考马斯亮蓝法
实验8考马斯亮蓝法测蛋白质的含量
对实验条件进行优化，如调整PH值、反应时间、温度等，以提高实验
结果的稳定性。
03
应用拓展
进一步研究考马斯亮蓝法在特殊蛋白质或不同来源蛋白质测定中的应用，
拓展其应用范围。同时，可以探索与其他蛋白质测定方法的比较研究，
为蛋白质定量分析提供更多选择。
THANKS
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标准曲线的绘制
加样
将标准蛋白溶液分 别加入相应的试管 中。
测定光密度值
在特定波长下测定 各试管的光密度值， 记录数据。
准备标准蛋白溶液
制备一系列不同浓 度的标准蛋白溶液。
显色反应
向每个试管中加入 适量的考马斯亮蓝 溶液，混合均匀。
绘制标准曲线
根据测得的光密度 值与标准蛋白浓度 绘制标准曲线。
加样
样品稀释
根据实验需求，将蛋白质 样品进行适当稀释，以便 后续测量。
样品标记
对每个样品进行标记，以 便后续结果分析时能够准 确对应。
考马斯亮蓝溶液的配制
准备试剂
储存与使用
按照实验要求准备考马斯亮蓝溶液所 需的试剂。
将配制好的考马斯亮蓝溶液储存于棕 色瓶中，避免光照，使用前摇匀。
配制溶液
将各试剂按比例混合，制备出考马斯 亮蓝溶液。
影响因素
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量时，PH值、反应时间、温度等因素 可能影响实验结果。
适用范围
考马斯亮蓝法适用于大多数蛋白质的定量测定，但对于某些特殊蛋 白质或不同来源的蛋白质可能存在一定误差。
对实验的改进建议与展望
01
标准化操作
为提高实验准确性，建议对实验操作进行标准化，减少人为误差。
02
优化条件
考马斯亮蓝与蛋白质结合的机制
蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250max λ−−→−+-[器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。
2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。
根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重) =）测定时提取液体积（）样品重（）提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μSDS 干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。
图1 考马斯亮蓝标准法根据线性拟合公式y=a x+b计算所测溶液的蛋白质的含量。
（二）SDS干扰数据和图表2 考马斯亮蓝SDS干扰实验表格根据表2，以A595为纵坐标，SDS浓度为横坐标，作图2。
考马斯亮蓝法——完整版
一、基本原理
酸性溶液两者结合，使染料溶液 的最大吸收峰的位置，由465nm变 为595nm，溶液的颜色也由棕黑色 变为兰色。
二、试剂与器材
1. 试剂：
（1）考马斯亮蓝试剂： 考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量 不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏 差，在制作标准曲线时最好选用 γ—球蛋白为标准蛋白质， 以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有： 去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1M 的NaOH
三、操作方法
1、标准曲线的制作
试管编号
0123456
100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6
0.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4
考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色
最好的方法； 干扰物质少； 颜色稳定； 颜色深浅随不同
双缩脲反应；磷 钼酸－磷钨酸试 剂 被 Tyr 和 Phe 还 原
非蛋白氮（可 用三氯乙酸沉 淀蛋白质而分 离）
硫酸铵； Tris缓冲液； 某些氨基酸
各种嘌吟和嘧 啶； 各种核苷酸
硫酸铵； Tris缓冲液； 甘氨酸； 各种硫醇
用于标准蛋白质 含量的准确测定； 干扰少；费时太 长
用于快速测定， 但不太灵敏；不 同蛋白质显色相 似
用于层析柱流出 液的检测；核酸 的吸收可以校正
蛋白质含量测定法考马斯亮蓝法
蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法[实验目的]学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford 法）测定蛋白质含量的方法[实验原理]（蓝色）变为氨基酸芳香族碱性染料考马斯亮蓝磷酸nm G 595250m ax λ−−→−+-[器材与试剂]器材722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA ），配制成1.00mg/ml 。
2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg 考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。
[实验方法]标准方法1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
3.用标准蛋白浓度（mg/ml ）为横坐标，用A 595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。
根据测得的未知样品的A 595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。
根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g 鲜重)=）测定时提取液体积（）样品重（）提取液总体积（）查得的蛋白质（ml g ml g g ⨯⨯/μ以蛋白标准溶液浓度为横坐标，以吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
计算出回归方程。
如Y=aX+b让后把待测样品的吸光值代入回归方程，算出待测样品浓度 SDS 干扰实验1.取5支试管，分别编号后按表2剂量依次加入标准蛋白、SDS 、去离子水和考马斯亮蓝染料。
每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。
2.加完染料20min 后，使用753分光光度计，塑料比色皿，在595nm 处测量吸光度A 595。
[实验数据与结果分析]（一）标准方法的数据和图表1 考马斯亮蓝标准法实验表格根据表1，以A595为纵坐标，标准蛋白质量/（μg）为横坐标，作图1。
蛋白质的定量测定---考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度
实验名称：蛋白质的定量测定---考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度【实验原理】考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质-燃料结合的原理。
考马斯亮蓝G-250染料，在酸性溶液时呈茶棕色，最大吸收峰在465nm。
当与蛋白质结合后变成深蓝色，最大吸收峰转至595nm，且其光吸收值与蛋白质含量（10~100μg/ml蛋白质浓度）成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
【实验准备】一、材料（1）血清二、试剂（1）考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G-250 100mg溶于50ml 95%乙醇中，加入100ml 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000ml。
(2)标准蛋白质溶液：结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根基其纯度用0.15mol/L NaCl配置成1.0mg/ml蛋白溶液。
（3）0.9% NaCl溶液。
三、器材（1）试管和试管架（2）722型分光光度计（3）吸量管（4）移液枪【实验步骤】一、制作标准曲线取6支干燥洁净的试管，编号按下表加入试剂光度值（A595值）。
以吸光度值为纵坐标，蛋白质浓度为横坐标，绘出标准曲线。
二、血清蛋白质浓度测定测定方法同上。
1mL稀释血清加2.5mL考马斯亮蓝试剂，血清用0.9%NaCl稀释200倍，使其测定值在标准曲线的直线范围内。
用上述0号管调零，测出血清的A595值。
【实验结果】以吸光度A595（2）根据所测血清的值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，乘以稀释倍数，从而计算出血清的蛋白质浓度（mg/ml）0.26 mg/ml【实验讨论】①必须在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
②测定中蛋白-染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将比色杯洗干净。
③不要将标准蛋白质和待测蛋白质搞混，以免造成实验结果的改变。
④考马斯亮蓝（ＣＢＢ）显色法测定蛋白质含量的主要缺点之一是线性关系差．通过研究显色液组分对线性关系的影响，发现显色液Ｈ＋浓度是影响线性关系的主要因素【1】。
bradford法
双 缩 脲 法 （Biuret法）
中速 20~30 分 钟
多肽键＋碱性Cu2 ＋→紫色络合物
紫外吸收法
较为灵敏 50～100µg
快速 5～10分 钟
蛋白质中的酪氨 酸和色氨酸残基 在 280nm 处 的 光 吸收 双缩脲反应；磷 钼酸－磷钨酸试 剂 被 Tyr 和 Phe 还 原
各种嘌吟和嘧 啶； 各种核苷
灵敏度高 ～5µg
慢速 40～60 分钟
硫酸铵； Tris缓冲液； 甘氨酸； 各种硫醇
耗费时间长；操 作要严格计时； 颜色深浅随不同 蛋白质变化
考马斯亮蓝法 (Bradford法)
灵敏度最高 1～5µg
快速 5～15分 钟
考马斯亮蓝染料 与蛋白质结合时， 其 λ max 由 465nm 变为595nm
方法 灵敏度 时间 原理 干扰物质 说明 凯氏定氮法 （Kjedahl法） 灵敏度低，适 用 于 0.2~ 1.0mg 氮 ， 误 差为 ±2％ 灵敏度低 1～20mg 费时 8～10小 时 将蛋白氮转化为 氨，用酸吸收后 滴定 非蛋白氮（可 用三氯乙酸沉 淀蛋白质而分 离） 硫酸铵； Tris缓冲液； 某些氨基酸 用于标准蛋白质 含量的准确测定； 干扰少；费时太 长 用于快速测定， 但不太灵敏；不 同蛋白质显色相 似 用于层析柱流出 液的检测；核酸 的吸收可以校正
2、缺点 、
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量 不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏 差，在制作标准曲线时最好选用 γ—球蛋白为标准蛋白质， 以减少这方面的偏差。 （2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有： 去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1M 的NaOH （3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进 行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
考马斯亮蓝染色法
考马斯亮蓝染色法考马斯亮蓝染色法——标准方法1．电泳后，将凝胶转入一洁净的玻璃或塑料容器中。
加入5倍于凝胶体积的0．25％考马斯亮蓝R—250(溶解于50％甲醇和10％乙酸中)。
2．室温下振摇温育4h至过夜。
3．去除染色液，收集保存可重复使用20～40次。
4．依次在25％甲醇、7．5％乙酸中室温振摇下脱色。
灵敏度为0．1～0．5ttg蛋白／每条带。
注：①使用加热的染液或脱色液可以缩短染色或脱色的时间。
将染液或脱色液在微波炉或水浴中加热(大约50-6013)。
染色时间可缩短至20min，脱色时间约1—2h。
②加入泡沫橡胶(海绵)、羊毛状物或其他物品吸收染料，可以加快脱色时间，特别是在室温下脱色时。
考马斯亮蓝染色法——快速方法1．将凝胶放入一洁净的玻璃或塑料培养皿中加入5倍于凝胶体积的0．25％考马斯亮蓝R-250(溶解于50％三氯乙酸中)。
2．室温下振摇温育20min。
3．去除染色液，收集保存可重复使用多次，用水洗去未与凝胶结合的染料。
4．加入数倍体积的脱色液(25％甲醇、7％乙酸)。
必要时更换脱色液，将凝胶加温或在脱色液中放入海绵、滤纸片等吸收残余的染料，有助于加快脱色。
灵敏度为1．0ug蛋白／每条带。
考马斯亮蓝染色法——最高灵敏度1．染色前，考马斯亮蓝G-250(系考马斯亮蓝R-250的二甲基化衍生物)必须纯化。
因为商品制剂中的杂质可增强染色背景。
在250m17．5％乙酸中溶解4g染料，加热到70℃；加入44g硫酸铵，溶解后，冷却过滤或置室温离心(3000g，10min)，去除上清液，让染料干燥。
2．配制染色液：在500m1 2％磷酸中溶解30g硫酸铵，待其完全溶解后，加入溶于10m1水中的0．5g 纯化的考马斯亮蓝G—250。
室温保存。
3．电泳后，将凝胶放入一洁净的玻璃或塑料容器中加入5倍于凝胶体积的12．5％三氯乙酸。
4．室温下振摇温育1h或更长时间。
5．排干液体。
摇动考马斯亮蓝G—250染液，使大颗粒胶体分散，加至凝胶内。
考马斯亮蓝法完整版
考马斯亮蓝法（Bradford法）
徐亮
xuliang@
Tianjin Medical University
一、基本原理
酸性溶液两者结合，使染料溶液 的最大吸收峰的位置，由465nm变 为595nm，溶液的颜色也由棕黑色 变为兰色。
四、Bradford法的优缺点
1、优点
（1）灵敏度高：蛋白质－染料复合物具有很高的消光 系数，因此蛋白质测定的灵敏度较高，最低检出量为 1ug蛋白质。
（2）测定快速、简便：染料与蛋白质的结合，大约只 需2分钟，结合物的颜色在1小时内是稳定的。
（3）干扰物质少。
四、Bradford法的优缺点
2、缺点
用于层析柱流出 液的检测；核酸 的吸收可以校正
耗费时间长；操 作要严格计时； 颜色深浅随不同 蛋白质变化
考马斯亮蓝法 (Bradford法)
灵敏度最高 1～5g
快速 5～15分 钟
考马斯亮蓝染料
与蛋白质结合时， 其 max 由 465nm 变为595nm
强碱性缓冲液； TritonX-100; SDS
考马斯亮蓝试剂 （ml） 5 5 5 5 5 5 5
摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色
A595nm
以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
2、样品中蛋白质含量的测定
另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的 待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同 上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
ug/ml蛋白溶液。
2. 器材： （1）可见光分光光度计 （2）旋涡混合器
考马斯亮蓝法测蛋白质含量
标准曲线制作—考马斯亮蓝法测蛋白质含量一、标准曲线一般用分光光度法测物质得含量,先要制作标准曲线,然后根据标准曲线查出所测物质得含量。
因此,制作标准曲线就是生物检测分析得一项基本技术。
二、蛋白质含量测定方法1、凯氏定氮法2、双缩脲法3、Folin-酚试剂法4、紫外吸收法5、考马斯亮蓝法三、考马斯亮蓝法测定蛋白质含量—标准曲线制作(一)、试剂:1、考马斯亮蓝试剂:考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇,加入100ml 85% H3PO4,用蒸馏水稀释至1000ml,滤纸过滤。
最终试剂中含0、01%(W/V)考马斯亮蓝G—250,4、7%(W/V)乙醇,8、5%(W/V)H3PO4。
2、标准蛋白质溶液:纯得牛血清血蛋白,预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量,根据其纯度同0、15mol/LNaCl配制成100ug/ml蛋白溶液。
(二)、器材:1、722S型分光光度计使用及原理()。
2、移液管使用()。
(三)、标准曲线制作:1、2、以A595nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标(六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug),在坐标轴上绘制标准曲线。
1)、利用标准曲线查出回归方程。
2)、用公式计算回归方程。
3)、或用origin作图,测出回归线性方程。
即A595nm=a×X( )+6一般相关系数应过0、999以上,至少2个9以上。
4)、绘图时近两使点在一条直线上,在直线上得点应该在直线两侧。
(四)、蛋白质含量得测定:样品即所测蛋白质含量样品(含量应处理在所测范围内),依照操作步骤1操作,测出样品得A595nm,然后利用标准曲线或回归方程求出样品蛋白质含量。
一般被测样品得A595nm值在0、1—0、05之间,所以上述样品如果A595nm值太大,可以稀释后再测A595nm值,然后再计算。
(五)、注意事项:1、玻璃仪器要洗涤干净。
2、取量要准确。
3、玻璃仪器要干燥,避免温度变化。
考马斯亮蓝法
考马斯亮蓝测定蛋白质含量一、实验原理考马斯亮兰G-250在酸性溶液时呈棕红色，当与蛋白质结合后变为蓝色，且在蛋白质一定浓度范围内符合比尔定律，可在595nm处比色测定。
在3～5分钟即成大量吸收，至少稳定1小时。
在10～1000μg/mL范围内，吸光值与蛋白质浓度成正比。
是目前常用方法之一。
二、实验材料、器材与试剂1.材料结晶牛血清白蛋白。
2.器材（1）723分光光度计；（2）试管及试管架；（3）各型号吸量管；（4）坐标纸；（5）记号笔。
3.试剂（1）考马斯亮兰G-250染色液：取考马斯亮兰G-250 100mg溶于50mL95%乙醇中，加100mL85%磷酸，加水稀释至1升。
（2）标准蛋白溶液：用牛血清白蛋白，预先经微量凯氏定蛋法测定蛋白质含量，根据其纯度，配制成1000μg/mL的蛋白质标准溶液。
标准原液的配制：在分析天平上精确称取0.1g结晶牛血清白蛋白,于小烧杯内，加入少量蒸馏水溶解后转入100mL容量瓶中，烧杯内的残液用少量蒸馏水冲洗数次，冲洗液一并倒入容量瓶中，最后用蒸馏水定容至刻度。
配制成标准原液，其中牛血清白蛋白浓度为1000μg/mL。
(3)样品液：准确称取小麦叶片（或绿豆芽下胚轴）约200mg,放入研钵中，加入蒸馏水在冰浴中研成匀浆，转移到离心管中，于4000r/min离心10min,将上清液倒入10mL容量瓶中，再向残渣中加入2.0mL蒸馏水悬浮后以4000r/min再离心10min,合并上清液，定容至刻度。
三、实验方法1. 分别取8支试管，编号，按下表加入试剂，混匀，室温放置5～30分钟。
标准蛋白溶液（1000μg/mL）未知样品1未知样品2管号 1 2 3 4 5 6 7 8 样品/mL0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 1.0 1.0 水/mL 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0 0 蛋白质含量/μg0 200 400 600 800 1000 待测待测染色液(mL)5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 5.02.绘制标准曲线：用723分光光度计在595nm处比色。
考马斯亮蓝法(Bradford法)
考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质浓度1、试剂：（1）考马斯亮蓝试剂：考马斯亮蓝G—250 100mg溶于50ml 95%乙醇，加入100ml 85% H3PO4，用蒸馏水稀释至1000ml, 滤纸过滤。
最终试剂中含0.01%（W/V）考马斯亮蓝G—250, 4.7%（W/V）乙醇，8.5%（W/V）H3PO4。
（2）标准蛋白质溶液：纯的牛血清血蛋白，根据其纯度同0.15mol/L NaCl配制成100 ug/ml蛋白溶液。
2. 器材：（1）可见光分光光度计（2）旋涡混合器3、标准曲线的制作试管编号 0 1 2 3 4 5 6100ug/ml标准蛋白（ml） 0.0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.60.15mol/L NaCl （ml） 1 0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4考马斯亮蓝试剂（ml） 5 5 5 5 5 5 5摇匀，1h内以0号管为空白对照,在595nm处比色A595nm以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标（六个点为10ug、20 ug、30 ug、40 ug、50 ug、60 ug），在坐标轴上绘制标准曲线。
4、样品中蛋白质含量的测定另取两支干净的试管（做一重复），加入合适浓度的待测样品，使其测定值在标准曲线的范围内，测定方法同上，由样品液的吸光度查标准曲线即可求出含量。
注意事项：1、如果要求严格，最好在试剂加入后的5~20min内测定光吸收，因为这段时间内颜色是最稳定的。
2、若选择在旋涡混合器上混合，注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除。
人低转移肺癌细胞 95-C95-D 用5%的1640培养就可以了,消化可用0.25%的胰酶或是稍低浓度的胰酶来消化,由于其贴壁不是很牢,无须吹打就可消化下来.可用1640或DMEM养，两种都用过，95-D贴壁不太牢，消化时轻轻一吹就下来了！3分钟都能下来我养的95C/D很好消化，不加Trypsin,吹都能吹下来。
蛋白质含量的测定(考马斯亮蓝)
Coomassie Dye-Based 蛋白质定量
O CH 2CH 3
Coomassie G-250
NH
PROTEIN
+
CH 3 C + CH3CH 2 N CH 2 SO3CH 3 N CH 2CH 3 CH 2
Hale Waihona Puke SO3NaAcid
BLUE
Protein - Dye Complex
Amax = 595nm
2、样品的测定
取一EP管 加入样品液1.0ml＋4.0ml考马斯亮蓝液 取一EP管，加入样品液1.0ml＋4.0ml考马斯亮蓝液4.0ml，同上操 考马斯亮蓝液4.0ml， 作，测A595
五、 结果及分析
1、以标准管的浓度为横坐标，A595为纵坐 、以标准管的浓度为横坐标， 标做标准曲线图 2、根据标准曲线，求出样品的浓度。 、根据标准曲线，求出样品的浓度。
标准蛋白溶液(mL) 标准蛋白溶液(mL) 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.9％ 0.9％ NaCl(mL) 1.0 0.9 0.8 0.7 0.6 标准蛋白含量( 10 20 30 40 标准蛋白含量(µg) 0 考马斯亮蓝试剂(mL) 4.0 mL 考马斯亮蓝试剂(mL) 颠倒摇匀，静置5min， 号试管为空白对照， 595nm处比色 颠倒摇匀，静置5min，以 1 号试管为空白对照，在595nm处比色 A595（OD595） 0
六、 注意事项
1、EP管、试剂要求干净，不含有去污剂。 EP管 试剂要求干净，不含有去污剂。 2 、 蓝色物质不易洗去 ， 测定完后用乙醇将蓝 蓝色物质不易洗去， 色的比色杯洗干净。 色的比色杯洗干净。
七、 思考题
1、与其它测定蛋白质浓度的方法相比，考马 与其它测定蛋白质浓度的方法相比， 斯亮蓝染色法测定有何优点？ 斯亮蓝染色法测定有何优点？ 2、制作标准曲线及测定样品时，为什么要将 制作标准曲线及测定样品时， 各管中溶液颠倒混合 ？
考马斯亮蓝 法测定蛋白质含量
二、Bradford法(一）、原理：考马斯亮蓝G250 ( CBB- G-250）与蛋白质结合后形成蓝色的化合物，在595nm有最大吸收峰，且蓝色的深浅与蛋白浓度成正比。
这是一种快速、准确、重复性好的蛋白质定量方法。
该方法快速、准确、干扰因素少。
CBB- G-250在2分钟内即可完全与蛋白结合，并在2小时内保持稳定，该反应几乎不受钠、钾等阳离子的干扰，更不受蔗糖等碳水化合物的干扰。
但较高浓度的十二烷基硫酸钠（Soldium dodecyl sulfate），Triton X－100等对其有干扰，此影响可通过选择适当的对照品来消除。
（二）器材及试剂1、器材A. 分光光度计B. 微量加样器C. 移液管、试管及试管架D. 坐标纸2. 试剂（1）考马斯亮蓝G-250溶液：称取CBB- G-250 100毫克溶于50 ml 95%(V/V)乙醇溶液中，然后加入100毫升85%（V/V）磷酸，最后加蒸馏水定容至1000毫升。
（2）0.14mol/L 氯化钠溶液（生理盐水）（3）标准蛋白质溶液（0.1mg/ml）：精确称取10.0毫克牛血清白蛋白，用生理盐水定容至100毫升。
(4) 血清样品(已稀释200倍)(5) 层析样品(三）、操作（标准曲线制作）：取7支试管按下表操作：混匀，室温放置5分钟，在595nm测定各管O.D值并以蛋白浓度为横坐标，以O.D 值为纵坐标绘制标准曲线．以Bradford法测定层析分离蛋白内的蛋白浓度取试管从层析样品中各取20.0ul，加入生理盐水20ul,最后加入考马斯亮蓝G-250溶液5.0ml，混匀，以595nm 波长测定二者光密度，在标准曲线上查出其蛋白浓度以上需要购买的试剂有：1、标准蛋白质即牛血清白蛋白。
教学内容：实验八考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量【实验目的】1. 掌握考马斯亮蓝染色法定量测定蛋白质的原理与方法2. 熟练分光光度计的使用和操作方法【实验原理】此方法是1976年Bradform建立。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量原理
考马斯亮蓝法测蛋白质含量原理
方法原理：
考马斯亮蓝法是一种常用于测定蛋白质含量的光谱分析方法。
该方法基于蛋白质与考马斯亮蓝之间的物理化学相互作用，通过分析其吸光度变化来确定蛋白质的含量。
具体而言，考马斯亮蓝与蛋白质中的氨基酸残基（主要是赖氨酸、组氨酸和色氨酸）发生强烈的静电相互作用。
在酸性条件下，考马斯亮蓝将以阳离子形式结合到蛋白质上，从而使溶液中的考马斯亮蓝吸光度发生变化。
利用该吸光度变化，可以根据标准曲线或计算公式来确定蛋白质的含量。
具体操作上，首先将待测溶液中的蛋白质与酸性的考马斯亮蓝溶液充分混合，在一定的反应时间后，将反应溶液进行离心或过滤，使蛋白质沉淀下来。
然后，用适当的溶液洗涤蛋白质沉淀，以去除杂质。
最后，将洗涤后的蛋白质沉淀重溶并进行吸光度测定。
通过测定吸光度，并利用事先确定的标准曲线或计算公式，可以计算出待测溶液中蛋白质的含量。
考马斯亮蓝法相对简便、快速且具有较高的准确度，广泛应用于生物化学和生物技术等领域的蛋白质测定中。
注意，以上文中没有标题相同的文字。
考马斯亮蓝法
考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量一、目的蛋白质是细胞中最重要的含氮生物大分子之一，承担着各种生物功能。
蛋白质的定量分析是蛋白质构造分析的基础，也是农牧产品品质分析、食品营养价值比较、生化育种、临床诊断等的重要手段。
根据蛋白质的理化性质，提出多种蛋白质定量方法。
考马斯亮蓝G－250法是比色法与色素法相结合的复合方法，简便快捷，灵敏度高，稳定性好，是一种较好的常用方法。
通过本实验学习考马斯亮蓝G－250法测定蛋白质含量的原理，了解分光光度计的结构、原理和在比色法中的应用。
二、原理考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。
考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm波长下有最大光吸收。
其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。
蛋白质与考马斯亮蓝G-250结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h内保持稳定。
该法是1976年Bradford建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4倍，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。
三、仪器、试剂和材料1．仪器（1）分析天平（2）具塞刻度试管10ml×8（3）吸管0.lml×I，lml×Z，5ml×I（4）研钵（5）漏斗（6）离心管10ml（7）容量瓶10ml（8）离心机（9）721型分光光度计2．试剂（1）标准蛋白质溶液称取10mg牛血清白蛋白，溶于蒸馏水并定容至100ml，制成100 pg／ml的原液。
（2）考马斯亮蓝G－250蛋白试剂称取100mg考马斯亮蓝G－250，溶于50ml 90％乙醇中，加入85％（m／v）的磷酸100ml，最后用蒸馏水定容到1000ml。
考马斯亮蓝法的原理
考马斯亮蓝法的原理
考马斯亮蓝法是一种通过观察物体的颜色变化来判断其性质的方法。
这种方法基于考马斯的色彩理论，将特定颜色下的物体辨识和观察融为一体。
该方法的原理是通过改变物体所反射或发射的光的波长和强度，使其显示出不同的颜色。
根据物体的性质，通过对照表或经验判断，可以了解物体的组成或特性。
考马斯亮蓝法主要应用于无机化学实验中。
实验者通过加入特定试剂，使物质发生化学反应或形成络合物，从而改变物质的颜色。
通过观察颜色的变化，可以判断原物质或化学物质的存在与数量。
这种方法通常具有一定的选择性和灵敏性，能够检测出一些微量物质，甚至在样品中的稀有金属等特定成分。
需要注意的是，考马斯亮蓝法虽然可以提供一种快速和经济的分析方法，但仍然需要经验和专业知识的支持。
对于某些复杂的样品或分析目标，可能需要进行更为精确的分析和检测。
因此，在实际应用中，需要综合考虑多种方法，以提高分析的准确性和可靠性。
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量
考马斯亮蓝法测定蛋白质含量1. 前言嘿，朋友们，今天咱们聊聊一个有趣的话题——考马斯亮蓝法，听起来挺高大上的吧？其实这玩意儿就是用来测定蛋白质含量的，简单来说，就是看看你的食物里到底有多少“肌肉”的成分。
想象一下，咱们吃的肉、蛋、豆腐，都是富含蛋白质的食物，咱们用这个方法可以精确地知道它们含有多少蛋白质，绝对是个好玩的实验，来吧，跟我一起揭开它的神秘面纱。
2. 什么是考马斯亮蓝法？2.1 简单介绍首先，咱们来聊聊什么是考马斯亮蓝法。
它其实是一种颜色变化的实验，听起来是不是有点像魔法？你只要把样品（比如说一小块肉或者一勺蛋白质粉）放在试管里，加点特殊的染料，这染料就叫考马斯亮蓝，之后再加点酸溶液，哇，你会发现颜色发生了变化。
更厉害的是，颜色的深浅就能告诉你蛋白质的含量，简直像变魔术一样！这就是为什么它受到许多科学家和实验室的青睐。
2.2 原理揭秘那么，这个颜色变化的背后，究竟有什么科学原理呢？嘿，别着急，听我慢慢说。
考马斯亮蓝这种染料会和蛋白质中的氨基酸发生反应，形成一种稳定的复合物。
这就像是小伙伴们在一起聚会，越多人参加，气氛就越热烈。
随着蛋白质的浓度增加，复合物的数量也就随之增加，所以颜色也会越来越深。
只要用仪器测量一下颜色的深度，咱们就能算出蛋白质的含量，真是既简单又方便。
3. 实验步骤3.1 准备工作想要在家里试一试这个方法，当然得先做好准备。
首先，你得准备好一些材料：考马斯亮蓝染料、酸性溶液（一般用盐酸就可以）、待测样品（不妨试试豆腐或者鸡肉），还有一些基本的实验器材，比如试管、比色皿、量筒等。
别小看这些东西，有时候实验的成功与否就看这些小玩意儿了。
3.2 操作步骤接下来，就是真正的实验时刻了！首先，咱们把待测样品处理一下，比如切成小块，然后用水萃取出蛋白质。
接着，把提取液倒入试管，加入考马斯亮蓝染料，搅拌均匀。
再倒入酸性溶液，注意，这里要控制好比例，不然可就要出乱子了。
然后，静置几分钟，让颜色充分反应。
考马斯亮蓝法测蛋白质含量(原理
考马斯亮蓝法测蛋白质含量(原理考马斯亮蓝法（Bradford Assay）是一种常用的蛋白质含量测定方法。
它基于蛋白质与一种铜离子络合的原理，通过测定在碱性条件下蛋白质-考马斯亮蓝配合物与吸光度之间的关系，来确定蛋白质含量。
考马斯亮蓝法有以下几个特点：1. 敏感度高：考马斯亮蓝法对大多数蛋白质具有很高的灵敏度，可以检测到微量的蛋白质。
2. 特异性好：虽然考马斯亮蓝法可以测定多种类型的蛋白质，但对不同蛋白质的反应程度是有差别的，因此它在特异性上表现较好。
3. 操作简便：考马斯亮蓝法具有简单、快速、稳定性好等优点，非常适合大规模蛋白质含量的测定。
4. 利用范围广：除了用于测定溶液中的蛋白质含量外，考马斯亮蓝法还可用于固相蛋白质含量测定、酶联免疫吸附试验（ELISA）等领域。
1. 制备标准曲线：首先需要制备一组蛋白质浓度已知的标准溶液，常用的标准蛋白质有牛血清白蛋白、胰蛋白酶等。
将这组标准溶液分别加入少量试剂和适量去离子水，制备出一系列不同浓度的样本溶液，用吸光度计测定它们的吸光度值，并以浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线。
2. 取待测样本：从所需样本中挑选适量，加入量一般为10~100 μg，用去离子水稀释至一定浓度。
3. 添加试剂：向标准溶液和样品中分别加入适量的考马斯亮蓝试剂，0.5 ml的试样通常需要添加0.1 ml试剂。
4. 摇匀反应：使用磁力搅拌器或振荡器将样品和试剂充分混合，使反应达到最大化。
5. 测定吸光度：待反应结束后，用吸光度计测定样品的吸光度值，一般在595 nm波长处读数。
6. 读取浓度：根据标准曲线，将测出的吸光度值与标准曲线上对应浓度值对照，就可以推测样品中蛋白质的含量。
需要注意的是，考马斯亮蓝法本身也有一些缺陷。
例如，不同蛋白质的反应程度有差别，容易受到其他物质的影响而产生误差。
此外，在测定含有其他物质的样品中，需要对反应条件进行优化和校正，才能更准确地测定蛋白质含量。
蛋白质的速测技术—考马斯亮蓝法(Bradford法)和考马斯亮蓝速测管法
蛋白质的速测技术—考马斯亮蓝法(Bradford法)和考马斯亮蓝速测管法1．速测原理考马斯亮蓝法(Bradford法)按照蛋白质与染料相结合的原理设计。
G250(Coomassie G250)是一种甲基取代的，分子中磺酸基的蓝色染料。
考马斯亮蓝G250能与蛋白质通过范德华互相作用形成蛋白质-考马斯亮蓝复合物青蓝色溶液，在595nm处有最大汲取值，复合物溶液色彩的深浅与蛋白质的浓度成正比。
Bradford法敏捷度高，最低测试蛋白质量在1ug左右；测定迅速、简便，只需加1种试剂。
完成一个样品的测定，只需5 min左右。
因为染料与结合的过程，大约只要2min即可完成，其色彩可以在1h内保持稳定，且在5～20min之间，色彩稳定性好。
这种蛋白质测定法具有突出优点，正在得到广泛应用。
2．速测范围利用溶液色彩的差异举行比色测定，适合于蛋白质类的定量分析，尤其适合于稀少蛋白质的微量分析。
3．试剂与材料 (1)标准蛋白质溶液。
用球蛋白G或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/mL和0.1mg/mL的标准蛋白质溶液。
(2)考马斯亮蓝G-250染料试剂。
称100mg考马斯亮蓝G-250，溶于50mL 95％的后，再加入120mL 85％的，用水稀释至1L。
(3)器材：可见光分光光度计，旋涡混合器，试管16支。
4．速测步骤 1)标准办法 (1)取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按挨次分离加入样品、水和试剂，即用1.0mg/mL的标准蛋白质溶液给各试管分离加入：0、0.01、0.02、0.040、0.06、0.08、0.1mL，然后用无离子水补充到0.1mL。
最后各试管中分离加入5.0mL考马斯亮蓝G-250试剂，每加完一管，立刻在旋涡混合器上混合(注重不要太强烈，以免产生大量气泡而难于消退)。
(2)加完试剂2～5 min后，即可开头用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm处的光汲取值A595，空白对比为第一号试管，即0.1mL H2O加5.0mL G-250试剂。
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蛋白质含量的测定——考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)染色法
点击次数：820 发布时间：2011-8-23
实验原理
考马斯亮蓝(Coomassie Brilliant Blue)法测定蛋白质浓度，是利用蛋白质―染料结合的原理，定量的测定微量蛋白浓度的快速、灵敏的方法。
这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。
这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰(lmax)的位置，由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。
通过测定595nm处光吸收的增加量可知与其结合蛋白质的量。
研究发现，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基相结合。
考马斯亮蓝染色法的突出优点是：
(1)灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。
这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry 法要大的多。
(2)测定快速、简便，只需加一种试剂。
完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。
由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。
因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
(3)干扰物质少。
如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA 等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
(1)由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此考马斯亮蓝染色法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
(2)仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、 Triton X-100、十二烷基硫酸钠(SDS)等。
试剂与器材
一、试剂
考马斯亮蓝试剂：
考马斯亮蓝G―250 100mg溶于50mL 95%乙醇中，加入100mL 85%磷酸，用蒸馏水稀释至1000mL。
二、标准和待测蛋白质溶液
1．标准蛋白质溶液
结晶牛血清蛋白，预先经微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，根据其纯度用0.15mol/L NaCl配制成1mg/mL 蛋白溶液。
2．待测蛋白质溶液。
人血清，使用前用0.15mol/L NaCl稀释200倍。
三、器材
试管1.5×15cm(×6)，试管架，移液管管0.5mL(×2)；1mL(×2)；5mL(×1)；恒温
水浴；分光光度计。
操作方法
一、制作标准曲线
取7支试管，按下表平行操作。
试管编号0 1 2 3 4 5 6
标准蛋白溶液(mL) 0 0.01 0.02 0.03 0.04 0.05 0.06
0.15mol/L
0.1 0.09 0.08 0.07 0.06 0.05 0.04
NaCl(mL)
考马斯亮蓝试剂
5mL
(mL)
摇匀，1h内以0号管为空白对照，在595nm处比色
A595nm
绘制标准曲线：以A595nm为纵坐标，标准蛋白含量为横坐标，在坐标纸上绘制标准曲线。
二、未知样品蛋白质浓度测定
测定方法同上，取合适的未知样品体积，使其测定值在标准曲线的直线范围内。
根据所测定的A595nm值，在标准曲线上查出其相当于标准蛋白的量，从而计算出未知样品的蛋白质浓度(mg/mL)。
注意事项
∙在试剂加入后的5－20min内测定光吸收，因为在这段时间内颜色是最稳定的。
∙测定中，蛋白－染料复合物会有少部分吸附于比色杯壁上，测定完后可用乙醇将蓝色的比色杯洗干
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