)活性呈先升高后降低趋势,盐度组乳酸脱氢酶(LDH)活性均在3h达到最大值,12 h取得最小值.分析认为,中华绒螯蟹雌性亲蟹由淡水进入咸水,其血淋巴TP、GLU、TG含量均发生显著性变化,推测其机体加强能量代谢,加速动用脂类和糖类作为能源物质以应对盐度突变刺激；并最先调节蛋白质代谢过程以响应外界坏境的渗透压变化进行渗透压调节,其机体最终能够适应外界较高盐度的水体.%Two salinity concentrations (salinity 12, salinity 25) and a control group of fresh water were set up in the experiment. The samples were respectively taken at0,3,6,12,24,48,72,96,and 144 h to study the effects of salinity changes on the hemolymph biochemical parameters of the female parent Chinese mitten crab (Eriocheir sinensis). The results showed that the values of total protein (TP) in salinity concentrations were significantly higher than that of the control group during the first 6 hours(P <0.05) while the values of TP intwo salinity concentrations reached the same level and kept a little higher than that of the control group after 96 hours. The values of glucose (GLU) increased with the increasing of salinity concentration, and the values of GLU both increased first and then declined in the salinity concentrations. The values of GLU in salinity 25 reached the maximum level at 72 h and were significantly higher than that of the other two groups (P <0.05). The values of triglycerides(TG)in salinity 12 declined gradually,and were significantly lower than that of control group during 6 -144 h( P <0.05) ,yet were significantly lower than that of salinity 25 after 72 h( P <0.05). The values of TG in salinity 25 declined first and then increased, and reached the same level as control group after 72 h. The values of alkaline phosphatase (ALP) both increased first and then declined in the two salinity concentrations. The values of lactate dehydrogenase (LDH) in the two salinity concentrations both reached the maximum values at 3 h and reached the minimum at 12 h. The result showed hemolymph TP, GLU, and TG all changed significantly during travelling from fresh water to saline water in parent Chinese mitten crab. It could be concluded that (1) the parent Chinese mitten crab enhanced the process of energy metabolism to deal with the sudden change of salinity and increased the use of lipids and carbohydrates as energy source. (2) the parent Chinese mitten crab first regulated protein metabolism in response to the changes of external osmotic pressure and finally adapted to the high-salinity water.【期刊名称】《水产学报》【年(卷),期】2012(036)001【总页数】7页(P91-97)【关键词】中华绒螯蟹;盐度;血淋巴;能量代谢【作者】贾小燕;庄平;冯广朋;王瑞芳;卢俊;黄晓荣【作者单位】中国水产科学研究院东海水产研究所,农业部海洋与河口渔业资源与生态重点开放实验室,上海200090;上海海洋大学水产与生命学院,上海201306;中国水产科学研究院东海水产研究所,农业部海洋与河口渔业资源与生态重点开放实验室,上海200090;上海海洋大学水产与生命学院,上海201306;中国水产科学研究院东海水产研究所,农业部海洋与河口渔业资源与生态重点开放实验室,上海200090;中国水产科学研究院东海水产研究所,农业部海洋与河口渔业资源与生态重点开放实验室,上海200090;华东师范大学生命科学学院,上海200062;中国水产科学研究院东海水产研究所,农业部海洋与河口渔业资源与生态重点开放实验室,上海200090;大连海洋大学生命科学与技术学院,辽宁大连 116023;中国水产科学研究院东海水产研究所,农业部海洋与河口渔业资源与生态重点开放实验室,上海200090【正文语种】中文【中图分类】S917.4中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)隶属于方蟹科(Grapsidae)绒螯蟹属，成蟹主要分布于长江干流及其附属湖泊水库，性腺发育至Ⅳ期后从淡水栖息地向河口咸水区进行生殖洄游［1］。
中华绒螯蟹血液指标研究的开题报告
中华绒螯蟹血液指标研究的开题报告一、选题背景和意义中华绒螯蟹是国内一种重要的食用蟹之一，其肉质鲜美，营养丰富，备受消费者喜爱。
目前，针对中华绒螯蟹的养殖已经逐渐成为了一种重要的产业，然而，养殖业中的疾病问题逐渐凸显。
而对于螃蟹这种无脊椎的生物，除了在形态上难以被诊断外，临床检查手段也十分有限，因此，如何为螃蟹疾病的诊断和治疗提供依据成为了亟待解决的问题。
血液是诊断螃蟹疾病的主要依据之一，而中华绒螯蟹血液成分的研究还非常有限，尤其是对于血液指标方面的研究较少。
因此，本研究将有助于为中华绒螯蟹疾病的诊断和治疗提供更为准确和可靠的依据，同时也为螃蟹类的健康发展提供了有力支持。
二、研究内容和方法本研究将主要从中华绒螯蟹血液中寻找关键的生物指标，包括白细胞计数、红细胞计数、血红蛋白含量、平均红细胞体积、平均血红蛋白浓度和血小板计数等血液指标。
我们将采用分离、测量与分析等方法，比较不同时期、不同饲养条件下的中华绒螯蟹血液指标的差异和变化情况，并结合临床疾病的表现，探究血液指标在螃蟹疾病诊断和治疗中的应用价值。
三、研究预期成果本研究预期能够获得中华绒螯蟹血液指标的变化情况，为螃蟹类疾病的诊断与治疗提供更准确和可靠的科学依据。
同时，也有助于为中华绒螯蟹养殖提供更加严密、科学的管理体系，从而提高养殖的产量和品质。
四、研究的可行性与局限性本研究中采用的方法和技术已经得到了充分的应用和验证，因此具有较高的可行性。
此外，本研究只是对中华绒螯蟹血液指标进行测量和分析，其他因素对疾病的影响仍需进一步探究，因此具有一定的局限性。
五、研究计划第一年：选取200只中华绒螯蟹，采集其血样构建血液指标数据库，并评估该数据库的可靠性。
第二年：根据选取的螃蟹血液指标进行分析和比较，探究血液指标在不同时期、不同饲养条件下的变化情况。
第三年：结合临床表现和统计分析结果，探究血液指标对疾病的诊断和治疗的应用价值，并验证该结果。
同时，对于结果的局限性和不足进行进一步的研究和探究。
中华绒螯蟹常见病原的分离鉴定、致病及免疫机制研究
中华绒螯蟹常见病原的分离鉴定、致病及免疫机制研究对患弧菌病的中华绒螯蟹进行了细菌性病原的分离和鉴定，从病蟹体内分离到三株病原菌，其生理生化特性、菌株形态及菌落形态均一致，经鉴定为副溶血弧菌（Vibrio parahemolyticus）。
人工注射感染健康蟹，2d内均发生死亡，死亡率100％，并且症状同自然发病症状相似，证实副溶血弧菌为中华绒螯蟹弧菌病的病原菌。
药物敏感试验结果表明，此病原菌对链霉素、利福平、卡那霉素、复方新诺明、环丙沙星、氟哌酸、四环素、氟嗪酸、复达欣、菌必治、萘啶酸等药物高度敏感。
分离菌株培养物经离心、（NH<sub>4</sub>）<sub>2</sub>SO<sub>4</sub>沉淀、透析、浓缩及过滤除菌获得的ECP蛋白具有明胶酶、几丁质酶、淀粉酶、酪蛋白酶、脂酶、磷脂酶等多种酶活性及溶血活性，但不具有脲酶活性，对中华绒螯蟹具有明显的致病作用。
利用硫酸铵盐析、Sephadex G-100凝胶层析和DEAE-Cellulose离子交换柱层析等方法，从其胞外产物中分离纯化出了2种胞外蛋白酶，用SDS-PAGE电泳测得两种蛋白酶的分子量分别为39.6kD和20kD。
39.6kD蛋白酶活性在50℃～60℃范围内热稳定性最好，最适pH为9，而20kD蛋白酶的最适温度为50℃，最适pH为8。
EDTA可抑制39.6kD蛋白酶的酶活性，金属离子Cu<sup>2+</sup>、Mg<sup>2+</sup>、Fe<sup>2+</sup>对39.6kD蛋白酶有一定的抑制作用，而Ca<sup>2+</sup>对酶有一定程度的激活作用，因此39.6kD蛋白酶是一种金属蛋白酶；PMSF可抑制20kD蛋白酶的酶活性，说明该酶属于丝氨酸蛋白酶类。
血蓝蛋白是中华绒鳌蟹重要的高分子量过敏原
血蓝蛋白是中华绒鳌蟹重要的高分子量过敏原张盈莹;朱黎娜;李韶深;侯丽英;李会强【期刊名称】《中国免疫学杂志》【年(卷),期】2015(000)010【摘要】目的：证明血蓝蛋白是中华绒螯蟹的一种重要的高分子量过敏原。
方法：采用裂解液法提取蟹总蛋白，通过SDS－PAGE、二维电泳及Western blot分析蟹中过敏原组分并进行比对，再通过质谱分析鉴定未知过敏原。
以临床中华绒螯蟹过敏患者的血清作为识别抗体，通过斑点免疫印记实验证明疑似蛋白的致敏特性。
结果：通过SDS－PAGE及二维电泳分析，证明本实验所提取的蟹总蛋白组分完全。
Western blot结果显示，中华绒螯蟹至少有18种与阳性血清反应的组分，其中，70～80 kD处两个蛋白处于同一等电点，可能为同一蛋白，且反应斑点清晰；质谱分析结果显示疑似蛋白为血蓝蛋白；斑点免疫印记结果显示血蓝蛋白与患者血清的反应频率为61％。
结论：血蓝蛋白为中华绒鳌蟹中一种重要的高分子量过敏原。
【总页数】6页(P1375-1379,1388)【作者】张盈莹;朱黎娜;李韶深;侯丽英;李会强【作者单位】天津医科大学医学临床免疫学教研室，天津 300203;天津医科大学医学临床免疫学教研室，天津 300203;天津市中医药研究院附属医院，天津300120;天津医科大学医学临床免疫学教研室，天津 300203;天津医科大学医学临床免疫学教研室，天津 300203【正文语种】中文【中图分类】R392.11【相关文献】1.急性高渗胁迫对中华绒螯蟹雄蟹组织中可溶性蛋白质、血蓝蛋白、血糖与肝糖原含量的影响 [J], 王悦如;李二超;陈立侨;王晓丹;张凤英;高露姣;龙丽娜2.磷脂和HUFA对中华绒鳌蟹幼蟹存活、生长、蜕壳及生化组成的影响 [J], 常国亮;吴旭干;成永旭;王宗凯;陆剑锋3.盐度和饲料添加剂对中华绒鳌蟹仔蟹成活率的影响 [J], 翁忠惠4.磷脂对中华绒鳌蟹幼蟹生长和饲料利用的影响 [J], 张艳艳;李珂;王晓晓;万乃宝;张伟5.中华绒鳌蟹幼蟹生长数学模型的初探 [J], 顾景龄;张云贵;刘祥云;杜育哲因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
中华绒螯蟹免疫增强剂的研究进展
櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄櫄 ｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ，２００３，１００（１６）：９１２８－９１３３．［６２］曹小莉．马铃薯抗晚疫病ＬＲＲ与氨基酸转运ＡＡＴ基因的分析与鉴定［Ｄ］．杨凌：西北农林科技大学，２０１７：９－３５．［６３］王冰林．马铃薯晚疫病水平抗性相关基因诱导表达谱及水平抗性机制初探［Ｄ］．武汉：华中农业大学，２００５：５８－６４．［６４］尹军良．西北地区马铃薯主栽品种的抗晚疫病性评价及致病疫霉菌候选核心ＲＸＬＲ效应基因的鉴定［Ｄ］．杨凌：西北农林科技大学，２０１７：６０－６３．［６５］ＰｏｔａｔｏＧｅｎｏｍｅＳｅｑｕｅｎｃｉｎｇＣｏｎｓｏｒｔｉｕｍ，ＸｕＸ，ＰａｎＳ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅａｎｄａｎａｌｙｓｉｓｏｆｔｈｅｔｕｂｅｒｃｒｏｐｐｏｔａｔｏ［Ｊ］．Ｎａｔｕｒｅ，２０１１，４７５（７３５５）：１８９－１９５．［６６］ＳａｌｖｉＳ，ＴｕｂｅｒｏｓａＲ．ＴｏｃｌｏｎｅｏｒｎｏｔｔｏｃｌｏｎｅｐｌａｎｔＱＴＬｓ：ｐｒｅｓｅｎｔａｎｄｆｕｔｕｒｅｃｈａｌｌｅｎｇｅｓ［Ｊ］．ＴｒｅｎｄｓｉｎＰｌａｎｔＳｃｉｅｎｃｅ，２００５，１０（６）：２９７－３０４．［６７］ＫｕｍｐＫＬ，ＢｒａｄｂｕｒｙＰＪ，ＷｉｓｓｅｒＲＪ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｓｔｕｄｙｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｓｏｕｔｈｅｒｎｌｅａｆｂｌｉｇｈｔｉｎｔｈｅｍａｉｚｅｎｅｓｔｅｄａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｍａｐｐｉｎｇｐｏｐｕｌａｔｉｏｎ［Ｊ］．ＮａｔｕｒｅＧｅｎｅｔｉｃｓ，２０１１，４３（２）：１６３－１６８．［６８］ＰｏｌａｎｄＪＡ，ＢｒａｄｂｕｒｙＰＪ，ＢｕｃｋｌｅｒＥＳ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅｎｅｓｔｅｄａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｍａｐｐｉｎｇｏｆｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅｒｅｓｉｓｔａｎｃｅｔｏｎｏｒｔｈｅｒｎｌｅａｆｂｌｉｇｈｔｉｎｍａｉｚｅ［Ｊ］．ＰｒｏｃｅｅｄｉｎｇｓｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＡｃａｄｅｍｙｏｆＳｃｉｅｎｃｅｓｏｆｔｈｅＵｎｉｔｅｄＳｔａｔｅｓｏｆＡｍｅｒｉｃａ，２０１１，１０８（１７）：６８９３－６８９８．［６９］ＡｒａｎｚａｎａＭＪ，ＫｉｍＳ，ＺｈａｏＫ，ｅｔａｌ．Ｇｅｎｏｍｅ－ｗｉｄｅａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｍａｐｐｉｎｇｉｎＡｒａｂｉｄｏｐｓｉｓｉｄｅｎｔｉｆｉｅｓｐｒｅｖｉｏｕｓｌｙｋｎｏｗｎｆｌｏｗｅｒｉｎｇｔｉｍｅａｎｄｐａｔｈｏｇｅｎｒｅｓｉｓｔａｎｃｅ［Ｊ］．ＰＬｏＳＧｅｎｅｔｉｃｓ，２００５，１（５）：５３１－５３７． ［７０］王 舰．马铃薯种质资源遗传多样性研究及块茎性状的全基因组关联分析［Ｄ］．北京：中国农业大学，２０１７：６０－８０．吕孙建，焦锦彪，袁雪梅，等．中华绒螯蟹免疫增强剂的研究进展［Ｊ］．江苏农业科学，２０２１，４９（１０）：１９－２３．ｄｏｉ：１０．１５８８９／ｊ．ｉｓｓｎ．１００２－１３０２．２０２１．１０．００４中华绒螯蟹免疫增强剂的研究进展吕孙建１，焦锦彪２，袁雪梅１，于 ?１，张海琪１，杭小英１，施伟达１，吴颖蕾１（１．农业农村部淡水渔业健康养殖重点实验室／浙江省鱼类健康与营养重点实验室／浙江省淡水水产研究所，浙江湖州３１３００１；２．西南大学动物科技学院，重庆北碚４００７１５） 摘要：近年来，水产养殖病害频发，抗生素和化学消毒剂滥用现象日益严重，对养殖水环境和人类安全都存在巨大威胁。
表达表皮生长因子酿酒酵母对长江水系中华绒螯蟹生长性能·免疫功能和肠道发育的影响
摘要 ［目的］研究表达表皮生长因子酿酒酵母对长江绒螯蟹生长性能、免疫功能以及肠道发育的影响。 ［ 方法］ 试验分为 ２ 组，对照组
饲喂基础日粮，试验组在 １ ｋｇ 基础日粮基础上添加 ５ ｍＬ 表达表皮生长因子酿酒酵母发酵液，螃蟹按照 １５ ０００ 只 ／ ｈｍ２ 进行投放，试验周
ｍｉｔｔｅｎ ｃｒａｂ （ Ｐ＜０．０５） ， ｔｈｅ ｓｕｒｖｉｖａｌ ｒａｔｅ ｉｎｃｒｅａｓｅｄ ｂｙ ６．１％． Ｔｈｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ ｈａｄ ｎｏ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔ ｅｆｆｅｃｔ ｏｎ ｔｈｅ ｃｏｎｔｅｎｔｓ
ｏｆ ｌｙｓｏｚｙｍｅ ｉｎ ｂｌｏｏｄ ａｎｄ ＳＯＤ ａｎｄ ＭＤＡ ｉｎ ｍｉｔｔｅｎ ｃｒａｂ ｔｉｓｓｕｅｓ； ｔｈｅ ａｄｄｉｔｉｏｎ ｏｆ Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓ ｃｅｒｅｖｉｓｉａｅｃａｎ ｃｏｕｌｄ ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ ｉｎｃｒｅａｓｅ ｔｈｅ
关键词 酿酒酵母；表皮生长因子；中华绒螯蟹；生长性能；免疫功能；肠道发育
中图分类号 Ｓ ９６３ 文献标识码 Ａ
文章编号 ０５１７－６６１１（２０２３）０６－００７８－０３
ｄｏｉ：１０．３９６９ ／ ｊ．ｉｓｓｎ．０５１７－６６１１．２０２３．０６．０２０
开放科学（资源服务）标识码（ＯＳＩＤ）：
该试验旨在研究酿酒酵母表达 ＥＧＦ 对长江水系中华绒螯蟹
生长性能、肠道发育以及免疫功能的影响。
１ 材料与方法
１．１ 试验材料 试验用长江水系中华绒螯蟹蟹苗购自南京
高淳，蟹苗按照 １５ ０００ 只 ／ ｈｍ２ 的密度投放至池塘中。
中华绒螯蟹血淋巴细胞观察
中华绒螯蟹血淋巴细胞观察张凤英;王进科【期刊名称】《水产养殖》【年(卷),期】2002(000)005【摘要】本文通过显微和亚显微结构的观察研究，表明中华绒螯蟹血淋巴液中存在细胞形态、超微结构不同的三种血淋巴细胞，即大颗粒细胞、小颗粒细胞和无颗粒细胞。
血淋巴液中三种淋巴细胞的含量分别为：大颗粒细胞7.97％，小颗粒细胞15.58％，无颗粒细胞76.45％。
光镜下大颗粒细胞体积最大，胞质内可见大量染色较深的粗大颗粒；小颗粒细胞体积较小，胞质内有较少的深染色细小颗粒；而无颗粒细胞体积最小，胞质内无颗粒。
电镜下三种血淋巴细胞的结构特征表现为：大颗粒细胞胞质内含有大量粗大的电子致密颗粒，细胞器稀少；小颗粒细胞胞质内含数量较少、体积较小的电子致密颗粒，细胞器丰富，高尔基复合体可见；无颗粒细胞内无电子致密颗粒，细胞器稀少，部分细胞质接近透明。
【总页数】3页(P30-32)【作者】张凤英;王进科【作者单位】南京师范大学生命科学学院水产科学研究所，210097;南京师范大学生命科学学院水产科学研究所，210097【正文语种】中文【中图分类】S96【相关文献】1.慢性乙型肝炎患者外周血单核细胞表面T淋巴细胞Tim-3、TLR4表达变化观察[J], 叶青;赵敏;冉紫晶;张诗琬;梅小平2.肺结核与肺炎支原体肺炎患儿外周血炎性反应指标及淋巴细胞亚群比例对比观察[J], 杨硕;段国辰;闫江泓;王乐3.干燥综合征患者外周血T淋巴细胞亚群及Th类细胞因子表达的变化观察 [J], 李学平4.外周血或骨髓肿瘤性NK细胞形态特征观察及其与反应性淋巴细胞的鉴别 [J], 王红梅;张慧慧;李兴武5.308nm准分子激光联合补肾消白方对白癜风疗效观察及对外周血T淋巴细胞影响 [J], 胡文韬;蒋宜芳;唐挺;贾敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
听课笔记③南京师范大学教授王文：虾蟹新型病原——中华绒螯蟹螺原体趋化性的初步研究
听课笔记③南京师范大学教授王文：虾蟹新型病原——中华绒螯蟹螺原体趋化性的初步研究《当代水产》杂志社独家报道：作者 | 程纯明来源 | 腾氏水产商务网-当代水产杂志社去年在华中农业大学的渔病会议上，来自南京师范大学王文教授的“虾蟹新型疫病——螺原体病的研究进展”的主题报告一出，台下一片沸腾，引发了无数同行兴趣。
而螺原体这个原本很多人并不关注的词汇，也开始为更多的水产人所熟悉和关注。
今年，同样的议题，王文教授又带来了哪些新的研究进展呢？今年报告题目是“虾蟹新型病原——中华绒螯蟹螺原体趋化性的初步研究”，中华绒螯蟹螺原体我们团队经过近20年的研究确定的一个水产新型病原，实验室围绕这方面做了大量工作。
螺原体是在上个世纪70年代被美国人发现的，最初是作为植物的柑橘和玉米非常重要的致病菌被发现和分离出来。
后来，我们在研究河蟹“颤抖病”时发现致病菌与螺原体非常相像。
后来，经过免疫学、分子生物学以及微生物学的鉴定，最后命名了新种，这也是国际上首次在水生甲壳动物中发现螺原体。
近年来除河蟹外，在克氏原螯虾、南美白对虾、罗氏沼虾以及最近的日本沼虾都有螺原体的感染，所以看来螺原体特别喜欢甲壳动物，而且它感染虾蟹的组织特异性表现得非常明显，为什么会有这种组织特异性？这正是本研究所要探究的。
先简要介绍下虾蟹螺原体的特点，我们发现虾蟹并不是通过消化道感染的螺原体，而是通过表皮和腮进入到虾蟹血淋巴系统，而血细胞是螺原体重要的靶细胞，螺原体进入血液后被血细胞吞噬后，非但没有被消灭掉，反而在里面形成一个滋生场所，大量滋生后再散出去侵染别的细胞。
它的侵染有非常的特异性，侵染所有结缔组织里而不侵染上皮组织，这也是为什么发病早期虾蟹发病早期并不表现颤抖，而是表现无力、不食，到了后期病原大量侵染神经组织，大概10~15天开始发病，表现为附肢的颤抖，这在河蟹发病过程中表现的非常明显。
而且我们经过后期的研究发现螺原体侵染的组织都是富含磷脂的组织，我们思考这种嗜神经性的机理是什么？这个病原有什么特点？它为什么要往这种富含磷脂的组织去？这也是我们本课题要研究的内容。
中华绒螯蟹血淋巴细胞钙激活钾通道研究
中华绒螯蟹血淋巴细胞钙激活钾通道研究段虎;王雪惠;孙金生【期刊名称】《海洋科学》【年(卷),期】2010(034)005【摘要】利用膜片钳技术之内面向外式,对培养2～24 h不同类型的中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)血淋巴细胞表达的钙激活钾(KCa)通道进行种类鉴别和特征研究.结果表明:在高对称钾溶液(200 mmol/L)中,只有小颗粒细胞表达大电导钙激活钾(BKCa)通道和中电导钙激活钾(IKCa)通道.其中BKCa通道电导为396 pS,通道的开放活动表现为矩形方波.同一钳制电压下,当浴液中[Ca2+]在0.3～3.0μmol/L范围内,通道开放概率和开放数目随Ca2+浓度增加而增加,当浴液中[Ca2+]达到100.0μmol/L,通道开放受到抑制,表现明显的钙依赖性失活;当浴液中Ca2+浓度为3.0μmol/L,钳制电压分别为-40mV和-80 mV时,通道平均开放时间分别为(0.032 33±0.007 41)s和(0.055 85±0.012 99)s(P<0.01),平均开放概率分别为0.596±0.125和0.961±0.012(P<0.01),说明通道开放具有电压依赖性.IKCa通道电导为88 pS,开放活动也表现为矩形方波.当浴液中Ca2+浓度为0.3、1.0μmol/L 时,通道不开放;而Ca2+浓度为3.0 μmol/L时通道开放,说明通道具有明显的钙依赖性,钳制电压分别为-40 mV和-80 mV时,通道平均开放时间分别为(0.01736±0.004 03)s和(0.022 62±0.016 16)s(P>0.05),平均开放概率分别为0.699±0.065和0.790±0.114(P>0.05),说明通道开放不具有明显的电压依赖性.药理学研究结果表明,40mmol/L四乙铵(TEA)灌流15 min能完全阻断KCa通道活动.这提示钙激活钾通道在甲壳动物细胞免疫中发挥重要作用.【总页数】7页(P55-61)【作者】段虎;王雪惠;孙金生【作者单位】天津师范大学,生命科学学院,天津,300387;天津市水产养殖病害防治中心,天津,300221;天津师范大学,生命科学学院,天津,300387;天津市水产养殖病害防治中心,天津,300221【正文语种】中文【中图分类】Q424;Q915.819【相关文献】1.电压依赖性钾通道和钙激活钾通道在高血压大鼠外周血淋巴细胞的变化 [J], 王凌鹏;罗健;梁平;张源明2.钙激活钾通道在中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis)血淋巴细胞免疫中的作用研究[J], 张亦陈;高雪微;孙妍;耿绪云;刘逸尘;孙金生3.中华绒螯蟹眼柄端髓X器官神经分泌细胞钙激活钾通道研究 [J], 赵景霞;孙金生;张子怡4.甲状腺乳头状癌患者术前外周血血小板/淋巴细胞比值和中性粒细胞/淋巴细胞比值及其与预后的关系研究 [J], 史巧静;刘佳;阙凯琳;韩宸;马进安5.口腔扁平苔藓患者外周血T淋巴细胞亚群及辅助性T淋巴细胞1/辅助性T淋巴细胞2的极化与中医证型的相关性研究 [J], 魏俭铭;郭秀敏;穆宏肖;遵胜;庞莹;艾淑珍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
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中华绒 螯 蟹 血 淋 巴抗 菌 活性 的初 步 研 究
陆宏达 ， 刘 凯
２０ ９ ） ０ ００
（ 上海水产大学生命科学与技术学院 ， 上海 摘
要 ：主要研究 了中华绒螯蟹血清和血细胞破碎上清液 （ Ｌ ） 大肠杆菌 、 Ｈ Ｓ对 嗜水气 单胞 菌 、 状芽胞杆 菌 蜡
和金黄色葡萄球菌 的抗菌活性 、 不同浓度 Ｈ Ｓ对抗 菌活性 的影 响以及血清 中抗菌 活性 的诱 导作用 。结 果显 Ｌ 示， 只有 Ｈ Ｓ对大肠杆菌 、 Ｌ 嗜水气单胞菌表现 出显著 的抗菌活性 ， 而血清对 ４种菌 、 Ｓ对 蜡状芽胞杆 菌和金 ＨＬ
黄色葡 萄球菌均未表现 出抗菌 活性 ； 随着 Ｈ Ｓ Ｌ 浓度的降低 ， 肠杆菌 的细 菌存 活指 数 （Ｉ迅速 Ｅ ， 菌活 大 ｓ） 升 抗 性迅速下降 ， Ｌ 浓度高低 直接影响抗 菌活性 的强弱 ； 注射灭活大肠杆 菌 ， 在 ｌ ２ｈ内表现 出抗菌 ＨＳ 通过 血清 ～４ 活性 的诱导作用 ． ６ 时抗菌活性最强 。 在 ｈ
Ａ ｓｒｃ ：ｈ ａ ｅ ｅｌ ｗｔ ｅａｔ ａｔ ｉｌ ｃｉ ｔ ｉ ｅｓｒｍ ａ ｄｈｍｏｙ ｓｔ ｓｐｒａ ｎ （ Ｌ ） ｂｔａ ｔＴ ｅｐ ｐｒｄａｓ ｉ ｔ ｎｉ ｃ ｒ ｔ ｉ ｔ ｅｕ ｎ ｅ ｃｔ ｌ ａｅ ｕ ｅｎｔ ｔ Ｈ Ｓ ｈｈ ｂ ｅ ａ ａ ｖｙ ｎ ｈ ｅｙ ａ
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关键词 ：中华绒螯蟹 ； 血淋巴 ； 血清 ； 血细胞破 碎 ｔ － ． 清液 ； 抗菌活性 中图分 类号 ：￥ １ ， ４ １ ９ ７ Ｑ ６ 文献标识码 ：Ａ
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第 ２ 第 ４期 ８卷
２０ ０ ６年 Ｉ １月
海 洋 渔 业
Ｍ ａｉｅ ｒｎ Ｆｉ ｅ ｉ ｓ ｓ ｒｅ ｈ
Ｖ０ ． ８． Ｎｏ ４ １２ ． ＮＯ ．， ２ ０ Ｖ ０６
文章编号 ：１０ ２９ （０ ６ ０ ０ ８ ０ ０４— ４ ０ ２０ ）４— ２５— ７