cre_loxp基因敲除系统解读ppt课件
条件性基因敲除与敲入ppt课件
实现基因敲除的方法有多种，但基本上都是采用同 源重组或随机整合的方法，让一段没有生理功能的 DNA片段在细胞内取代正常基因，从而破坏正常基 因的功能。基因敲除主要是在胚胎干细胞 (embryonic stem cells，ESC)水平进行操作。胚胎干 细胞是早期胚胎细胞经体外培养建立的全能细胞系， 在体外培养时保持了未分化状态，可以传代增殖， 在发育上类似于早期胚胎细胞团的细胞，具有与早 期胚胎细胞相似的分化潜能和正常整倍体核型两大 特点，是研究哺乳动物个体发育、胚胎分化以及性 状遗传机制的理想模型。首先在这种细胞内进行分 子水平的基因操作，之后再使这种已经发生了基因 改变的细胞发育成为一个完整的生物体。这样就可 以在整个生物体内实现预期的基因改变。
体不同的组织、不同的生理条件下发挥作用； ④Cre重组酶的编码基因可以置于任何一种启动子的调控
之下，从而使这种重组酶在生物体不同的细胞、组织、器 官，以及不同的发育阶段或不同的生理条件下产生，进而 发挥作用，这一点也是该系统在应用过程中最为重要的一 点。
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3．Cre/loxP系统的工作流程
利用Cre/loxP系统实现体内某特定基因在特定条件 下的敲除，需要两只转基因小鼠。
条件性基因敲除与敲入
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在科学研究中，为了明确某一组织或器官的功能， 常将实验动物体内所要研究的组织或器官切除，进 而根据实验动物的生理指标或功能的变化来推测切 除部分的功能。生命科学发展到今天，人们对于生 命现象的认识已经逐步深入到了分子水平，而上述 的“部分切除—观察整体—推测功能”的研究思想 仍然有效。具体地说，就是在分子水平破坏想要研 究的基因，然后观察生物体的生理指标、功能、整 体形态、组织结构、发育过程的变化等，进而推测 相应基因的功能。这种研究过程称为基因敲除(gene knock out)。此外，为了研究某种疾病与某个基因之 间的关系，常向生物体内人为引入某个基因，然后 观察实验动物出现的各种变化，从而推测疾病与基 因的关系，这种研究方法称为基因敲人(gene knock in)。
基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术ppt课件
点突变 Left arm Right arm
Donor plasmid
同源重组发生率升高几个数量级
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TALEN的最前沿
2011年8月， Nature Biotechnology 上同时发表了用TALEN 技术 进行基因敲除的4篇研究文章，另加一篇综述。
• 一篇人类干细胞 《Genetic engineering of human pluripotent cells using TALE nucleases》
• 但是，该技术制备复杂，成本昂贵，而且其技术 专利被少数几家商业公司控制。
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（二）
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崭新的技术解决经典的挑战
崭新的技术 - TALEN 经典的挑战 – 染色体DNA序列的人工编辑修改
• （点）突变：Silent；Missense； Nonsense；Frame shift （基因敲除， Knockout） • 片段删除 • 片段插入 目的与用途：生物模型；表达工具；基因治疗
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条件型基因打靶的优势： 1. 克服了重要基因被敲除所导致的早期致死 2. 并能客观、系统地研究基因在组织器官发生、发育以及
疾病发生、治疗过程中的作用和机制
这一技术亦存在一些缺点： 1. 费用太高 2. 周期较长 3. 许多基因在剔除后并未产生明显的表型改变，可能是这
些基因的功能为其他基因代偿所致
• 5' - ATAACTTCGTATA - ATGTATGC - TATACGAAGTTAT - 3' • 3' - TATTGAAGCATAT - TACATACG - ATATGCTTCAATA - 5'
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• Cre-LoxP系统的特性
[整理]基因敲除2教学讲义PPT课件
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➢ 选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然 发生率极低，动物的重组概率为10-2～10-5，植物的概率 为10-4～10-5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同 源重组的胚胎干细胞非常重要。
• 通过基因打靶技术可以对生物体基因组进行基因灭活、点 突变引入、缺失突变、外源基因定位引入、染色体组大片 段删除等修饰和改造，并使修饰后的遗传信息通过生殖系 遗传，使遗传修饰生物个体表达突变的性状。通过对遗传 修饰生物体的表型分析和机理研究，帮助人类理解生命现 象的本质、揭示疾病发生的机理、探寻疾病预防和诊疗的 有效方法。
• G418是一种氨基糖苷类抗生素 ，在分子遗传试验中，是 最常用的抗性筛选试剂。当neo基因被整合进真核细胞 DNA后，能启动neo基因编码的序列转录为ｍＲＮＡ ，从 而获得抗性产物氨基糖苷磷酸转移酶的高效表达，使细胞 获得抗性而能在含有Ｇ418的选择性培养基中生长。
• neo基因：是对新霉素（neomyc素，破坏卡那霉素和新霉 素（原核生物）以及G418。
➢ 同源重组：将重组载体通过一定的方式(电穿孔法 或显微注射)导入同源的胚胎干细胞(ES cell)中， 使外源DNA与胚胎干细胞基因组中相应部分发生 同源重组，将重组载体中的DNA序列整合到内源 基因组中，从而得以表达。一般地，显微注射优 点是外源基因转移率高，可直接用外源基因进行 转移；缺点是转移基因表达不稳定，技术难度较 大，效率低。电穿孔命中率比显微注射低，但便 于使用。
• TK：胸苷激酶蛋白基因，可使无毒性的丙氧鸟苷（GANC） 转变为毒性核苷酸而杀死细胞，因而可用丙氧鸟苷筛选排 除随机整合的细胞株。
• HSV-tk：单纯疱疹病毒胸苷激酶基因，编码的酶蛋白，可 以使一些无毒或低毒的前药转化为强细胞毒性物质，杀死 肿瘤细胞。这些基因也被称为自杀基因。
基因打靶 cre-loxp重组酶系统
基因打靶基因打靶包括：胚胎干细胞的获得和培养、打靶载体的构建、重组ES细胞的筛选、嵌合体小鼠的制备、基因敲除小鼠的建立、Cre-loxP系统、FLP/FRT系统和条件性基因敲除、基因敲入和大规模ES细胞突变库的建立。
基本概念：1.基因打靶：是利用同源重组技术来定点改变物种的基因组顺序和结构，从而在突变的个体内来研究基因及基因组的功能。
2.基因敲除：是使用基因组中某个/某几个基因或基因的顺式元件产生缺陷，从而在突变体内。
3.丧生正常的功能，来推测这些基因或元件原来在体内的功能。
基因敲入：在个体基因组中定点加入某个/某几个基因或顺式元件，使之表达或发挥作用，从而研究该基因或顺式元件在体内的功能。
4.基因打靶技术是一种定向改变生物活体遗传信息的实验手段。
它的产生和发展建立在胚胎干细胞技术和同源重组技术成就的基础之上，并促进了相关技术的进一步发展。
自1987年早期胚胎干细胞技术建立及第一例基因剔除小鼠诞生以来，基因打靶的研究进展迅速，给现代生物学和医学研究带来了革命性的变化，并直接引发了现代生物学和医学研究各个领域中许多突破性的进展，成为后基因组时代研究基因功能最直接和最有效的方法之一。
一、胚胎干细胞的获得和培养基因打靶中用的小鼠ES细胞系有：D3、E14、R1、J1、CCE，均来源于129小鼠品系和其杂交品系（因为这类小鼠具有自发突变形成畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物）。
ES 623和B6-IIIES细胞系，来源于C57BL/6小鼠品系。
BALB/c-I，来源于BALB/c小鼠品系。
常用的饲养层细胞为PMEF（小鼠原代胚成纤维细胞。
PMEF需6 Gy的X 射线照射或丝裂霉素C处理细胞抑制生长后才能用作饲养细胞）。
建立ES细胞的过程中，最好采用只传了2-3代的原代小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养细胞，所取得的ICM（内细胞团）只有10％-30％的几率建立ES细胞系。
一旦ES 克隆被确定，接下来应该考虑检查ES细胞的核型。
creloxp基因敲除系统
Loxp site
34bp反向重复序列
Flp/Frt重组系统
P1噬菌体
（1）重组方式
（2）基因敲除机理
Offspring：50% heterozygous knockout after 1 generation
基因敲除机理 （续）
诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建
MHC (cardiac-specific a-myosin heavy chain) Mer (mutated murine estrogen receptor ligand-binding domain amino
acids 281 to 599, G525R)
D.S. Sohal, M. Nghiem. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circ Res. 89:20-25 (2001).
（3）阳性克隆筛选
随机整合 定点整合 没有整合
DTA(白喉毒素A亚基）
（4）囊胚注射
小鼠的遗传背 景取决于ES和 囊胚细胞
（5）嵌合体小鼠
（6）品系纯化
纯合突变小鼠用来和Cre小鼠杂交，杂合突变小鼠保种 Loxp2小鼠品系建立完成
三、Cre工具鼠的构建
DNA显微原核注射，是指将外源DNA通 过显微注射的方法注射到受精卵的原 核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的 基因组中，并稳定遗传给后代。
MerCreMer融合蛋白
Cre-loxp系统
Cre-loxp系统Cre-lox系统介绍及使⽤汇总由于Cre-lox系统具有操作简单、重组率⾼的优点，如今已经成为体内外遗传操作的强有⼒⼯具。
利⽤Cre-lox系统，可以在特定细胞、组织或整个⽣物体，甚⾄在特定时间点敲除或表达某个基因，实现对特定基因的时空特异性操作，这对基因功能的研究和⼈类疾病动物模型的建⽴都具有深刻影响。
1.什么是Cre-lox系统？从名字就能知道这套系统的两个主要组成部分：(1)Cre重组酶环化重组酶（Cre,cyclizationrecombinase），是酪氨酸位点特异性重组酶之⼀，能催化两个DNA 识别位点之间的位点特异性重组。
Cre重组酶来源于P1噬菌体，由343个氨基酸组成，能特异性地识别Lox位点。
除Cre以外，此类重组酶还有Flp（flipase）和Dre（D6特异性重组酶）。
(2)Lox位点Cre重组酶识别的回⽂DNA位点，也叫loxP(locusofX-overP1)位点，长34bp，其特征结构为ATAACTTCGTATA?-NNNTANNN-TATACGAAGTTAT。
两边反向互补的13个碱基为Cre重组酶的识别序列，中间的8个碱基为重组发⽣位置，这也决定了loxP的⽅向。
N表⽰可变碱基，不同的碱基选择可形成不同的Lox位点，除了野⽣型loxP，常见的还有Lox2272，Lox511，Lox5171等等，这些突变Lox位点也能被Cre重组酶识别，但是只有两个序列相同的Lox位点之间才能发⽣重组。
在同⼀个DNA分⼦上，根据Lox位点的位置与⽅向，可能会发⽣3种不同的重组事件：（1）切除：当两个Lox位点在同⼀染⾊体上且⽅向相同时，将切除同向Lox位点之间的DNA序列（也叫Lox侧翼序列，Flox序列）。
（2）反转：当两个Lox位点位于同⼀染⾊体上且⽅向相反时，两个Lox位点之间的序列发⽣序列反转，即颠倒。
（3）易位：如果两个Lox位点位于不同的染⾊体上且⽅向相同，则易位事件将导致DNA ⽚段的交换。
条件性基因敲除的“时空开关”——Cre-loxP系统介绍
条件性基因敲除的“时空开关”——Cre-loxP系统介绍基因敲除小鼠是我们研究基因功能必不可少的利器，主要分为全身性基因敲除和条件性基因敲除。
然而，全身性基因敲除的小鼠存在着无法忽视的缺陷，例如：不能特异性地研究特定基因在特定组织内（及特定的时间）的功能；全身性基因敲除小鼠有时因某些基因对胚胎发育的影响而无法正常分娩；或因出生后严重的生理缺陷而过早死亡；或不能产生后代而不能获得纯合子动物模型。
因此，条件性基因敲除小鼠虽然有周期长、费用高、需要配合特定工具鼠使用等劣势，但仍获得了越来越多的选择与喜爱。
今天，就和大家一起来了解下条件性基因敲除方法必用的Cre-loxP重组系统以及应用Cre-loxP进行条件性基因敲除的原则。
概述Cre-loxP重组系统，即对一段特定的DNA序列进行定位并用Cre 重组酶对其进行剪接，由Cre重组酶和loxP位点两部分组成。
其中Cre蛋白，最初由“导致重组（Cause recombination）”命名，也有文献命名为“环化重组酶（Cyclizationrecombinase）”。
Cre重组酶（CyclizationRecombination Enzyme）由大肠杆菌噬菌体P1的Cre基因编码，是由343个氨基酸组成的38kD的蛋白质。
它不仅具有催化活性，而且与限制酶相似，能够特异性识别loxP位点, 从而重组或删除loxP片段间的基因。
loxP（Locus Of X-over P1）是P1噬菌体基因组中34bp的特殊位点序列，包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域。
其中，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了loxP位点的方向，间隔区中的“N”代表这个碱基是可变的：发展历史1985年，R H Hoess, K AbremskiCre-Lox首次发表了大肠杆菌噬菌体P1的Cre-lox位点特异性重组系统的断裂和交换机制文章。
1987年，Brian Sauer博士把大肠杆菌噬菌体P1的Cre-lox位点特异性重组系统在酿酒酵母中即真核系统中进行了功能表达，提出了Cre介导的位点特异性重组可能是调节真核生物基因组重排的有用工具的预想。
《基因敲除技术》PPT课件
1.什么是传统机械按键设计？
传统的机械按键设计是需要手动按压按键触动PCBA上的开关按键来实现功 能的一种设计方式。
传统机械按键结构层图：
按键
PCBA
开关键
传统机械按键设计要点：
1.合理的选择按键的类型，尽量选择 平头类的按键，以防按键下陷。
2.开关按键和塑胶按键设计间隙建议 留0.05~0.1mm，以防按键死键。 3.要考虑成型工艺，合理计算累积公 差，以防按键手感不良。
系统来介导Cre 的表达，则可省去建立携带 Cre 的转基因动物的过程。
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2.2利用随机插入突变进行基因敲除。
2.2.1 原理：
此法利用某些能随机插入基因序列的病毒，细菌或 其他基因载体，在目标细胞基因组中进行随机插入 突变，建立一个携带随机插入突变的细胞库，然后 通过相应的标记进行筛选获得相应的基因敲除细胞 （原理见图5）[11,12] 。根据细胞的不同，插入载 体的选择也有所不同。逆转率病毒可用于动植物细 胞的插入；对于植物细胞而言农杆菌介导的T-DNA 转化和转座子比较常用；噬菌体可用于细菌基因敲 除。
ｄ．选择筛选已击中的细胞：由于基因转移的同源重组自然 发生率极低，动物的重组概率为10－2～10-5，植物的概率 为10－4～10－5。因此如何从众多细胞中筛出真正发生了同 源重组的胚胎干细胞非常重要。目前常用的方法是正负筛选 法（PNS法），标记基因的特异位点表达法以及PCR法。其中 应用最多的是PNS法。
并且这种效应可以传递到子代细胞中,所以 RNAi的反应过程也可以用于基因敲除。近年 来，越来越多的基因敲除采用了RNAi这种更 为简单方便的方法。
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2.3.1 RNAi阻断基因表达的机理 双链RNA进入细胞后，能够在Dicer酶的作用下被裂
基因敲除ppt课件
LoxP
Cre
Target gene
它是将cre 基因与各种组织(位点、时间、发育阶段)
特异性的启动子连接构建载体，获得相应的转基因 小鼠。即可通过诱导表达Cre 重组酶而将lox P 位点 间的基因切除,从而实现特定基因在特定时间的失活。
1.2.3 Cre-LoxP系统的实验方案
（1）在胚胎干细胞（ES ）中通过置换型载体进 行同源重组，向基因组靶位点引入选择标记基因， 并在其两侧引入两个同向排列的Loxp位点。将该 ES细胞打入假孕母鼠中，发育成“floxed小鼠”。
•neo 基因有双重作用,一方面形成靶位基因的插入突 变，同时作为正向筛选的标记。
•HSV - tk 基因是负选择基因，含有HSV - tk (胸苷 激酶蛋白)的重组细胞在GANC 培养基中不能存活。
胸苷激酶蛋白（TK）可使无毒性的丙氧鸟苷（GANC）转变为毒性核苷酸而 杀死细胞。
外源 基因
整合到染色体 的其他位置
基因转座常伴随着基因缺失、重排等，因而可以 应用到基因敲除。
1.3.2 基因敲除与RNAi的关系
•RNAi是指通过双链RNA介导特异性降解靶mRNA， 导致转录后水平基因沉默的现象。 •RNAi是从转录水平抑制基因的作用，也可以看作是 基因敲除的一种形式。
DNA mRNA
（2）显微注射方法获得转基因“Cre 小鼠”，此 转基因小鼠在特定的启动子下表达Cre重组酶。 （3）“Cre小鼠”跟“floxed小鼠”交配，Cre 重组酶会切掉Loxp位点之间的靶基因和1个 Loxp位点，从而达到靶基因的失活或敲除。
此外，还可以从细胞水平进行Cre-LoxP系统实验。
1.3 其他基因敲除技术
3’ 5’
Exo蛋白 3’ 5’
Cre-loxP、CRISPR-Cas9技术与病毒载体在基因敲除中的联用PPT精选课件
3. 病毒载体
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3.1 病毒载体比较
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3.1 病毒载体比较
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3.2 病毒载体应用
20 组成型启动子-感染特性决定表达分布
3.2 病毒载体应用
21 特异性启动子-空间和时间精细表达
4 组合应用示例——Cre-loxP与病毒工具结合
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4.1 Cre-loxP与病毒工具结合应用
23
“条件性基因激活”模式
间发生基因重组。
Cre重组酶无需借助任何辅助因子，可作用于多种结构的DNA底物，如线形、
环状甚至超螺旋DNA。
loxP位点，是locus of X-over P1的缩写，来自P1噬菌体。间隔序列决定loxP
的方向，如下所示： 13bp
8bp
13bp
ATAACTTCGTATA-NNNTANNN-
TATACGAAGTTAT
2.4 CRISPR-Cas9技术优势
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1. CRISPR-Cas9系统的可用位点更多：理论上基因组中每8 个碱基就能找到一个可用CRISPR-Cas9进行编辑的位点，而 TALEN和ZFN系统则在数百甚至上千个碱基中才能找到一个 可用位点；
2. CRISPR-Cas9系统更具有可拓展性：例如可以通过对 Cas9蛋白的修饰，让它不切断DNA双链，而只是切开单链， 这样可以大大降低切开双链后带来的非同源末端连接造成的 染色体变异风险；此外还可以将Cas9蛋白连接其他功能蛋白， 从而在特定DNA序列上研究这些蛋白对细胞的影响；
基因操作技术一览
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1. Cre-loxP技术简介
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Cyclization recombinase
Cre蛋白于1981年从P1噬菌体中被发现，属于λInt酶超基因家族。
CreloxP、CRISPRCas9技术与病毒载体在基因敲除中的联用 ppt课件
2016-04-25
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ppt课件
Content
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第一节、Cre-loxP技术 第二节、 CRISPR-Cas9技术 第三节、病毒工具简介 第四节、组合应用示例
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基因操作技术一览
4
ppt课件
1. Cre-loxP技术简介
工设计这两种 RNA，可以改造形成
具有引导作用的sgRNA （short
guide RNA ）
N代表任意DNA碱基
Cas9:
复合物引导核酸酶 Cas9 蛋白在与 crRNA 配对的序列靶位点剪切双链 DNA。HNH结构域剪切配对的部分， Ruvc结构域剪切未配对的链。
ppt课件
2.3 CRISPR-Cas9技术流程
非同源末端连接（non homologous end joining, NHEJ）
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新3代基因组编辑工具
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均由自然界存在的核酸酶系统改造而来 均具有识别核酸碱基特异性的结构域 作用机制：均通过在细胞基因组创造双链断裂缺口， 从
而诱发细胞自身修复机制完成基因修饰
ppt课件
2.1 CRISPR-Cas9技术来源
启动子
Mx1 CMV-tTA CMV-ER
诱导物
IFN tetracycline tamoxifen
Cre表达的靶组织
肝脏、免疫细胞 广泛表达 广泛表达
—MerCreMer重组蛋白
ppt课件
1.3 Cre-loxP技术仍有不足之处
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2. CRISPR-Cas9技术
传统的基因打靶技术主要依赖于基因同源重组，利用设计的同源臂替 11代靶基因片段，从而达到目的。 但是同源重组在细胞中的发生概率极低，而且步骤比较复杂、耗时间、 费用也比较高。
CreloxPCRISPRCas技术和病毒载体在基因敲除中的联用课件
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
2.1 CRISPR-Cas9技术来源
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
2.2 CRISPR-Cas9系统组成
DNA、RNA和蛋白质聚合物 N代表任意DNA碱基
与诱导性表达启动子结合应用，对Cre转基因的表达进行控制
启动子
Mx1 CMV-tTA CMV-ER
诱导物
IFN tetracycline tamoxifen
Cre表达的靶组织
肝脏、免疫细胞 广泛表达 广泛表达
—MerCreMer重组蛋白
文档仅供参考，不能作为科学依据，请勿模仿；如有不当之处，请联系网站或本人删除。
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2.4 CRISPR-Cas9技术优势
1. CRISPR-Cas9系统的可用位点更多：理论上基因组中每8个碱基就能找到一个可用CRISPR-Cas9进行编辑的位点， 而TALEN和ZFN系统则在数百甚至上千个碱基中才能找到一个可用位点； 2. CRISPR-Cas9系统更具有可拓展性：例如可以通过对Cas9蛋白的修饰，让它不切断DNA双链，而只是切开单链， 这样可以大大降低切开双链后带来的非同源末端连接造成的染色体变异风险；此外还可以将Cas9蛋白连接其他功能蛋 白，从而在特定DNA序列上研究这些蛋白对细胞的影响； 3. CRISPR-Cas9系统的使用极为方便，只需要简单的几步就能完成，几乎任何实验室都可以开展工作，因此省时省 力； 4. 可同时对多个基因进行操作而ZFNs和TALEN两项技术则难以实现这种效果。
基因功能研究技术之基因敲除及基因编辑技术ppt课件
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（二）条件型基因敲除
• 条件型基因敲除法可定义为将某个基因的敲除限 制于小鼠某些特定类型的细胞或发育的某一特定 阶段的一种特殊的基因敲除方法。
• 该系统在80年代被引入后，已成功被应用于酵母 菌、植物、哺乳动物细胞及小鼠身上。
• 现阶段条件型基因敲除以噬菌体的Cre/Loxp系统 和酿酒酵母的FLP/FRT系统应用最为广泛。
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Cre/loxP系统作. 用原理示意图
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FLP／FRT 系统
• 该系统与Cre／loxP系统相同，也是由一个重组酶 和一段特殊的DNA 序列组成。从进化的角度上考虑，Flp／FRT系统是Cre／loxP系统在 真核细胞内的同源系统。其中，重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423 个氨基酸组成的单体蛋白。与Cre相似，Flp发挥作用也不需要任何辅 助因子，同时在不同的条件下具有良好的稳定性。该系统的另一个成 分Flp识别位点(Flp recognition target，FRT)与loxP位点非常相似， 同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8 bp的核心序 列构成。在该系统发挥作用时，FRT位点的方向决定了目的片段的缺 失还是倒转。这两个系统比较明显的区别是它们发挥作用的最佳温度 不同，Cre重组酶发挥作用的最佳温度为37℃，而Flp重组酶为30℃。 因此，Cre／loxP系统最适宜在动物体内使用。loxP和FRT位点的序 列如图所示
博士专题：基因功能研究技术之 ——基因敲除、基因编辑技术
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II、基因敲除：可以使基因的功能完全缺失
• 基因敲除，又称基因打靶，是一种遗传工程技术，是在转染细 胞中发生外源打靶基因与核基因组目标基因之间的DNA同源重 组，能够使外源基因定点地整合到核基因组的特定位置上，从 而达到改变细胞遗传特性的目的。
cre-loxp系统在大脑特定区域进行基因敲除的原理
cre-loxp系统在大脑特定区域进行基因敲除的原理
Cre-LoxP系统是一种常用的基因敲除技术，常用于研究大脑特定区域基因敲除的原理。
它包括两个主要组分：Cre重组酶和LoxP位点。
Cre重组酶是一种DNA重组酶，它能够识别特定DNA序列LoxP（locus of X-over P1）位点，并在其周围催化DNA重组反应。
LoxP位点是一种具有特定核苷酸序列的DNA序列，通常包含两个反向定向的LoxP序列，这两个序列之间有一个区域。
在基因敲除实验中，Cre重组酶的表达会受到特定的基因启动子的调控，使其仅在特定的大脑区域表达。
当Cre重组酶表达之后，它会识别并结合LoxP位点，在这两个反向定向的LoxP序列之间催化DNA重组反应。
该DNA重组反应会导致LoxP序列之间的DNA片段从基因组中被剪切掉，从而导致基因的敲除。
被敲除的基因序列会在细胞复制和分裂过程中丢失，从而使得特定基因在该细胞及后代细胞中无法表达。
通过在特定大脑区域表达Cre重组酶，并在这些区域中携带包含LoxP位点的基因组，在Cre-LoxP系统的作用下，研究人员可以实现特定大脑区域的基因敲除，从而研究该基因在该区域中的功能。
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MerCreMer融合蛋白
该系统将雌激素受体(Estrogen Receptor,ER)的配 体结合区(ligand-binding domain,LBD)和Cre重组 酶进行融合，产生一种嵌合重组酶，该嵌合重 组酶的表达被置于特异启动子的调节之下，从 而使其在特定组织和器官或者特定发育阶段产 生。但是只有该嵌合重组酶并不能发挥Cre重组 酶的活性，因为雌激素受体结合区的存在使其 不能进入核内与loxP位点相结合。只有加入雌 激素后才能使其进入核内发挥作用。
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基因敲除机理 （续）
Offspring: 25% homozygous knockout after 2 generation
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二、基因敲除的基本流程
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（1）打靶载体构建
Attention: Exon1 3N GT/AG
Conditional Knockout
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（2）转化ES细胞
电转需要的细胞数量2-5x107
同一染色体上含有同源序列的DNA分子之间或分子之内的重新组合。 在基因敲除小鼠制作过程中，需要针对目的基因两端特异性片段设 计带有相同片段的重组载体，将重组载体导入到胚胎干细胞后外源 的重组载体与胚胎干细胞中相同的片段会发生同源重组
同源重组示意图
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一、Cre/Loxp系统
Cre重组酶（37℃）
acids 281 to 599, G525R)
D.S. Sohal, M. Nghiem. Temporally regulated and tissue-specific gene manipulations in the adult and embryonic heart using a tamoxifen-inducible Cre protein. Circ Res. 89:20-25 (201061).
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三、Cre工具鼠的构建
DNA显微原核注射，是指将外源DNA通 过显微注射的方法注射到受精卵的原 核内，注射DNA整合到小鼠受精卵的 基因组中，并稳定遗传给后代。
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诱导性组织特异性Cre工具鼠的载体构建
MHC (cardiac-specific a-myosin heavy chain) Mer (mutated murine estrogen receptor ligand-binding domain amino
位点特异性重组酶，介导loxp 位点间的序列同源重组
70%重组率，无需辅助因子，多种 结构的DNA底物
Loxp site
34bp反向重复序列
Fl5
（2）基因敲除机理
Offspring：50% heterozygous knockout after 1 generation
电穿孔或是显微注射方法将构 建好的打靶载体导入ES细胞
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（3）阳性克隆筛选
随机整合 定点整合 没有整合
DTA(白喉毒素A亚基）
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（4）囊胚注射
小鼠的遗传背 景取决于ES和 囊胚细胞
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（5）嵌合体小鼠
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（6）品系纯化
纯合突变小鼠用来和Cre小鼠杂交，杂合突变小鼠保种 Loxp2小鼠品系建立完成
基因敲除 Knock Out
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背景介绍
1981 年Evans 等首次在体 外分离和培养ES，成功建 立了小鼠胚胎干细胞系
1985 年Smithies最早在哺乳动物 细胞中发现并实现了同源重组
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同源重组
Homologus Recombination
同源重组是指发生在姐妹染色单体（sister chromatin) 之间或
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The End
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