山慈菇(杜鹃兰)快速繁殖技术优化及铁皮石斛叶cDNA PCR文库的构建

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铁皮石斛的快速繁殖

4 生长与分化情况 4. 1 原球茎诱导
将野外采集的成熟种子，用洗洁精把种子表面洗净在自来水下冲洗１０ｍｉｎ，然后用７５％酒精消毒３０ｓ，无菌水清洗３遍，接着用０．１％升汞消毒１２ｍｉｎ，无菌水冲洗４－５遍，然后播种于（１）培养基中。暗培养７ｄ后，种子开始萌发，颜色有点发白，将萌发的种子放于光照下培养，数天后开始转绿，２０ｄ左右，取原球茎接种到原球茎增殖培养基（２）中，３０ｄ后，原球茎长势良好，为深绿色，结实的颗粒状，原球表面有茸毛状物，增值系数达５倍以上。 4. 2 原球茎分化及芽的增殖
铁皮石斛的组织快繁技术在生产上的优化、成功为兰科植物种质资源的保护及生产开辟了新的途径。此种快繁技术已应用于生产上，已收到很好的经济效益，与其它报道的文献不同的是在生产上也被证实此种方法在各阶段上的生长整齐度较好，管理方便，出苗时间缩短，大大的节约生产成本，提高经济效益，在商业生产上具有重要的意义。
浙江农业科学，２００５，２５（２）：１１８－３１４
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从丛苗里挑选３ｃｍ或者３ｃｍ以上高的小苗，３－４株／丛接种于壮苗、生根培养基（５）中，４５ｄ后，生根苗长得粗壮，根长且根粗壮，叶片平展好且粗、厚，深绿色。增加生根率和移栽的成活率。生长分化图见图１。
5 小结、意义及展望 5. 1 小结
试验过程中发现，本试验中的种子消毒效果很好，没有发现污染现象，且消毒时间把握很好，不会使种子受到损伤，萌发率达１００％；在原球茎接种时，要轻切割，即大颗粒只需稍分割即可，小颗粒尽量不要切割，切割过小或者把它压碎虽然增值系数高，不利于以后的分化成苗，使整个生长周期加长；原球茎分化及芽的增殖，在原球茎分化时，激素的适当配比可以使分化提早。芽的增殖方面，在生产上建议使用茎段平放增殖，虽然增殖系数低于丛苗的增殖系数，但茎段增殖芽长得整齐、粗壮而且在管理上也带来极大的方便，为生根阶段后出苗打下扎实的基础。试验证明，茎段增殖的小苗要比丛芽的小苗生根快，苗也长得粗壮结实，叶片肥厚，生长周期比较短，苗生长整齐，有利于炼苗，提高成活率，在商品生产上具有重要的意义。 5. 2 意义及展望

铁皮石斛的组织培养与快速繁殖

铁皮石斛的组织培养与快速繁殖摘要：实验以铁皮石斛优良品种的茎段为外殖体，诱导丛生芽，壮苗生根，从而实现大量繁殖。

当NAA 的浓度为0.3mg/L , 6-BA 的浓度为5mg/L 时，铁皮石斛丛生芽的增殖率最高。

在MS 培养基中，铁皮石斛壮苗生根的最好培养基为MS + 6 - BA ( 2mg/L ) + 20 ％香蕉汁。

不同激素浓度的6-BA 对铁皮石斛壮苗生根的影响比较得出，不加6-BA 的培养基小苗生根率低、发根迟、根数少；而加人6-BA 后以大幅度提高生根率，尤以在6-BA 0.4mg/L 的培养基中小苗生根快，根数多。

从不同培养基对铁皮石斛试管苗生长的影响看出，幼苗用MS 培养基比用KC 培养基培养生长好。

铁皮石斛培养60d 左右时生长速度最快。

香蕉提取液能促进生长，从而使苗的生长加快。

以MS ＋香蕉汁20 ％的培养基为最好。

关键词：铁皮石斛；组织培养；丛生芽；壮苗生根铁皮石斛是兰科著名的盆载观花植物，具有很高的观赏价值。

近年来，铁皮石斛培养及快速繁殖技术的研究，取得了很大的成果。

本实验对药用铁皮石斛茎段进行组织培养，提出了一套快速繁殖程序，为快速育苗提供了有价值的技术资料和科学依据。

利用组织培养技术，对药用铁皮石斛进行快速繁殖，是目前解决生产种苗问题的有效方法。

1 材料与方法1.1 试验材料铁皮石斛优良品种，来源于日本。

1.2 试验方法1.2.1 外植体的选取和预处理将从日本引进的生长旺盛的铁皮石斛健康植株，以茎芽为中心剪下，芽的上下各留0.5cm的茎段，用洗衣粉浸泡20min 左右，取出后再用自来水反复冲洗数次，备用。

1.2.2 外植体的灭菌将预处理过的外植体用75 ％的酒精溶液灭菌30 s，然后用无菌水冲洗l 次，将茎段腋芽的苞叶拨去，然后将0.1 ％的HgC12 溶液倒人烧杯中灭菌10 min ，灭菌过程中不断摇动烧杯使灭菌更加彻底，最后用无菌水冲洗5 、6 次将HgCl2溶液冲净并接种到培养基上。

一种铁皮石斛组织培养快速繁殖的方法[发明专利]

专利名称：一种铁皮石斛组织培养快速繁殖的方法专利类型：发明专利
发明人：王洁华,毛虹禹,宋秋芳,杨少辉
申请号：CN201811043248.0
申请日：20180907
公开号：CN109042329A
公开日：
20181221
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：本发明公开了一种铁皮石斛组织培养快速繁殖的方法，步骤为：(1)将铁皮石斛成熟蒴果浸泡在多菌灵可湿性粉剂稀释液中，水冲洗；在超净工作台中，用乙醇水溶液、氯化汞水溶液浸泡，置于无菌水中并放到恒温摇床内摇动，无菌水冲洗；(2)将铁皮石斛蒴果内絮状种子均匀撒到诱导培养基上，诱导出原球茎后继续培养至幼苗；(3)将幼苗接种到生根培养基，培养，获得健壮铁皮石斛成苗。

本发明的方法，可使铁皮石斛组织培养过程达到零污染，避免了现有方法中对铁皮石斛造成的资源耗费。

而且本发明将原球茎诱导和幼苗培养合为一步，节省了培养基的配制原料及配置时间，生根效果更好，成苗健壮，缩短了培养周期，提高了产量及质量。

申请人：天津大学
地址：300072 天津市南开区卫津路92号
国籍：CN
代理机构：天津一同创新知识产权代理事务所(普通合伙)
代理人：陆艺
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一种铁皮石斛互补脱氧核糖核酸表达文库的构建方法[发明专利]

专利名称：一种铁皮石斛互补脱氧核糖核酸表达文库的构建方法
专利类型：发明专利
发明人：杨忠太
申请号：CN201610759433.4
申请日：20160830
公开号：CN107779450A
公开日：
20180309
专利内容由知识产权出版社提供
摘要：一种铁皮石斛互补脱氧核糖核酸表达文库的构建方法，以Trizol一步法从4年生的铁皮石斛中提取总RNA，分离纯化mRNA，LDPCR法反转录合成双链cDNA，以λTripIEX2为载体，构建铁皮石斛cDNA文库，文库滴度以每mL含噬菌斑形成单位(pfu)的数目来表示，PCR扩增鉴定插入片段。

成功地构建了铁皮石斛cDNA表达文库，原始文库的噬菌斑滴度为43×105pfu/mL，总克隆数为
31×105，扩增后文库总滴度为68×109pfu/mL，对随机挑取的噬菌斑进行PCR鉴定，结果插入片段多分布在05～20kb之间，绝大部分在12～17kb左右。

所构建的铁皮石斛cDNA文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段。

申请人：杨忠太
地址：741000 甘肃省天水市秦州区莲亭路68号
国籍：CN
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铁皮石斛的组织培养与快速繁殖

铁皮石斛的组织培养与快速繁殖作者：洪香娇喻晚之熊正葵来源：《现代园艺》2008年第07期铁皮石斛又名黑节草，兰科石斛属多年生草本植物，是名贵的中草药，有重要的药用价值，具滋阴清热，生津益胃，止咳润肺之功效，主要分布在亚热带地区，我国分布在西南和南方沿海各省，铁皮石斛种子极小，无胚乳，自然条件下需与某些真菌共生才能萌发，很难用实生苗栽培，而传统的分株、扦插等方式的繁殖率极低，加上人为地过度采挖，已濒临灭绝，铁皮石斛组培技术的研究，能有效地挽救这一濒临灭绝的珍稀物种。

1 材料与方法1.1试验材料野生未开裂的铁皮石斛果实。

1.2外植体灭菌用75%酒精棉球仔细擦洗果实表面，无菌水冲洗3次，再用0.1%升汞灭菌3分钟，无菌水漂洗3次，在无菌的滤纸上，将处理过的果实切开一个口子，将种子撒播在培养基上培养。

1.3培养基1.3.1种子萌发培养基。

⑴MS，⑵1/2 MS。

1.3.2原球茎增殖培养基。

⑶1/2 MS+CM 20%(CM为椰汁)，⑷1/2 MS+6-BA 0.2 mg/L(单位下同)+NAA 0.2+CM 20%，⑸1/2 MS+6-BA2.0+NAA 0.2+CM 20%，⑹1/2 MS+6-BA 2.0+NAA 0.5+CM 20%，⑺1/2 MS+6-BA 2.0+NAA 0.2+IBA0.1。

1.3.3 壮苗培养基。

⑻MS+NAA 0.2+6-BA 0.1+香蕉泥20%。

1.3.4 生根培养基。

⑼MS+香蕉泥20%，⑽MS+6-BA 0.1+NAA 1.0+香蕉泥20%，⑾MS+NAA 0.5+香蕉泥20%。

1.4培养条件上述培养基均加蔗糖3%、琼脂0.7%、pH值5.8、培养温度25℃左右、光照12小时/天、光照强度1500~2000lx、湿度70%。

2 生长与分化情况2.1无菌苗的获得将经过处理后的种子接种到萌发培养基(1)和(2)上，先在暗培养箱中培养2天，再转入光照培养，1周后种子变得鲜绿，可见胚长大，15天后胚几乎充满整个种子，呈球形，30天后，种子部分发育成原球茎，圆球形的原球茎上有尖尖突起的叶原基，从原球茎的直径上来看，接种在1/2 MS的原球茎比接种在MS的原球茎直径大，因此1/2 MS更有利于种子的萌发。

山慈菇(杜鹃兰)快速繁殖技术体系的建立

兰的干燥假鳞茎,有消肿、散结、解毒功效,现广泛应用于抗肿瘤药物中。近年来由于过度开采,该药用资源极度匮乏。
研究表明,采用组织培养方法是获得大量优良种苗的途径之一, 然而采用分株繁殖、种子繁殖等方法都存在周期长、效率低的缺点。采用组织芽块繁殖方法具有周期短、取材丰富等优点,因此立题研究不同外植体、不同培养基成分等因素对组织芽块繁殖的影响,以寻找建立山慈菇快速繁殖体系的最佳途径。
结合国内外研究现状,本课题以组织芽块培养技术为基础进行繁殖体系研究,主要包括以下工作：1)培育山慈菇外植体,通过对照培养筛选出最佳外植体形态作为建立山慈菇繁殖体系的原料； 2)建立山慈菇快速繁殖体系,采用单因素变量法,筛选出最佳基本培养基、大量元素、单一激素、激素组合等影响因素,探讨最优培养基配方；3)观察不同山慈菇外植体的显微结构,通过分析其细胞结构与组成,研究山慈菇在形态发育过程中细胞结构的变化以及物质的积累过程,并验证最佳培养基配方；4)探究山慈菇的室外栽培技术,从移栽苗体选择及培育管理、营养土基质成分、苗床管理等各个方面进行分析,为大规模工业生产作准备。课题研究结果表明：黄褐色组织芽块和黄绿色组织芽块为建立快速
其中的外植体45天内的生长率为51.03%,增重率为52.49%。该研究解决了山慈菇的人工繁殖技术难题,为该资源的开发应用奠定了基础。

石斛兰组织培养和快速繁殖体系的建立与优化

石斛兰组织培养和快速繁殖体系的建立与优化贺佳;彭峰;江玉梅;夏冰;汪仁【期刊名称】《江苏农业科学》【年(卷),期】2010(000)006【摘要】以金钗石斛、蝴蝶石斛、索尼亚石斛的茎段为外植体,研究不同的消毒方法和激素水平对石斛兰组织培养和快繁体系的影响,并筛选适合石斛兰试管苗快繁的培养基.结果表明,在初代试验中对石斛兰的茎段消毒以0.1% HgCl2处理15 min为宜;MS+2.0～3.0 mg/L 6-BA+0.5～1.0 mg/L NAA为适宜的不定芽诱导培养基;适宜愈伤组织诱导培养基为MS+1.0～1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA;在继代培养基1/2MS+1.0~1.5 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA上,愈伤组织能够分化出状态良好的丛生芽并继续增殖;在培养基1/2MS+0.1 mg/L IBA+10%椰汁上,生根率达100%,试管苗生长健壮,根系良好.【总页数】3页(P70-72)【作者】贺佳;彭峰;江玉梅;夏冰;汪仁【作者单位】江苏省中国科学院植物研究所,江苏南京,210014;江苏省中国科学院植物研究所,江苏南京,210014;江苏省中国科学院植物研究所,江苏南京,210014;江苏省中国科学院植物研究所,江苏南京,210014;江苏省中国科学院植物研究所,江苏南京,210014【正文语种】中文【中图分类】S682.310.4+3【相关文献】1.石斛兰茎段组织培养再生体系的初步建立 [J], 张彦妮;钱灿;陈立新2.通过拟原球茎发生途径建立春石斛兰的组织培养体系 [J], 张爱香;常美花;刘会清;李素琴3.紫皮石斛兰组织培养体系的建立 [J], 刘会清;张爱香;常美花;李倩;抗艳红4.贵州产灯盏细辛组织培养快速繁殖体系的建立 [J], 张洁; 毛春燕; 刘利利; 曾丽娜; 刘红美5.韩城大红袍花椒组织培养快速繁殖体系的建立 [J], 张红娜;王卫平;解晶晶;姚静;雷瑞芳;卫婷;张妍因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

山慈姑(独蒜兰)的快速繁殖

ห้องสมุดไป่ตู้
山慈姑（独蒜兰）的快速繁殖
兰科植物独蒜兰Pleione bulbocodioides（Franch）Rolfe是生药山慈姑的基原植物，为常用中药，其假鳞茎具有清热化痰、解毒、消痈散结的作用，现已临枯竭而成濒危物种。为避免山慈姑（独蒜兰）资源灭绝，该论文研究解决山慈姑（独蒜兰）的人工繁殖技术，为山慈姑（独蒜兰）的可持续利用奠定基础。
本论文以山慈姑（独蒜兰）球茎和种子为外植体，进行组织培养和植株再生系统的研究结果如下：（一）以山慈姑（独蒜兰）球茎为外植体，比较附加不同浓度的6-BA、2，4-D和NAA的MS培养基对原球茎的诱导、芽的形成以及原球茎生根的影响。结果表明：以“MS+2 mg l-12，4-D+0.5～1.0 mg mg l-16-BA+0.05％干酪素+0.5％活性炭+3％蔗糖 +0.55％琼脂”为培养基，能够很好地诱导外植体脱分化，并促进脱分化后的外植体分化形成新的原球茎，再生原球茎在1／ 2MS+0.2 mg l-1NAA+0.5％活性炭+2～3％蔗糖 +0.55％琼脂的培养基上诱导生根，然后发育形成根系发达、茎干粗壮的幼苗。
（二）以山慈姑（独蒜兰）的成熟种子为材料，比较不同的前期处理、不同的培养基及培养条件诱导种子萌发、萌发种子的分化成苗及试管苗移栽的影响。结果表明：山慈姑（独蒜兰）丛生芽和原球茎的诱导及分化与材料处理、培养基状态和激素组合有关。
在（1）“MS+2.0 mg l-16-BA+0.2 mg l1NAA+3％蔗糖+0.50％琼脂，pH5.2～5.6”；（2） “MS+2.0 mg l-12，4-D+0.5 mg l16-BA+3％蔗糖+0.50％琼脂+1.0％活性炭+0.05％干酪素， pH5.2～5.6”培养基中种子萌发率都高达40％，在（1）培养基中，种子先萌发形成小球体，再由小球体发育成幼苗；在（2）培养基中种子先形成原球茎，部分原球茎直接发育成幼苗，部分原球茎通过丛生芽途径再发育成小苗。在（2）号培养基中发育成的小苗比在（1）号中的健壮，茎粗；在（3）“1／ 2MS+0.2 mg l-1NAA+2-3％蔗糖+0.2-1％活性炭 +0.45-0.50％琼脂”培养基则有利于独蒜兰再生植株小苗生根

杜鹃兰，山慈菇

杜鹃兰，山慈菇杜鹃兰资料杜鹃兰(Cremastra appendiculata）来自于兰科，杜鹃兰属。

假鳞茎卵球形或近球形，长1.5-3厘米，直径1-3厘米，密接，有关节，外被撕裂成纤维状的残存鞘。

叶通常1枚，生于假鳞茎顶端，花葶从假鳞茎上部节上发出，近直立，总状花序具5-22朵花。

花常偏花序一侧，多少下垂，不完全开放，淡紫褐色。

花期5-6月，果期9-12月。

产山西南部、陕西南部、甘肃南部、江苏、安徽、浙江、江西、台湾、河南、湖北、湖南、广东北部、四川、贵州、云南西南部至东南部（凤庆、西畴）和西藏。

生于林下湿地或沟边湿地上，海拔500-2900米。

此种是一个广布种。

唇瓣侧裂片的形状和中裂片基部肉质突起均有较大变化，蕊柱上部的狭翅也有类似情况。

开头缘分是个奇怪的东西，今天刚好看到了山慈菇的样品，查了查山慈菇的原植物，发现两年前的今天见过他的原植物。

于是翻了翻18年的图片，当时在药大镇坪园里面刚好遇见他开花，当时也不知道他的名字，以为只是个供观赏的兰花。

很巧的，两年，从校园到社会。

杜鹃兰也从植物到药材，我们来看与山慈菇相关的介绍。

山慈菇山慈菇为兰科植物杜鹃兰、独蒜兰或者云南独蒜兰的干燥假鳞茎。

兰科植物所有种属，均被列为国家重点保护的野生植物。

山慈菇归肝、脾经，具有清热解毒、化痰散结、善消燥痰的功效。

杜鹃兰的假鳞茎习称“毛慈菇”，近年来对山慈菇各品种的化学成分研究主要集中于杜鹃兰。

独蒜兰和云南独蒜兰的假鳞茎习称“冰球子”，之前在云南菜市场遇到过。

但是找不到图片了，下次去菜市场收集一下样品，再做介绍，这次先说杜鹃兰。

药理作用01细胞毒作用山慈菇总生物碱能使肿瘤细胞，停止在分裂中期，进而抑制肿瘤细胞增殖。

从山慈菇中分离出新的双菲类化合物，对结肠癌及乳腺癌细胞均有细胞毒作用。

山慈菇中所含成分具有细胞毒性，可直接杀死细胞。

山慈菇在抑制乳腺癌细胞增殖的同时，过量的山慈菇也会损伤细胞。

02抗痛风作用清热解毒药山慈菇中含有秋水仙碱，可治疗急性痛风性关节炎，能在几小时内缓解关节红肿热痛症状。

铁皮石斛互补脱氧核糖核酸表达文库的构建及分析

铁皮石斛互补脱氧核糖核酸表达文库的构建及分析【关键词】铁皮石斛/化学；,,石斛碱/生物合成；,,基因文库摘要：【目的】构建铁皮石斛互补脱氧核糖核酸(cDNA)表达文库，为克隆石斛活性成分生物合成相关功能基因的全长奠定基础。

【方法】以Trizol一步法从4年生的铁皮石斛中提取总RNA，分离纯化mRNA，LD_PCR(longdistancepolymerasechainreaction)法反转录合成双链cDNA，以λTripIEX2为载体，构建铁皮石斛cDNA文库，文库滴度以每mL含噬菌斑形成单位(pfu)的数目来表示，PCR扩增鉴定插入片段。

【结果】成功地构建了铁皮石斛cDNA表达文库，原始文库的噬菌斑滴度为43×105?pfu/mL，总克隆数为31×105，重组率为976%，扩增后文库总滴度为68×109?pfu/mL，对随机挑取的噬菌斑进行PCR 鉴定，结果插入片段多分布在05～20?kb之间，绝大部分在12～17?kb 左右。

【结论】文库质量鉴定结果表明，所构建的铁皮石斛cDNA文库具有较好的库容量、较高的重组率以及较大的插入片段。

关键词：铁皮石斛/化学；石斛碱/生物合成；基因文库中药功能基因的研究逐渐成为中药现代化研究的一个热点，因为功能基因和次生代谢酶基因决定了有效成分的结构与功能，是中药现代化的关键环节之一［１］。

在植物中药功能基因研究中，与基因组测序和表达序列标记(expressedsequencetag，ESTs)测序相比，药用活性成分生物合成相关基因的研究更受到重视，克隆基因的数量呈上升趋势，预示着天然产物后基因组时代的开启及一些天然产物生产方式的可能变革。

人们期望克隆中药有效成分的功能基因，并通过基因工程与化学的有机结合而形成新的基因药物。

石斛为名贵中药材，具有滋阴清热、生津益胃、润肺止咳、明目强身等功效。

石斛碱是石斛药材中最重要的活性成分之一，也是最早从石斛中分离出来的化合物［2-3］，为分离、克隆石斛碱相关功能基因，本文构建了铁皮石斛互补脱氧核糖核酸(cDNA)表达文库，为克隆全长石斛碱生物合成相关功能基因并进行功能鉴定奠定基础。

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由于具有较大的药用价值,因此对于山慈菇的需求量较大,同时自身繁殖率低,使得野生山慈菇(杜鹃兰)的生存状态恶化,数量急剧减少。因此,通过植物组织培养技术实现其体外的快速繁殖具有重大的药用、经济和环境意义。
课题以实验室培养的杜鹃兰为外植体,通过最佳基本培养基、最佳植物激素及浓度、最佳有机添加物及浓度的确定,再进行四因素四水平的正交试验,从而获得杜鹃兰体外快速繁殖的最佳培养条件。实验结果显示,最佳基本培养基为1/2MS培养基,最佳激素浓度为1.Omg/L NAA,最佳有机添加物浓度为100g/L土豆汁(PE)。
山慈菇（杜鹃兰）快速繁具有清热解毒、化痰散结等功效, 临床上常用作抗肿瘤药物。《中华人民共和国药典》(国家药典委员会,1995,2000,2005)记载：山慈菇为兰科(Orchidaceae)植物杜鹃兰(Cremastra appendiculata (D. Don) Makino)、独蒜兰(Pleione bulbocodioides (Franch.) Rolfe)或云南独蒜兰 (Pleione yunnanensis Rolfe)的干燥假鳞茎,主要分布于四川、云南、贵州等长江以南各果。以5pg的达的基因提供了较方便的方法参考。
ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ
正交试验结果显示,1/2MS+50g/L BE+50g/L PE+0.75mg/L6BA+0.75mg/L NAA,30.0g/L蔗糖,3.0g/L活性炭,5.5g/L琼脂,pH 值5.8～6.2,为杜鹃兰体外快速繁殖的最佳培养条件。另选取各个生长时期具有特征的材料,采用石蜡切片技术对杜鹃兰形态发生过程进行观察,结合杜鹃兰外部形态发育过程,对其发育进行初步研究。
另以RACE技术为基础,铁皮石斛(Dendrobium candidum)叶总RNA 为起始材料,通过逆转录和末端转移构建出两端含有特定序列的 cDNA,然后以连接有引入序列的引物进行PCR,在实验条件下扩增生物体中微量cDNA放大100倍以上。