显微镜-普通格式

显微镜
【实验目的】
1)熟悉显微镜的构造及原理;
2)学会显微镜的调整和使用、以及测量微小长度的方法;
3)理解数值孔径与显微镜分辨本领的含义，验证显微镜分辨本领与物镜数
值孔径的关系
【仪器用具】
1)生物显微镜；
2)测微尺；
3)测微目镜；
4)被测物(透射光栅及生物切片)；
5)2号鉴别率板；
6)光阑及其支架。

【测量原理】
显微镜是用来观察和研究微小物体的助视仪器。

显微镜已广泛地应用于现代科学技术和生产和各个领域，没有显微镜的发明和发展，就不可能有现代科学许多领域的发展。

1)显微镜的基本光路
图1显微镜的光路图
显微镜的最主要部分是物镜和目镜。

为了简单起见，可以把构造复杂的物镜和目镜都当作是一单独的薄凸透镜。

其光路见图1。

物镜L O 的焦距O f 很短，待观察物体PQ 放在它前面距离略大于O f 的地方(设物距为O s )使PQ 经
L O 后成一放大实象P'Q'(设象距为O s ')。

然后再用目镜L E 作为放大镜来观察这
个中间象。

中间象P'Q'应放在目镜L E 的第一焦点F E 以内(设物距为E s )，经过目镜后在明视距离(s ''＝25cm)处成一放大虚象P"Q"。

因为
s s E ''
-='(1) E
E E f s s '=-'111(2) ∆+'+'=-'E O E o
f f s s (3) O
O O f s s '=-'111(4) 式中E s '代表目镜与显微镜最后成的象P"Q"的距离，∆代表物镜的第二焦点O
F '到目镜的第一焦点F E 的距离，即光学间隔。

所以在s ''、O f '、E f '、∆给定不变的情况下,O s 是一个确定的数值，其大小略大于O
f ',O s 只有等于这个
数值时我们才能通过目镜在明视距离处看到清晰的象P"Q"。

从显微镜中能看到物体的清晰图象时，物镜前表面到被观察物体的距离叫做显微镜的工作距离, 它近似等于O s -。

为了得到清晰图像而进行的调节O s 大小的工作叫调焦。

O s 增长一点或减小一点仍然可以看清物体的图象.这个O s 允许增大及减小的最大范围叫做焦深(depth of focus)。

2) 显微镜的放大本领 物镜的横向放大率为PQ Q P O ''=
β, 目镜的横向放大率为Q p Q P E '
'''''=β而显微镜的横向放大率β定义为P"Q"的长度与物体PQ 长度之比，即PQ Q P ''''=β，由此可得放大倍数的关系式为E O βββ⋅=(5)
物镜的横向放大率O β近似地等于物镜和目镜的光学间隔∆(O
F '到F E 的距离)除以物镜的第二焦距,即
O O f '∆-=β (6)
由此式可以看出物镜的放大率并不是物镜本身固有的一个特征，除了与物镜自身的焦距有关，还与物镜、目镜之间的光学间隔有关。

而目镜的横向放大率可近似为E
E f s '''=β(7) 故显微镜的横向放大率为E O
f s f M '''⋅'∆-=。

当P"Q"成象在明视距离S"时，显微镜的视角放大率与横向放大率数值相等，此时有
E O f f M '⋅'∆-=25 (8)
3) 显微镜的分辨本领
图2艾里斑
一个点光源经透镜成像后，在普通对比度下，呈现为一个亮点，然而增强对比度后，会发现物像不是一个点，而是一个衍射花样，中央是明亮的圆斑，周围有一组较弱的明暗相间的同心环状条纹，把其中以第一暗环为界限的中央亮斑称作艾里斑，见图2。

艾里斑是以英国皇家天文学家乔治·比德尔·艾里的名字命名的。

因为他在1835年的论文中第一次给出了这个现象的理论解释。

两个点光源所成的像将是两个爱里斑。

如果这两个点光源（两个物点）相距很近，而他们形成的衍射圆斑又比较大，以至两个圆斑绝大部分互相重叠，那就分辨不出是两个物点了。

如果一个点光源的衍射图样的中心刚好与另一个点光源的衍射图样的第一级暗纹相重合，一般人的眼睛就能刚好分辨出这是两个光点的像。

这时，我们说这两个点光源恰好为这一光学仪器所分辨。

这一恰能分辨的条件称为瑞利（Reyleigh）准则。

图3能够分辨、不能分辨、恰能分辨3种情况比较
图3所示为光学系统能够分辨，不能分辨和恰能分辨3种情况的比较。

根据瑞利准则，光学系统的最小分辨角就是艾里斑的角半径。

对于直径为D 的物镜，这一角半径可以表示为：
1.22R D λ
θ= (9)
根据显微镜的性能，它的分辨本领不用最小分辨角而用最小分辨距离来衡量。

从（9）式出发，再结合阿贝正弦条件可以导出显微镜的最小分辨距离： 0.610.61sin y n NA λλδα==⋅ (10) 其中n 为物方的折射率，α为孔径对物点的半张角。

sin n α称为显微镜的数值孔径，用NA 表示。

并将其具体数值标在显微镜的物镜上。

在波长一定的情况下，数值孔径越大，显微镜的分辨率也就越高。

图4所示为低、中、高三种数值孔径的情况。

图4低、中、高三种数值孔径
图5不同数值孔径的物镜的成像效果对于高数值孔径的情况，可以清晰分辨出各个小球，而对于中数值孔径物镜成的像，分辨起来就比较困难，在低数值孔径的情况下，所有小球的像重叠在一起，根本无法分辨出单个小球。

图5不同数值孔径的物镜的成像效果
【仪器介绍】
1)显微镜的构造
图6显微镜的构造
实际使用中的显微镜种类很多，构造也比较复杂。

我们实验中将要使用的生物显微镜的构造如图5. 老式显微镜多采用直筒镜台，其镜筒是直的，但为了以比较舒适的姿势进行观察, 可以借助于镜座附近的倾斜关节向前倾斜镜筒。

这种类型的显微镜的光源就安装在镜座内，镜筒通过棱镜系统向观察者倾斜一定的角度，而载物台呈水平位置，它的聚焦可以通过移动载物台进行，因此镜筒是完全固定的，这就使得在镜筒上可以装置照相机、投影屏、光度计等各种较重得附件，大大开拓了了显微镜的用途。

实验中用的生
物显微镜配有10×，40×，100×的物镜和5×，10×，16×的目镜各一套，将它们相互组合可以得到不同的放大倍数。

不同放大倍数的物镜和目镜,，其焦距和孔径是不同的。

放大倍数越大，焦距就越短，孔径就越小。

在使用高倍镜头时因有焦深小、视场小、工作距离短及视场暗等特点，给调节带来一定困难，使用中要格外小心。

这种显微镜在使用人工光源时, 可以先开启电源开关，调节亮度钮可以改变灯泡发光亮度以获得最佳照明；使用自然光源时，将集光镜逆时针旋转到位后拿下，换上反射镜，调节反射可获行明亮的视场。

物镜是显微镜的最重要元件，是装在一个镜头内部的一组透镜，其中最前面的一块称为“前透镜”,是唯一起放大作用的透镜，其余透镜因只用来消除前透镜的象差, 故称为修正透镜。

转动粗动手轮可使工作台较快地升高或降低，调节微调手轮可看到清晰的象。

转动工作台上纵向移动手轮使工作台同标本作前后方向移动，转动横向移动手轮可使标本作左右方向移动。

2)测微目镜
图7测微目镜及其内部结构
测微目镜是带测微装置的目镜，由目镜、可动分划板、读数鼓轮与连接装置等组成，其结构如图7所示。

目镜把叉丝和被观测的像同时放大，其放大倍数不影响测量数据的大小。

旋转鼓轮，刻有十字叉丝的可动分划板就可以左右移动，它的位置可以在外面直接读出。

测量时，应先调节目镜，看清楚叉丝，然后转动鼓轮，使基准线与被测物的像一端重合，便可得到一个读数。

再转动鼓轮使基准线与被测物像的另一端重合，又可得到一个读数。

两读数之差，即被测物的尺寸。

其读数方法和螺旋测微器差不多，测量时，双基准线夹住待测刻线时读数，整数位在视野中读取，小数位在鼓轮上读取。

读数鼓轮每旋转一周，叉丝移动1mm，鼓轮上有100个分格，故每一格对应的读数为0.01mm，再估读一位。

注意事项：
4)测量时，鼓轮应沿同一方向旋转，不得中途反向，以避免空程误差。

5)被测量物的线度方向必须与基准线方向平行，否则会引入系统误差。

6)被测量物的像与基准线重合，不能存在视差
7)虽然测微目镜测量范围为0～10mm，但一般测量应尽量控制在1～
9mm范围内进行，以保护测微装置的准确度，切忌读出负值。

8)零点修正值的存在，注意整数位的读法。

3)测微尺
图8测微尺
物镜测微尺为一特制的玻片，中央圆圈内有一个1毫米（mm）长分为100个等距离小格的刻线，每一个小格即为10微米（µm）（图8）。

4)分辨率版
图9分辨率板结构
分辨率板的结构如图9所示。

常用的分辨率板有两种，每板上面都有25个单元图案，每个单元有四个方向，每个方向都由一些平行的刻线所组成的。

2号板从第1单元到25单元，条纹宽度从20m μ递减到5m μ；3号板则从40m μ递减到10m μ。

【实验内容和操作要点】
1) 显微镜的调节和使用:
⒈装上目镜和物镜,物镜可装10×及40×两种。

先用低倍物镜，转动物镜转换器，听到“咔”的响声后，说明物镜已对准了目镜。

⒉接通照明电源并拨动亮度调节钮，使视场内亮度适当。

⒊将被观察的样品放在载物台上，先用低倍物镜寻找被观察的部位。

旋动调焦粗调及微调手轮，直到看见清晰的象，将被观察部分利用工作台的纵向及横向移动手轮调到视场中心。

如果要用高倍物镜时，可转动物镜换上高倍物镜，然后稍微调节微调手轮，就可以清晰聚焦了(注意：生物显微镜由低倍换高倍这个办法是有条件的，即物与物镜之间不能有东西，或者只有厚
度小于0.17mm的盖玻片，否则换高倍镜头用这个方法，镜头会碰到样品造成损失）。

⒋由于高倍物镜的工作距离很短，如我们这次用的生物显微镜的工作距
离为：10×物镜工作距离为6.3mm，40×时为0.5mm，100×时为0.1mm。

调焦一不小心就可能使物镜与被观察物挤压而造成物镜或被观察样品的损坏。

为了避免这种事故，我们规定此种显微镜的调焦操作规程如下：先调整旋钮使工作台慢慢升高，使被观察物慢慢靠近物镜头而不接触。

做这一步时眼睛必须在旁边监视，千万不要让被观察样品与物镜头相接触！然后眼睛通过目镜观察视场，这时只允许工作台下降使样品与镜头之间的距离增大进行调焦工作。

这个规定无论使用多大放大倍数的镜头都必须严格遵守.
2)物镜放大倍数的测定、微小物体的长度测量
1．用测微目镜代替显微镜的目镜，调节照明亮度，把测微尺放在显微镜载物台上,调焦。

测量测微尺的某一段长度y(尽量取大些，以减小误差)经物镜放大后的中间象长y'(注意使测微目镜中刻度尺的方向与的'y
方向一致)。

从而计算出物镜的放大倍数
'y y
β=，与物镜上所标的数值作比
较，说明二者不同的原因。

.
2．将测微尺换成全息光栅，调焦，测出光栅条纹间距经物镜放大后的中间象长，由此得出未知长度(可测量若干条条纹间距再除以条数得到)，算出光栅的空间频率。

3)显微镜分辨本领的测定
1．仍用10×目镜代替测微目镜，将移测显微镜上用的3×物镜装在生物显微镜的物镜转换器上。

转动物镜转换器，使3×物镜对准镜筒。

⒉把装在特制套筒里的鉴别率板放在载物平台上，调显微镜的照明并调
焦，使 2 号鉴别率板从显微镜中看去最清楚，并转动工作台的纵向和横向移动手轮，使鉴别率板的图象在视野正中。

⒊将带有小圆孔的特制圆罩盖在鉴别率板套筒上，小圆孔与物镜头的距
离很近。

重新调整载物台的纵向及横向移动手轮，使圆孔与显微镜共轴。

⒋从显微镜中看到的鉴别率板有25组方块，每组方块中有四组平行条纹，其中单元号码小的平行条纹间距大，号码大的条纹间距小。

号码大到一定程度方块中会模糊一片，看不出条纹。

记住那个临界的刚刚能看出有条纹的方块号码(每一组中有四个方块，只要一个方块个中看出有条纹就算这一组有条纹)。

⒌从本实验的附表中查出2号鉴别率板相应单元号码的条纹宽度，这个便是加了圆孔光阑的被测显微镜实际的最小分辨距离。

这是实验测得的y δ数据(记作实y δ)。

⒍测量物镜的数值孔径
由光阑与鉴别率板之间的距离d 以及光阑的孔径φ，代入
sin 2NA n d
ϕ
α=≈
(11)
算出数值孔径。

其中φ、d 的值由测量显微镜测出。

将NA 值代入(10)式，即可算出理y δ(理论)值(其中λ按550nm 计算)。

将实y δ与理y δ作比较。

注意:鉴别率板上复盖有一层较厚的玻璃片，因此不得用高倍物镜去观察它, 否则会损坏仪器。

用低倍物镜已足够清楚。

【数据记录】
1) 物镜放大率的测量
0'
y y
β=
=
2)光栅条纹间距的测量
光栅空间周期1 y =
3)显微镜分辨本领
分辨率实验值
光阑直径
(mm)
刚能分辨的单
物镜数值孔径的测量
光阑直径(mm)
分辨率实验值和理论值的对比
光阑直径
(mm)
δ
[附表]：分辨率板条纹宽度及分辨率角值
【思考题】
1.在实验中测出的物镜放大倍数经常比标称值大很多，比如测得β
0=46.85，而标称值才40，这是为什么？
2. 一张全息照片的干涉条纹最密得是2500lin/mm，即干涉条纹的空间
周期为0. 4μm，如欲在生物显微镜下观察，试问不用油镜头又行不行？为什么？(注:生物显微镜的100×物镜使用时要在物和物镜间加油，以便增大NA值，所以把这个镜头叫做油镜头。

)已知油镜头( 物镜)的放大倍数为100×，数值孔径为1.25，而放大倍数仅次于它的物镜为40×，数值孔径为0.65, 照明光波长以于550nm计算。

（要有计算过程）
【阅读材料】
光学显微镜如何变成纳米显微镜
———2014 年诺贝尔化学奖介绍
2014 年10 月9 日瑞典皇家科学院宣布把2014 年诺贝尔化学奖授予埃里克•贝齐格、斯特凡•黑尔和威廉•莫纳，以表彰他们在超分辨率荧光显微技术领域取得的突破性成就。

血红细胞，细菌，酵母菌以及游动的精子。

当17世纪的科学家们第一次在光学显微镜下看到这些活生生的生物现象时，一个崭新的世界在他们的眼前打开了。

这就是光学显微成像技术的诞生。

自那以后，光学显微镜已经成为生物学研究领域最重要的工具之一。

图1：在19世纪末，恩斯特•阿贝（Ernst Abbe）对光学显微镜的分辨率限制做出了界定，认为大约是光波长的一半，即约为0.2微米。

这意味着科学家们可以辨别完整细胞，以及其中一些被称为细胞器的组成部分。

然而，他们却无法分辨一个正常大小的病毒或者单个蛋白质。

然而，长期以来，光学显微成像技术的发展却一直受制于一个物理极限值的约束。

1873年，显微技术专家Ernst Abbe提出了传统显微成像技术的物理极限值：这种技术的分辨率将永远不能超过0.2微米。

这一预言导致在20世纪的绝大多数时间里，科学家们都相信光学显微成像技术将永远无法让他们突破到更细微的尺度上(图1)。

一些细胞内部的细胞器，如为细胞活动提供能量的线粒体，它们的轮廓是可以看到的。

但要想进一步观察更小的对象，如细胞内部单个分子之间的相互作用则是根本不可能做到的。

然而Abbe提出的这一物理极限由于今年的诺贝尔化学奖获奖人的工作被突破了。

从理论上说，现在再也没有任何障碍，阻止科学家们对更小尺度上的物体进行观察了。

于是，显微成像变成了纳米显微成像。

借助于纳米显微镜，科学家们可以看到活细胞内单个分子走过的路径，可以看见大脑内分子是如何在神经细胞之间创立连接的；他们可以追踪受精卵分裂成胚胎过程中的单个蛋白质。

超越Abbe极限的途径不是单一的，此次化学奖表彰的就有两种方法。

一种是由斯特凡•黑尔发展的受激辐射耗尽显微技术。

此项技术采用两束激光，一束负责激发荧光分子发光，另外一束抵消大部分荧光，只留下一块纳米大小体积的荧光区域。

用这样的光斑一纳米一纳米的扫描样品，就可以实
现纳米级的分辨率。

埃里克•贝齐格和威廉•莫纳分别独立研究，即单分子显微技术。

这种方法依赖于开关单个分子荧光的可能性。

科学家对同一区域进行了多次“绘图”，每次仅仅让很少量的分散分子发光。

将这些图像叠加起来产生了密集的纳米尺寸超分辨率图像。

今天，纳米显微技术被世界广泛采用，新知识源源不断地产生，造福着人类。

【参考文献】
1.新编基础物理实验，吕斯骅，高等教育出版社，2006
2.普通物理实验指导，陈怀琳，邵义全，北京大学出版社，1990
3.光学，赵凯华，高等教育出版社，2004
4.纪伟,徐涛,刘贝. 光学超分辨荧光显微成像——2014年诺贝尔化学奖解
析[J]. 自然杂志,2014,06:404-408.
5.光学显微镜如何变成纳米显微镜——2014年诺贝尔化学奖介绍[J]. 化学
通报,2014,11:1024-1028.。