牡丹ACO基因cDNA克隆及全序列分析

园　艺　学　报　2008,35(6):891-894
Acta Horticulturae Sinica
牡丹ACC氧化酶基因cD NA克隆及全序列分析
周　琳,董　丽3
(北京林业大学园林学院,国家花卉工程技术研究中心,北京100083)
摘　要:以牡丹品种‘洛阳红’(Paeonia suffruticosa‘Luoyang Hong’)花瓣为材料,用CT AB法提取总RNA,根据已报道的ACC氧化酶(12a m inocycl op r opane212carboxylic acid oxidase,AC O)保守氨基酸序列设计简并引物,通过RT2PCR扩增得到1条821bp的牡丹ACO基因同源片段。

利用该已知中间序列,通过快速扩增c DNA末端技术(Race)及序列拼接,最终得到该基因c DNA全长序列,命名为Ps2ACO1,Gen Bank 登录号为DQ337251。

分析结果表明,Ps2ACO1c DNA全长1221bp,包含一个939bp的开放读码框,5′非翻译区长65bp,3′非翻译区长217bp,编码产物为含有312个氨基酸残基的蛋白质。

氨基酸序列与烟草、苹果、桃等植物的AC O同源性都达80%以上。

关键词:牡丹;ACC氧化酶;RT2PCR;RACE;序列分析
中图分类号:S685111 文献标识号:A 文章编号:05132353X(2008)0620891204
C lon i n g and Sequence Ana lysis of12Am i n ocyclopropane212Carboxyli c Ac i d O x i da se Gene c
D NA fro m Tree Peony
ZHOU L in and DONG L i3
(College of L andscape A rchitecture,B eijing Forestry U niversity,N ational F lo w er Engineering Technology Research Center,B eijing 100083,China)
Abstract:T otal RNA was extracted fr om petals of‘Luoyang Hong’tree peony(Paeonia suffruticosa) with CT AB method,and a pair of degenerated p ri m er was designed based on the reported conserved a m ino acid sequence of12a m inocycl op r opane212carboxylic acid oxidase(ACO).A c DNA frag ment with821bp was a mp lified by RT2PCR,and then full length of it,na med Ps2ACO1(Gen Bank No.DQ337251),was obtained by RACE and sequence s p liced.Sequence analysis indicated that Ps2ACO1is1221bp in full length and con2 tains a939bp open reading fra me flanking by a65bp5′2non2translati on regi on and a217bp3′2non2transla2 ti on regi on,and encodes a312p redicated a m ino acid residues which shared more than80%homol ogy with ACO of t obacco,app le,peach and s o on.
Key words:tree peony;ACC oxidase;RT2PCR;RACE;sequence analysis
牡丹(Paeonia suffru ticosa)自然花期集中、单朵花花期短、采后贮运保鲜技术不过关,致使其切花产业化生产一直受到严重制约。

目前已发现牡丹切花乙烯的大量产生是促使其衰老的重要生理原因之一(史国安等,1997,1999),而牡丹切花开花衰老与乙烯的关系却非常复杂(J ia et al.,2006; Zhou et al.,2006)。

自乙烯生物合成途径揭示以来,香石竹(Park et al.,1992;van A ltvorst&Bovy, 1995)、月季(W ang et al.,2004)、兰花(OπN eil et al.,1993)等多种观赏植物的乙烯生物合成关键基因ACS和ACO相继被克隆。

作者以类似乙烯跃变型品种‘洛阳红’为试材,利用RT2PCR及RACE技术首次成功克隆了牡丹ACC氧化酶基因家族的一个成员Ps2ACO1,并对其进行序列分析,为收稿日期:2008-01-02;修回日期:2008-04-23
基金项目:国家自然科学基金项目(30571309);教育部新世纪优秀人才支持计划项目(NCET20520138)
3通讯作者Author for corres pondence(E2mail:dongleah@yahoo1com1cn)
园 艺 学 报35卷全面了解乙烯与牡丹切花开花衰老的关系,揭示乙烯在其采后开花和衰老进程中的作用模式和调控机制奠定基础。

1　材料与方法
‘洛阳红’牡丹切花取自洛阳国际牡丹园。

取开花指数为5级(郭闻文等,2004)的切花花瓣,
锡箔纸包好后液氮速冻,置于-70℃冰箱备用。

试验所用的大肠杆菌菌株为E 1coli DH5
α(本实验室保存),克隆载体为pGE M 2T easy (购自北京天根生化科技有限公司)。

M 2MLV 反转录酶和T 4DNA 连接酶分别购自Pr omega 和大连宝生物公司。

引物合成及DNA 序列测定委托北京奥科生物公司完成。

花瓣总RNA 提取采用CT AB 法(孟丽等,2006)。

根据已报道的ACO 保守氨基酸序列设计一对简并引物P1:C (CG )A (AG )AA (T C )TGGGG (TC )TT (GC )T (AT )(TC )G AG,P2:TC (AG )AA (TGC )C (TG )(T C )GG (T C )TC (TC )TTiG (i:次黄嘌呤),以RNA 反转录产物c DNA 第1链为模板,95℃预变性4m in,然后95℃变性1m in,51℃退火40s,72℃延伸1m in,共30个循环,最后72℃延伸7m in 进行PCR 扩增。

凝胶回收与预期片段大小一致的泳带,连接克隆载体并转化感受态细胞,通过蓝白斑筛选及质粒酶切鉴定后,进行序列测定。

根据所得的中间序列设计特异性引物P3:AG 2CAGCTCCT CGGCCAGTGTCTCT,P4:G ATGCACCGTGTG AT CGCT CAAAC,按照试剂盒S MART T M RACE c DNA Amp lificati on Kit 说明书进行RACE 扩增,退火温度为59℃。

产物克隆及测序如上所述。

测序结果在Gen Bank 中进行B last 分析。

利用DNAMAN 软件进行多序列比对及同源性分析。

2　结果与分析
211　牡丹ACO 基因同源片段的克隆
以盛开切花花瓣的c DNA 为模板,利用简并引物P1和P2进行PCR 扩增,得到821bp 、编码273个氨基酸的预期片段(图1,A )。

B last 分析发现,该核苷酸序列与许多植物ACO 同源性都在80%左右,其中与苹果ACO (AB086888)同源性最高,达86%,初步推断为牡丹ACO 基因的同源片段。

212　牡丹Ps 2ACO 1基因c D NA 全长的获得及序列分析
凝胶电泳分析RACE 2PCR 产物(图1,B ),并对其测序的结果表明,3′端序列为517bp,5′端为487bp,B last 同源性检索后推断所得片段即为目的基因末端序列。

图1　牡丹ACO 基因RT 2PCR (A)及RACE (B)扩增电泳图
F i g .1　Agrose gel electrophoresis ana lysis of ACO gene c D NA fragm en ts
by RT 2PCR (A)and RACE (B)i n tree peony
将RT 2PCR 及RACE 2PCR 扩增片段拼接,最终获得长度为1221bp 的牡丹ACO c DNA 全长序列(图2),命名为Ps 2ACO 1,GenBank 登录号为DQ337251。

利用NCB I 提供的ORF Finder 进行分析发现,该c DNA 全长包含有一个939bp 的开放读码框和一个poly (A )尾巴,5′非翻译区长65bp,3′非
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　6期周　琳等:牡丹ACC 氧化酶基因cDNA 克隆及全序列分析　翻译区长217bp,编码312个氨基酸,与在其他植物中分离到的ACO 基因全长一般编码306～326个氨基酸的结果(Pogs on et al .,1995)相一致。

对其编码的氨基酸序列进行分析发现,该基因包含目前已知的ACO 存在的所有保守区及保守的9个氨基酸残基(Lasserre et al .,1996)。

Pr otPara m (ht 2t p://au 1expasy 1org/t ools/p r ot para m 1ht m l )预测该蛋白的分子量是35122k D,理论等电点为5132。

图2　Ps 2ACO 1基因c D NA 全长推定的氨基酸序列
阴影区表示ACO 的保守区,方框区为在所有二价铁离子/抗坏血酸依赖型双加氧酶家族成员中
保守存在的9个氨基酸残基。

3表示终止子。

F i g .2　D educed am i n o ac i d sequence of the c D NA full 2length encod i n g Ps 2ACO 1gene
Several conserved regi ons observed in all ACC oxidase are shaded,and the nine a m ino acid residues
in the boxes are conserved in all me mbers of the Fe 2+ascorbate fa m ily of
di oxygenases .3denotes the ter m inati on codon .
不同物种的ACO 在蛋白质水平上的同源性一般在80%左右。

对此序列进行B last p 分析后,选取与牡丹ACO 相近的8个物种的ACO 蛋白氨基酸序列进行同源性分析发现,Ps 2ACO 1编码的氨基酸序列与烟草、矮牵牛、山茶、柿子、苹果、桃、柑橘、番木瓜的ACO 同源性都在80%以上,表明ACO 氨基酸序列具有较强的保守性,同时也证明本试验所克隆的c DNA 序列即为牡丹ACO 基因家族中的一个成员。

氨基酸同源性分析见图3。

为了探明牡丹切花开放衰老进程中ACO 基因是否存在调控作用,为其采后保鲜技术的开发、乃至转基因育种提供理论依据,本试验利用RT 2PCR 及RACE 技术,从类似乙烯跃变型品种‘洛阳红’盛开切花的花瓣中克隆了1个牡丹ACO 基因Ps 2ACO 1。

核苷酸及其编码的氨基酸序列分析表明,该基因属于牡丹ACO 多基因家族中的1个成员。

研究发现,不同家族成员参与调控不同因子(包括发育信号、植物激素和环境刺激等)诱导的乙烯反应(Zare mbinski &Theol ogis,1997)。

因此,该研究结果为进一步研究牡丹ACO 家族成员及各自在牡丹切花衰老过程中的调控机理奠定了良好的基础。

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卷
图3　不同植物ACO 基因氨基酸序列同源性分析
F i g .3　Hom ology ana lysis of pred i cted am i n o ac i d sequences of ACO genes from d i fferen t pl an ts
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