免疫组化技术常见问题及处理方法ppt课件
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• 按结合方式可分为抗原- 抗体结合，如过氧化物 酶- 抗过氧化物酶（PAP ）法；亲和连接，如卵 白素- 生物素-过氧化物酶复合物（ABC ）法、链 霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等
• SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型 二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高 的组织抗原检测
9. 自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝。 10.如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，
中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接 用水性封片剂封片。
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二步法(Envision系统)
• 1）脱蜡、水化组织切片。 • 2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。 • 3）0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧
化物酶，PBS 或TBS 冲洗。 • 4）滴加一抗，室温或 37℃孵育30-60分钟，或 4℃过夜，PBS或
TBS浸洗3分钟×5次。 • 5）滴加enhangcer 增强剂（试剂A），37度30min ，PBS或TBS浸
洗3 分钟×5次。 • 6）滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体（试剂B），室温37℃孵
免疫组化技术
常见问题及处理方法
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免疫组织化学的定义
用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些 化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定 位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术或免 疫细胞化学技术
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免疫组织化学的原理
• 根据抗原抗体反应和化学显色原理 • 组织切片或细胞标本中的抗原和一抗结合 • 利用一抗与标记生物素（HRP、 AKP ） 、荧光
素等的二抗进行反应 • 通过呈色反应或荧光显示细胞或组织中化学成分，
在光学显微镜或荧光显微镜观察确定某些化学成 分的分布和含量
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免疫组织化学的分类
• 按标记物质的种类，可分为酶标记、胶体金标记、 荧光标记和放射性标记等
• 按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接 法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间 接法的灵敏度提高了许多
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6. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl生物素标记的第二抗体(试剂 C)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。
7. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl链霉菌抗生物素-过氧化物酶 溶液(试剂D)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。
8. 除去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB或AEC溶液， 显微镜下观察3-10分钟。
织发硬发脆 • 浸蜡应选择低熔点的石蜡，浸蜡应充分
如果组织脱水、浸蜡不充分，蜡块会出现组织收缩凹陷， 而且在免疫组化热抗原修复操作时会容易脱片
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标本的切片、捞片、烤片
• 切片通常以3～4um的厚度为宜,太厚易掉片，细 胞重叠，对细胞膜阳性结果观察不理想
• 捞片要求达到无皱折、无气泡，水温宜在（48～ 50℃）
• 培养细胞或细胞涂片，应自然晾干后用纯丙酮固 定2遍，4 ℃或－20 ℃冰箱保存
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可被检测的物质
• 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白 质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激 素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进 行检测
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免疫组织化学的特点
• 1）特异性强 • 2）敏感性高 • 3）定位准确、形态与功能相结合
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Western blotting、ELISA 与免疫组化的异同
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免疫组织化学方法的基本步骤
• 组织和细胞的处理 • 抗原修复 • 染色
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鼠单克隆抗体或多克隆抗体（兔抗血清）
鼠单克隆抗体 • 特异性较高 • 背景较干净 • 有多种潜在用途 • 但敏感性、亲和力低
兔多克隆抗体（兔抗血清） • 高敏感性、亲和力 • 可能有较多的交叉反应 • 更多的潜在用途
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SP法
• 80℃烘烤1～2h
• 玻片用防脱片或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性
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冰冻切片的处理
• 冰冻切片的组织抗原保存好 • 通常以5um的厚度为佳 • 冷风吹干后用纯丙酮固定2遍,干燥置入4 ℃冰箱
短期保存，－20℃冰箱长期干燥保存 • 缺点是不易做出好的冰冻切片，易出现冰晶、细
胞肿胀等现象
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细胞涂片的处理
育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗3分钟×5次。 • 7）应用DAB 溶液显色。 • 8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。
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Envision系统的优点
敏感性高 背景干净（消除内源性生物素的干扰） 步骤简单
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石蜡切片标本的固定
1、组织离体后尽快固定，切开固定效果好 2、固定液以10％中性福尔马林缓冲液为佳 3、固定时间在4h-24h之间，长时间固定会影响抗
1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3分钟。 2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。 3. 每张切片加1滴或50μl过氧化酶阻断溶液(试剂A)，室温下孵育
10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分 钟。 4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl正常非免疫动物血清(试剂B)， 室温下孵育10分钟。 5. 除去血清，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(用户自选)，室温 下孵育60分钟或4℃过夜，建议参见每种抗体的说明书。 4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min， PBS冲洗3次，每次3分 钟。
• Western blotting：蛋白质免疫印迹，检查组织 或细胞样品内蛋白含量的检测方法，与免疫组化 技术相比，定量可能更加准确；也可定性和定位， 但敏感性远远低于免疫组化技术
• ELISA ：酶联免疫吸附试验，检查体液或组织匀 浆中蛋白含量的检测，与免疫组化技术相比，定 量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一
原决定簇的暴露，产生阴性结果 4、固定液的量要超过组织体积5倍以上
如果组织固定不及时或不完全固定,HE染色细胞 核发灰模糊，对比不鲜明；免疫组化染色结果不 理想，通常组织离体2h后抗原完全丢失
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固定不充分
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ຫໍສະໝຸດ Baidu
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标本的取材、脱水、浸蜡
• 标本的取材厚度以2mm为宜 • 梯度酒精脱水尽量彻底充分 • 二甲苯透明时间不宜长，1～3h为佳，透明过度会导致组
• 按结合方式可分为抗原- 抗体结合，如过氧化物 酶- 抗过氧化物酶（PAP ）法；亲和连接，如卵 白素- 生物素-过氧化物酶复合物（ABC ）法、链 霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结（SP）法等
• SP法是比较常用的方法；聚合物链接，如即用型 二步法，此方法尤其适合于内源性生物素含量高 的组织抗原检测
9. 自来水冲洗，苏木素复染，PBS或自来水冲洗返蓝。 10.如果用DAB显色，则切片经过梯度酒精脱水干燥，二甲苯透明，
中性树胶封固；如果用AEC显色，则切片不能经酒精脱水，而直接 用水性封片剂封片。
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二步法(Envision系统)
• 1）脱蜡、水化组织切片。 • 2）根据所应用的一抗的特殊要求，对组织切片进行预处理。 • 3）0.3%或3%H2O2去离子水孵育5分钟-30分钟，以阻断内源性过氧
化物酶，PBS 或TBS 冲洗。 • 4）滴加一抗，室温或 37℃孵育30-60分钟，或 4℃过夜，PBS或
TBS浸洗3分钟×5次。 • 5）滴加enhangcer 增强剂（试剂A），37度30min ，PBS或TBS浸
洗3 分钟×5次。 • 6）滴加通用型IgG抗体-Fab段-HRP多聚体（试剂B），室温37℃孵
免疫组化技术
常见问题及处理方法
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免疫组织化学的定义
用标记的特异性抗体对组织切片或细胞标本中某些 化学成分的分布和含量进行组织和细胞原位定性、定 位或定量研究，这种技术称为免疫组织化学技术或免 疫细胞化学技术
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免疫组织化学的原理
• 根据抗原抗体反应和化学显色原理 • 组织切片或细胞标本中的抗原和一抗结合 • 利用一抗与标记生物素（HRP、 AKP ） 、荧光
素等的二抗进行反应 • 通过呈色反应或荧光显示细胞或组织中化学成分，
在光学显微镜或荧光显微镜观察确定某些化学成 分的分布和含量
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免疫组织化学的分类
• 按标记物质的种类，可分为酶标记、胶体金标记、 荧光标记和放射性标记等
• 按染色步骤可分为直接法（又称一步法）和间接 法（二步、三步或多步法）。与直接法相比，间 接法的灵敏度提高了许多
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6. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl生物素标记的第二抗体(试剂 C)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。
7. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl链霉菌抗生物素-过氧化物酶 溶液(试剂D)，室温下孵育10分钟。PBS冲洗3次，每次3分钟。
8. 除去PBS液，每张切片加2滴或100μl新鲜配制的DAB或AEC溶液， 显微镜下观察3-10分钟。
织发硬发脆 • 浸蜡应选择低熔点的石蜡，浸蜡应充分
如果组织脱水、浸蜡不充分，蜡块会出现组织收缩凹陷， 而且在免疫组化热抗原修复操作时会容易脱片
.
标本的切片、捞片、烤片
• 切片通常以3～4um的厚度为宜,太厚易掉片，细 胞重叠，对细胞膜阳性结果观察不理想
• 捞片要求达到无皱折、无气泡，水温宜在（48～ 50℃）
• 培养细胞或细胞涂片，应自然晾干后用纯丙酮固 定2遍，4 ℃或－20 ℃冰箱保存
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可被检测的物质
• 组织或细胞中凡是能作为抗原或半抗原，如蛋白 质、多肽、氨基酸、多糖、磷脂、受体、酶、激 素、核酸及病原体等都可用相应的特异性抗体进 行检测
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免疫组织化学的特点
• 1）特异性强 • 2）敏感性高 • 3）定位准确、形态与功能相结合
.
Western blotting、ELISA 与免疫组化的异同
.
免疫组织化学方法的基本步骤
• 组织和细胞的处理 • 抗原修复 • 染色
.
鼠单克隆抗体或多克隆抗体（兔抗血清）
鼠单克隆抗体 • 特异性较高 • 背景较干净 • 有多种潜在用途 • 但敏感性、亲和力低
兔多克隆抗体（兔抗血清） • 高敏感性、亲和力 • 可能有较多的交叉反应 • 更多的潜在用途
.
SP法
• 80℃烘烤1～2h
• 玻片用防脱片或多聚赖氨酸处理，以增强粘附性
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冰冻切片的处理
• 冰冻切片的组织抗原保存好 • 通常以5um的厚度为佳 • 冷风吹干后用纯丙酮固定2遍,干燥置入4 ℃冰箱
短期保存，－20℃冰箱长期干燥保存 • 缺点是不易做出好的冰冻切片，易出现冰晶、细
胞肿胀等现象
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细胞涂片的处理
育30分钟-1h，PBS/TBS冲洗3分钟×5次。 • 7）应用DAB 溶液显色。 • 8）蒸馏水冲洗、复染、脱水、透明、封片。
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Envision系统的优点
敏感性高 背景干净（消除内源性生物素的干扰） 步骤简单
.
石蜡切片标本的固定
1、组织离体后尽快固定，切开固定效果好 2、固定液以10％中性福尔马林缓冲液为佳 3、固定时间在4h-24h之间，长时间固定会影响抗
1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗3次，每次3分钟。 2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。 3. 每张切片加1滴或50μl过氧化酶阻断溶液(试剂A)，室温下孵育
10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。PBS冲洗3次，每次3分 钟。 4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl正常非免疫动物血清(试剂B)， 室温下孵育10分钟。 5. 除去血清，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(用户自选)，室温 下孵育60分钟或4℃过夜，建议参见每种抗体的说明书。 4度过夜和从冰箱拿出后37度复温45min， PBS冲洗3次，每次3分 钟。
• Western blotting：蛋白质免疫印迹，检查组织 或细胞样品内蛋白含量的检测方法，与免疫组化 技术相比，定量可能更加准确；也可定性和定位， 但敏感性远远低于免疫组化技术
• ELISA ：酶联免疫吸附试验，检查体液或组织匀 浆中蛋白含量的检测，与免疫组化技术相比，定 量最准确，是分泌性蛋白检测首选方法之一
原决定簇的暴露，产生阴性结果 4、固定液的量要超过组织体积5倍以上
如果组织固定不及时或不完全固定,HE染色细胞 核发灰模糊，对比不鲜明；免疫组化染色结果不 理想，通常组织离体2h后抗原完全丢失
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固定不充分
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ຫໍສະໝຸດ Baidu
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标本的取材、脱水、浸蜡
• 标本的取材厚度以2mm为宜 • 梯度酒精脱水尽量彻底充分 • 二甲苯透明时间不宜长，1～3h为佳，透明过度会导致组