实验绿色荧光蛋白

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生物技术实验报告

姓名:张龙龙

学号:2011506066

班级:11级生技02班

前言:绿色荧光蛋白(green fluorescent protein,GFP)是一类存在于包括水

母、水螅和珊瑚等腔肠动物体内的生物发光蛋白。当受到紫外或蓝光激发时,GFP 发射绿色荧光。它产生荧光无需底物或辅因子发色团是其蛋白质一级序列固有的。GFP 由3 个外显子组成,长2.6kb;GFP 是由238 个氨基酸所组成的单体蛋白,相对分子质量为27. 0kMr,其蛋白性质十分稳定,能耐受60℃处理。1996 年GFP 的晶体结构被解出,蛋白质中央是一个圆柱形水桶样结构,长420 nm,宽240 nm,由11 个围绕中心α螺旋的反平行β折叠组成,荧光基团的形成就是从这个螺旋开始的,桶的顶部由 3 个短的垂直片段覆盖,底部由一个短的垂直片段覆盖,对荧光活性很重要的生色团则位于大空腔内。发色团是由其蛋白质内部第65-67位的Ser-Tyr-Gly自身环化和氧化形成.

一.实验目的

1、了解表达用基因克隆引物设计的原理和方法。

2、了解利用原核表达系统表达外源基因的原理、流程及方法。

3、掌握PCR、DNA片段的酶切与连接、细菌转化、阳性克隆筛选、质粒提取、DNA样品的纯化、核酸电泳等分子生物学基本技术。

二.实验原理

基因工程一般包括四个步骤:一是取得符合人们要求的DNA片段,这种DNA片段被称为“目的基因”;二是将目的基因与质粒或病毒DNA连接成重组DNA;三是把重组DNA引入某种细胞;四是把目的基因能表达的受体细胞挑选出来。

本实验根据绿色荧光蛋白(GFP)的基因序列设计一对引物,用该引物将GFP基因从含GFP基因的质粒中扩增出来。再利用双酶切切开表达载体pET23b 和目的基因的两端接头,通过T4连接酶GFP基因与表达载体重组。将含GFP 基因的重组表达载体导入宿主菌BL21(DE3),在IPTG的诱导下,使GFP基因表达

三.实验材料及仪器

1、实验材料:含有GFP的质粒;DNA Marker;DH5α;BL21;

2、仪器:恒温培养箱、超净工作台、恒温摇床、制冰机、台式离心机、涡旋振荡器、冰箱、电泳仪、透射仪、PCR仪、PCR管、刀片、玻璃涂棒、酒精灯、无菌牙签、吸水纸、微型离心管、台式冷冻离心机、塑料手套、1.5ml离心管。

四.实验内容

4.1 质粒的提取、酶切及电泳鉴定:

1)实验试剂:LB培养基;溶液Ⅰ;Tris-HCl(pH=8);溶液Ⅱ;溶液Ⅲ;

酚/氯仿抽提液;无水乙醇;电泳缓冲液;加样缓冲液;GoldView核酸

DNA 染色剂;1%的琼脂糖凝胶;XhoⅠ(10U/μl);NdeⅠ(10U/μl);T

4 lisase。

2)实验步骤:

质粒的提取与鉴定

(1)在含有质粒的DH5α平板菌落上挑取单菌落,接种于20ml含有100μl /ml Apm的LB液体培养基中,37℃、200rpm振荡培养过夜。

(2)分装菌液到1.5ml离心管中,冰浴2min。4℃、12000rpm离心5min,收集菌体,弃上清。再用同样方法收集一次菌体。

(3)将细菌沉淀重悬于100μl预冷的溶液Ⅰ中,涡旋剧烈振荡,混匀,冰浴10min。

(4)加200μl新鲜配制的溶液Ⅱ,盖紧管口,轻柔快速颠倒离心管5次,充分混匀,冰浴5min。

(5)加入150μl预冷的溶液Ⅲ,盖紧管口,轻柔快速颠倒离心管数次,使溶液Ⅲ在粘稠的细菌裂解物中分散均匀,见白色絮状沉淀,可在冰上放置10min。4℃、12000rpm 离心10min。

(6)加等体积的酚/氯仿(1:1),震荡混合有机相和水相,冰浴3min。4℃、12000rpm 离心10min,吸取上层水相转移到另一新离心管中。

(7)加等体积的氯仿:异戊醇(24:1),振荡混合有机相和水相,4℃、12000rpm 离心10min,吸取上层水相转移到另一新离心管中。

(8)加入2倍体积预冷的无水乙醇,-20℃沉淀DNA 10-20min。4℃、12000rpm 离心10min,弃上清,留沉淀(管底有少量白色沉淀)。

(9)分2次加入1ml预冷的70%乙醇洗涤沉淀, 12000rpm 离心5min,抽吸去除所有上清,放置室温干燥,让酒精挥发。

(10)加30μl TE(内含浓度50μg/ml的RNase A)溶解DNA,37℃放置30min,消化RNA。-20℃保存备用。

(11)制1%的琼脂糖凝胶:加25ml×TAE缓冲液于三角瓶。称取0.25g琼脂糖加到三角瓶中,与微波炉加热至完全溶化。冷却至60℃左右,加1μl的GoldView 溶液,摇匀。轻缓倒入封好两端和加上梳子的电泳胶板中,静置冷却30min以上。轻轻拔掉梳子,将凝胶放入电泳槽中,加入电泳缓冲液(TAE)中,使电泳缓冲液刚好没过凝胶约1mm。

(12)点样:取5μl质粒DNA及2μl加样缓冲液混合上样,80—100v约电泳20—30min。

质粒DNA的酶切

(1)酶切:按如下双酶切体系(20μl)混合

反应物ⅠⅡ

质粒5μl 3μl

XhoⅠ(10U/μl) 0.5μl 0.5μl

NdeⅠ(10U/μl)0.5μl 0.5μl

10×buffer 2μl 2μl

ddH

O 12μl 14μl

2

先加水,再加buffer,加质粒,加内切酶,放离心机上混匀。在37℃水浴4h。(2)电泳,在紫外观察分析仪上观察酶切结果。

4.2目的基因的获得和重组载体的构建

1)实验试剂:模板DNA;dNTP;Taq DNA聚合酶;引物;10×buffer(内含

Mg2+);ddH

2O;10×T

4

DNA连接酶buffer;T

4

DNA连接酶。

2)实验步骤:

目的基因的获得、检测及回收

(1)依次混匀下列试剂:反应体系

ddH

2

O 9.5 μl

Mix 12.5 μl

上游引物 1 μl

下游引物 1 μl

模板 1 μl

混合后瞬时离心。

(2)PCR反应程序

94℃预变性 3 min

94℃变性 30 sec

52℃退火 30 sec 30个循环

72℃延伸 1 min

72℃延伸 1 min

4℃

(3)电泳:扩增产物用1% 的琼脂糖凝胶进行电泳分析,检查反应产物及长度。(4)用干净的刀片将需要的DNA条带从凝胶上切下来,称取重量。

(5)以0.1g 凝胶对应300μl 的体积加入PN。

(6)50℃水浴10min ,期间不断温和上下翻动离心管至胶完全溶解。

(7)将上一步的到的溶液加入到一个吸附柱中,吸附柱再放入收集管中,13000rpm 离心60s,弃掉废液。

(8)加入800μl漂洗液PW,13000rpm离心60s,弃掉废液。

(9)加入500μl漂洗液PW,13000rpm离心60s,弃掉废液。

(10)将离心吸附柱放回收集管,13000rpm离心2min。

(11)取出吸附柱,放入一个干净的离心管中,在吸附膜的中间位置加入适量洗脱缓冲液EB 30μl,洗脱缓冲液在65℃水浴中预热,室温放置2min,13000rpm 离心1min,然后将离心的溶液重新加回到离心吸附柱中,13000rpm离心1min。(12)电泳检测回收产物,余置于-20℃保存。

重组质粒的连接

将PCR扩增的目的基因片段产物与PGM-T载体连接。反应体系(μl)如下;

体系成分体积(μl)

溶液Ⅰ 5

PGM-T载体 0.2

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