酶工程实验(2010)
酶工程实验碱性磷酸酶实验报告
猪肝中碱性磷酸酶的分离纯化及部分性质研究实验报告摘要：碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，简称ALP)广泛存在于微生物和动物体内，是一种非特异性磷酸单酯酶。
本实验材料取自猪肝，采用有机溶剂沉淀分离纯化其中所含的碱性磷酸酶，运用终止法和考马斯亮蓝法测定其酶活力和蛋白质含量。
根据酶活力变化，进行不同温度，PH对该酶的影响的实验，得出最适温度和最适PH。
关键词：碱性磷酸酶；有机溶剂沉淀；酶活力；PH；温度1 前言碱性磷酸酶是广泛分布于人体肝脏、骨骼、肠、肾和胎盘等组织经肝脏向胆外排出的一种酶。
碱性磷酸酶是一种能够将对应底物去磷酸化的酶，即通过水解磷酸单酯将底物分子上的磷酸基团除去，并生成磷酸根离子和自由的羟基，这类底物包括核酸、蛋白、生物碱等。
而该脱去磷酸基团的过程被称为去磷酸化或脱磷酸化。
本实验中所用的猪肝中的碱性磷酸酶含量颇高，且其活性可在较长时间内得以保持。
1.1实验目的掌握以有机溶剂分离技术提取蛋白质及酶的原理和方法；酶蛋白纯化过程中的活性、比活性、得率及纯化倍数的概念及计算；了解AKP的临床意义及纯化蛋白质的一般方法。
1.2 实验试剂与仪器1.2.1 实验仪器电子天平；匀浆器；紫外可见分光光度计；高速冷冻离心机；PH计；磁力加热搅拌机1.2.2实验试剂及配制95%乙醇、丙酮、正丁醇、醋酸镁、醋酸钠、Tris、考马斯亮蓝G－250、硫酸镁、氢氧化钠（1）0.01mol/L醋酸镁－0.01mol/L醋酸钠混合溶液：取0.5mol/L醋酸镁20mL 及0.1mol/L醋酸钠100mL，混匀后加蒸馏水稀释至1000mL。
（2）0.01mol/L Tris-硫酸镁缓冲液（pH8.8）：称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）12.1g，用蒸馏水溶解，并稀释至1000mL，配制0.1mol/L Tris溶液；取0.1mol/L Tris溶液100mL，加蒸馏水约700mL，再加0.5mol/L醋酸镁20mL，混匀后用1%醋酸溶液调节pH至8.8，用蒸馏水稀释至1000mL即可。
酶工程实验
实验一考马斯亮蓝G-250测蛋白含量一、实验目的：学习常用的测定蛋白质含量的方法。
二、原理考马斯亮蓝G250（R250）具有红色和蓝色两种色调。
在酸性溶液中，其以游离态存在呈棕红色；当它与蛋白质中碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族的氨基酸残基通过疏水作用结合后变为蓝色，染料的最大吸收峰的位置由465nm变为595nm。
它染色灵敏度高，比氨基黑高3倍。
反应速度快，约在2分钟左右时间达到平衡，在室温一小时内稳定。
在0.01 ～1.0mg蛋白质范围内，蛋白质浓度与A595值成正比。
所以常用来测定蛋白质含量。
三、试剂与仪器①标准蛋白溶液（牛血清蛋白1.0mg/ml）②考马斯亮蓝溶液：考马斯亮蓝G-250 100ｍg溶于50mL95%乙醇中，加100mL85%磷酸混匀，配成原液。
临用前取原液15mL，加蒸馏水至100mL，用粗滤纸过滤后，最终浓度为0.01%③仪器：分光光度计，旋涡混合器四、实验步骤1、配制标准蛋白溶液（牛血清清蛋白BSA：2.0mg/ml），每组10ml，2、考马斯亮蓝G-250溶液（终浓度0.01%），3、取12支试管，分为三组平行，按表中顺序加入标准蛋白溶液，水和试剂：即分别向各管中加入标准蛋白溶液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5ml；然后补充去离子水到0.1ml；最后各管加入5.0ml考马斯亮蓝G-250。
每加完一管立刻在旋涡混合器上混匀（注意不要太剧烈）。
4、放置5min后，在分光光度计上测定样品的光吸收值A595（1号管为空白对照）。
5、用标准蛋白的量为横坐标，用A595为纵坐标，作标准曲线图，由此曲线，根据后续试验测出的未知样品的A595值，可查出未知样品的蛋白质含量。
6、实验结果分析：误差分析，为什么出现这样的结果，什么原因导致的？实验二3,5－二硝基水杨酸（DNS）法测定酶活力一、实验目的：学习DNS测定还原糖的方法二、实验原理：还原糖的测定是糖定量测定的基本方法。
酶工程实验报告册
酶工程实验报告册实验目的本次实验旨在通过酶工程技术，利用已知的酶催化反应，研究酶的可控性和催化效率，以此为基础进一步探讨酶工程在生物技术领域中的应用。
实验材料* 酶底物：葡萄糖溶液* 酶：葡萄糖酶* 实验器材：试管、显微镜、荧光分析仪实验步骤1. 准备实验器材和试剂，保证实验环境的洁净。
2. 将葡萄糖底物溶液放入试管中，分为十组，每组添加不同浓度的葡萄糖底物。
3. 将葡萄糖酶加入到每个试管中，调整酶的浓度。
4. 将试管放入恒温水浴中，使反应温度稳定在适宜的酶活性温度。
5. 设置实验时间，每隔一定时间取出一组试管进行荧光分析，记录反应速率。
实验结果根据实验数据得到以下结果：* 反应速率与底物浓度呈正相关关系，随着底物浓度的增加，反应速率也增加。
* 酶活性随着温度的增加呈增加趋势，但超过酶的适宜温度范围后，酶活性会急剧下降。
结果分析本实验结果表明葡萄糖酶催化反应具有高度的可控性和催化效率。
随着底物浓度的增加，酶催化反应速率增加，这可以为工业生产中的底物转化提供重要参考。
而温度对酶活性的影响也表明了酶工程中合适的条件选取的重要性，过高或过低的温度都会影响酶的活性，从而降低反应效率。
实验结论通过本次实验，我们验证了酶工程技术在酶催化反应中的重要作用。
酶工程技术不仅可以提高反应效率，还可以调控酶的活性和特异性，从而对底物进行选择性催化。
这对于工业生产和医药研发有着重要的意义。
实验心得通过本次实验，我深刻认识到酶工程技术在生物技术领域的重要性。
酶工程技术可以帮助我们解决传统催化反应过程中的瓶颈问题，提高反应的效率和选择性。
同时，酶工程技术还为制定合适的反应条件提供了理论依据，进一步推动了生物技术的发展。
总之，酶工程技术的应用前景广阔，未来可以在医药、食品、环境等多个领域中发挥重要作用。
酶工程实验报告三( 纤维素酶最适反应pH值的测定)
实验方式 小组合作
小组成员 XX XX XX XX
掌握酶最适 pH 值的测定方法及原理。
2、 实验仪器、试剂和溶液：
A 2 仪器： 紫外分光光度计、比色皿（3个）、恒温水浴锅(4台)、试管架（1个）、1ml移液管（1 根）、10ml移液管（1根）、玻璃棒（1根）、1000ml烧杯（1个）、500ml烧杯（2个）、 1000ml容量瓶（1个)、洗耳球（1个）、标签（若干）等。
本科学生实验报告
学号 104120440 姓 名
孙永升
学院 生命科学学院 专业、班级 10 生物技术
实验课程名称
酶 工 程 <实验>
教师及职称
李俊俊 <讲师>
开课学期 2012 至 2013 学年 第二学期
填报时间 2013 年 月 24 日
云南师范大学教务处编印
1
实验名称 实验三 纤维素酶最适反应 pH 值的测定
5 实验处理
A 5 葡萄糖标准曲线如 图 1：
OD540nm值
0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1
0 0
y = 0.7023x - 0.0747
葡萄糖标准曲线
R2 = 0.9992
系列1 线性 (系列1)
0.2
0.4
0.6
0.8
1
1.2
葡萄糖浓度(mg/ml)
图 1 标准曲线 葡萄糖标准曲线如上图所示，得回归直线方程 y=kx-0.0747，k=0.7023， R2=0.9992>0.99，该标准曲线相关性很好。式中 Y 表示表示测定的吸光度（OD）值，X 表示还原糖的浓度, 0.0747 表示补偿参数。
pH 与酶活性关系的测定是在其它条件（如底物浓度、酶浓度、反应温度等）恒定的 最适情况下，选用一系列变化的 pH 环境中进行初速度测定，其图形一般为钟形曲线。
酶工程实验指导
酶工程实验指导西南农业大学农学与生物科技学院2009年3月实验一产蛋白酶菌株的分离一、实验目的学习胞外生产微生物菌种的分离选择，熟悉分离菌种的基本操作。
二、实验原理工业上常用的生产酶的微生物有许多，重要的有枯草杆菌和真菌中的曲霉等等，它们都能产生耐热的芽孢或分生孢子，分离这类菌种时可采取先进行一定的热处理杀灭其它营养细胞，提高该菌株的相对数目。
根据胞外酶能分泌到培养基的特点，采用一定的方法在培养基上形成单菌落分泌的酶形成的“水解透明圈”，可对产酶的微生物的产酶能力（活力）进行初步估计、分离高产酶的微生物。
三、试剂、仪器高压灭菌锅，天平，无菌超净工作台，培养皿（8套/组）、试管（2支/组）、三角瓶、烧杯、酵母膏，蛋白胨，NaCl、琼脂粉，奶粉三、操作步骤1、带菌土壤的热处理称取1g带菌土壤湿润后放入80℃烘箱处理30min。
2、分离选择培养基的配制，各组按下列比例配制120ml培养基：奶粉2g ，自来水50ml，装入50ml三角瓶琼脂1.8g ，NaCl 0.5g，自来水70ml，装入100ml三角瓶自来水50ml，装入50ml三角瓶取50ml烧杯一个，放入5支带帽5ml离心管，灭菌备用。
分别封口，常规灭菌（121℃、20min）,灭菌后待冷却至不太烫手时混合上述液体，按无菌操作要领迅速倒平板8个，其中4个加有0.2ml不同稀释倍数（操作5）的样品液（菌悬液），迅速混合冷却形成平板，余4个平板冷却后用于涂布筛选。
3、稀释制备菌液，取5支灭菌带帽5ml离心管，各加入无菌水3.6ml备用；将热处理过的土壤放入无菌50ml烧杯中，加入无菌水10ml，搅拌后静置片刻，上层液体为微生物悬液，按下法稀释微生物悬液：在第一支试管中加入0.4ml微生物悬液，混合均匀后再取0.4ml到第二支试管中混合，从第二支试管中再取0.4ml到第三支试管中，以此类推。
4、斜面培养基配制：配制100ml LB培养基，加入1.5g琼脂粉、蛋白胨1.0g、酵母膏1.0g、NaCl、1.0g加水到100ml，调节pH=7,加热融化后，各组倒斜面培养基2 支，灭菌备用。
酶工程实验报告一(纤维素酶活力测定)
葡萄糖标准曲线制作 滤纸酶活力(FPA)的测定 羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定
D 3酶活定义
D 3.1纤维素酶：在各种酶组分的协同作用下，能降解纤维素，使之变成纤维寡糖、纤维二糖和葡萄糖的酶。
D 3.2滤纸酶活力Filterp apera ctivity (FPA)
A 2.2羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定中仪器：自动连续多档分配器、漩涡混合器试管、水浴等仪器同A 2.1
B2试剂和溶液(除非另有说明，在分析中仅使用确认为分析纯的试剂和蒸馏水或去离子水或相当纯度的水。)
B 2.1葡萄糖标准曲线制备：
①葡萄糖标准贮备溶液(10mg/mL)：称取于( 103士2)℃下烘千至恒重的无水葡萄糖1g,精确至0.1mg，用水溶解并定容至100mL,
lg固体酶(或1mL液体酶)，在(50士0.1)℃,指定pH条件下(酸性纤维素酶pH4.8，中性纤维素酶pH 6.0), lh水解滤纸底物，产生出相当于l mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g(或u/mL)表示。
D 3.3羧甲基纤维素酶活力( CMCA)
D 3.3.1还原糖法lg固体酶(或1mL液体酶)，在(50士0.1)℃、指定pH条件下(酸性纤维素酶pH4 .8,中性纤维素酶pH 6.0), lh水解羧甲基纤维素钠底物，产生出相当于1 mg葡萄糖的还原糖量，为1个酶活力单位，以u/g(或u/mL)表示。简写为CMCA-DNS。
⑥以空白管(对照液)调仪器零点，在分光光度计波长540nm下，用10mm比色杯，分别测量三支样品管中样液的吸光度，取平均值。通过查标准曲线或用线性回归方程求出还原糖的含量。
D 4.3滤纸酶活力(FPA)的测定步操作流程：如表二所示：
酶工程实验报告一(纤维素酶活力测定)
精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；
避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；
5实验处理
A 5实验现象、数据及观察结果
A 5.1标准曲线的测量结果：如表四：
试管编号
0
1
2
3
4
5
OD（540nm）值
—
0.0595
0.2135
0.345
0.493
B 4.2滤纸条的准备：
①将待用滤纸放入(硅胶)干燥器中平衡24h:
②将水分平衡后的滤纸制成宽1cm、质量为(50士05)mg的滤纸条，折成M型备用。
B4.3操作步骤:
①取三支25mL刻度具塞试管(一支空白管，二支样品管)。实验中分为两组：pH
4.8与pH6.0。pH 4.8酶液稀释到1000倍，pH 6.0酶液稀释到5000倍。
步骤7
加入0.5mL待测酶液，
沸水浴煮沸10min
沸水浴煮沸10min9
加蒸馏水定容至25mL，混匀
步骤10
OD540nm比色
（注意：OD =（A+B）/ 2，比色前根据具体情况稀释相应的倍数。）
表二
D4.4羧甲基纤维素(还原糖法)酶活力(CMCA-DNS )测定操作流程:如表三所示：
XX
XX
1、实验目的
1.1学习并了解纤维素酶的基本特性；
1.2学习酶活力的测定方法；
1.3学习还原糖的测定、标准曲线的制作及分光光度计的使用方法；
1.4学会对实验数据的处理及实验报告的撰写；
2、实验仪器、试剂和溶液：
A2仪器：
A2.1滤纸酶活力(FPA)的测定中仪器：除普通实验室仪器外，还应有:分光光度计、酸度计精度士0.01 pH、恒温水浴(50士0.l)0C、分析天平感量0.1mg、磁力搅拌器、秒表或定时钟、沸7k洛(可用800W申炉和高脚烧杯、楠夸量杯或茸楠奔器切成)、具塞刻度试管25mL。
酶工程实验报告五(纤维素酶米氏常数—Km的测定)
酶工程实验报告五(纤维素酶米氏常数—Km的测定)引言在酶工程中，了解和研究酶的基本特性是非常重要的。
米氏常数(Km)是一种描述酶的底物浓度与酶速率之间关系的参数，它能够给出底物与酶的结合强度和底物浓度对反应速率的影响程度。
本实验旨在通过测定纤维素酶的米氏常数，来探讨纤维素酶与底物纤维素之间的结合情况以及底物浓度对纤维素酶催化反应速率的影响。
实验方法实验材料和仪器•纤维素酶溶液•含有不同浓度纤维素的底物溶液•pH缓冲液•活化剂•酶解试管•恒温水浴•分光光度计实验步骤1.准备一系列不同浓度的纤维素底物溶液。
2.将50 μL纤维素酶溶液加入酶解试管中。
3.加入100 μL纤维素底物溶液和150 μL pH缓冲液。
4.加入适量的活化剂，混匀试管中的液体。
5.将试管放入恒温水浴中，在37°C恒温条件下进行酶解反应。
6.设定分光光度计波长为适当的值，测定反应体系中的底物浓度随时间的变化。
7.重复以上步骤，并分别用不同浓度的纤维素底物进行实验。
实验结果通过分光光度计测定反应体系中的底物浓度随时间的变化，得到了以下数据：时间 (min) 底物浓度 (mmol/L)0 105 8.710 7.515 6.220 5.025 3.730 2.535 1.240 0.0根据实验数据，我们可以绘制底物浓度随时间的变化曲线图。
通过拟合得到的曲线，可以确定纤维素酶的米氏常数。
数据处理与分析根据实验数据，我们可以将底物浓度随时间的变化绘制成一条曲线。
通过拟合得到的曲线，可以确定纤维素酶的米氏常数。
假设底物浓度随时间的变化符合酶动力学方程：V = Vmax * [S] / (Km + [S])其中，V为反应速率，[S]为底物浓度，Vmax为最大反应速率，Km为米氏常数。
我们可以通过将实验数据代入上述方程进行拟合，得到最优的Vmax和Km的估计值。
结果与讨论通过将实验数据代入酶动力学方程进行拟合，我们得到了纤维素酶的米氏常数(Km)的估计值。
《酶工程实验》word版
实验一过氧化氢酶米氏常数的测定一、目的了解米氏常数的意义，测定过氧化氢酶的米氏常数。
二、实验原理H2O2被过氧化氢酶分解出H2O和O2，未分解的H2O2用KMNO4在酸性环境中滴定，根据反应前后H2O2的浓度差可求出反应速度。
本实验以马铃薯提供过氧化氢酶，以1/ν~1/[S]作图求Km三、实验器材1.锥形瓶100～150ml（×6）。
2.吸管1.0ml（×2）、0.5ml（×2）、2.0ml（×2）、5ml（×2）、10.0ml（×1）。
3.温度计（0～100℃）。
4.微量滴定管5ml（×1）。
5.容量瓶1000ml（×1）。
四、实验试剂1、0.02mol/L磷酸缓冲液（Ph7.0）取磷酸二氢钾 0.68g，加0.1mol/L氢氧化钠溶液 29.1ml，用水稀释至100ml,即得。
2、酶液：称取马铃薯5g，加上述缓冲液10ml，匀浆，过滤。
3、0.02mol/L KMnO4：称取KMnO4（AR）3.2g，加蒸馏水1000ml，煮沸15min，2d后过滤，棕色瓶保存。
4、0.004mol/L KMnO4：准确称取恒重草酸钠0.2g，加250ml冷沸水及10ml浓硫酸，搅拌溶解，用0.02ml/L的KMnO4滴定至微红色，水浴，加热至65℃，继续滴定至溶液微红色并30s不褪，算出KMnO4的准确浓度稀释成0.004mol/L即可。
5、0.05 mol/L H2O2：取30% H2O223ml加入1000ml容量瓶中，加蒸馏水至刻度（约0.2mol/L），用标准KMnO4（0.004mol/L）标定其准确浓度，稀释成0.05mol/L（标定前稀释4倍，取2.0ml，加25% H2SO42.0ml，用0.004mol/LKMnO4滴定至微红色）。
6、25% H2SO4五、操作取锥形瓶6只，按下表顺序加入试剂：表一过氧化氢酶米氏常数的测定管号试剂0123450.05mol/L H2O2/ml蒸馏水/ml酶液/ml9.50.51.008.500.51.258.250.51.677.830.52.57.00.55.004.500.5先加好0.05mol/L H2O2及蒸馏水，加酶液后立即混合，依次记录各瓶的起始反应时间。
酶工程实验报告六(纤维素酶的固定化及其性质测定)
3、用注射器将上述混合液取20ml（各取四次）逐渐滴入200mlCaCl2溶液的三角瓶中
6、反应混合物物保温30min后，于各个浓度底物试管中加入3mLDNS试剂终止液，迅速振荡均匀。
（1）于游离酶对照中加入0.5 ml的酶液。
（2）于固定化酶对照中加入2.00mLCMC-Na溶液。
7、混合后将各个实验组的三支试管沸水浴5min，自来水冷却后，加蒸馏水19.5mL。摇匀，在540nm处读取OD值。
④精确记时：每一管加入酶液的时间要做记录，每管之间间隔的时间要合理；
⑤避免试管进水：煮沸和用流水冲洗时；
5、实验结果与数据处理：
5.1实验数据与结果：
表一固定化酶（3.5%）与游离酶稳定性的比较
保温时间（min）
吸光度OD540、酶活（u/g）、相对酶活(%)
固定化纤维素酶酶
游离纤维素酶酶
10 0.0375 639.04 33.63 0.0585 7586.50 65.23
②酶稳定性比较：由图三可看出在反应30min以后，游离酶的酶活稳定性保持升高到40min达最大酶活，之后酶活（相对活性）急剧下降（曲线斜率较陡曲）；而固定化纤维素酶的酶活从20min后保持平缓的下降趋势（斜率较缓），即稳定性较高。
③不同浓度的海藻酸钙对固定化酶性质影响：随着海藻酸钙的浓度由：2.5%、3.5%、4.5%、5.5%升高，呈现增后减的趋势，固定化纤维素酶酶活性在3.5%达最大相对酶活性100%。
酶工程实验方案
酶工程实验方案一、实验目的通过本实验，学生将学会利用酶工程实验技术，熟悉酶的生产、纯化和应用过程，培养学生实验操作技能和科学研究能力，为学生今后的科研工作打下良好的基础。
二、实验原理酶工程是利用生物工程学原理和技术手段，对酶进行筛选、改造和工程应用。
酶在生产中扮演着极其重要的角色，它广泛应用于食品、医药、环保、能源、材料等领域。
酶工程实验的关键是酶的生产和纯化技术。
典型的酶工程包括：酶源的筛选、酶基因的克隆与表达、酶的纯化和酶的应用等。
三、实验内容本实验将包括以下内容：1. 酶源的筛选：选择一种具有较高酶活性的微生物菌株，进行培养、鉴定，筛选出所需酶。
2. 酶基因的克隆与表达：通过PCR技术扩增酶基因，将其克隆至适当的表达载体中，然后将其转化至表达宿主中，表达目的蛋白。
3. 酶的纯化：采用离心、柱层析、过滤等方法对表达蛋白进行酶的分离和纯化。
4. 酶的应用：将纯化的酶用于特定的生产或研究中，评价酶的性能。
四、实验步骤1. 酶源的筛选（1）选择合适的微生物菌株，进行培养并获得菌液样品。
（2）采集菌液样品，进行酶活性测试，筛选出具有较高酶活性的菌株。
2. 酶基因的克隆与表达（1）利用PCR技术扩增酶基因。
（2）将扩增出的酶基因克隆至表达载体中。
（3）转化表达载体至适当的表达宿主中，进行表达。
3. 酶的纯化（1）收集表达蛋白，进行细胞破碎，得到目的蛋白混合物。
（2）通过离心、柱层析、过滤等方法对蛋白混合物进行纯化。
4. 酶的应用（1）评价纯化酶的性能。
（2）将纯化的酶用于特定的生产或研究中。
五、实验材料和仪器1. 微生物菌株：待定2. 实验宿主：大肠杆菌等3. 载体：pET等4. 酶活性测试试剂盒5. PCR试剂盒6. 离心机、柱层析仪、过滤器等实验仪器七、实验结果1. 酶源的筛选结果：取得具有较高酶活性的微生物菌株。
2. 酶基因的克隆与表达结果：成功将酶基因克隆至表达载体中，并通过转化实现表达。
3. 酶的纯化结果：得到较纯的酶样品。
酶工程实验报告一
酶工程实验报告一一、实验目的本次酶工程实验的主要目的是通过实际操作，深入了解酶的性质、作用机制以及酶的分离纯化和活性测定方法。
同时，培养我们的实验操作技能、观察分析能力和科学思维方法，为今后从事相关领域的研究和工作打下坚实的基础。
二、实验原理酶是一种具有生物催化功能的蛋白质或 RNA 分子。
它们能够在温和的条件下高效地催化各种化学反应，具有高度的特异性和催化效率。
本实验中所涉及的酶主要是蛋白酶和淀粉酶。
蛋白酶能够水解蛋白质中的肽键，将蛋白质分解为小分子肽和氨基酸。
其活性可以通过测定水解产物的生成量或底物的消耗量来进行评估。
淀粉酶能够水解淀粉分子中的α-1,4 糖苷键，将淀粉分解为麦芽糖和葡萄糖等小分子物质。
其活性通常通过测定淀粉的水解程度来确定，常用的方法是碘量法。
酶的分离纯化是基于酶与杂质在物理化学性质上的差异，如溶解度、分子大小、电荷性质等，采用一系列的分离技术，如沉淀、层析、电泳等，逐步去除杂质，获得高纯度的酶。
三、实验材料与设备1、实验材料蛋白酶提取液淀粉酶提取液酪蛋白淀粉溶液福林酚试剂碘液其他化学试剂2、实验设备离心机分光光度计恒温水浴锅移液器电泳仪层析柱四、实验步骤制备酪蛋白底物溶液：称取一定量的酪蛋白，用氢氧化钠溶液溶解，调节 pH 至适宜值，定容备用。
设定反应体系：在试管中依次加入适量的蛋白酶提取液、酪蛋白底物溶液和缓冲液，混合均匀，置于恒温水浴锅中反应一定时间。
终止反应：反应结束后，加入三氯乙酸溶液终止反应。
测定吸光度：离心去除沉淀，取上清液，加入福林酚试剂显色，在分光光度计上测定吸光度。
计算蛋白酶活性：根据标准曲线计算出反应生成的酪氨酸量，从而计算出蛋白酶的活性。
2、淀粉酶活性的测定制备淀粉溶液：称取一定量的淀粉，用缓冲液溶解，加热糊化，冷却后定容备用。
设定反应体系：在试管中依次加入适量的淀粉酶提取液、淀粉溶液和缓冲液，混合均匀，置于恒温水浴锅中反应一定时间。
终止反应：反应结束后，加入碘液终止反应。
影响酶活性的因素实验报告
一、实验目的1. 探究影响酶活性的主要因素。
2. 分析不同因素对酶活性的影响规律。
3. 掌握酶活性测定的方法。
二、实验原理酶是一种具有催化功能的蛋白质，具有高效性和专一性。
酶活性受多种因素的影响，如温度、pH值、底物浓度、酶浓度等。
本实验主要探究温度、pH值和底物浓度对酶活性的影响。
三、实验材料与仪器1. 材料：淀粉酶、淀粉、蔗糖、葡萄糖、盐酸、氢氧化钠、蒸馏水等。
2. 仪器：恒温水浴锅、移液器、试管、试管架、烧杯、滴定管、酸度计等。
四、实验方法1. 温度对酶活性的影响（1）将淀粉酶溶液分别置于不同温度（如0℃、20℃、40℃、60℃、80℃）的水浴锅中预热。
（2）取等量淀粉溶液，分别加入等量的酶溶液，观察并记录反应时间。
（3）重复实验，计算不同温度下酶的活性。
2. pH值对酶活性的影响（1）将淀粉酶溶液分别用盐酸和氢氧化钠调节至不同pH值（如3、4、5、6、7、8、9、10）。
（2）取等量淀粉溶液，分别加入等量的酶溶液，观察并记录反应时间。
（3）重复实验，计算不同pH值下酶的活性。
3. 底物浓度对酶活性的影响（1）将淀粉酶溶液置于恒温水浴锅中预热。
（2）分别配制不同浓度的淀粉溶液（如0.1g/mL、0.2g/mL、0.4g/mL、0.6g/mL、0.8g/mL、1.0g/mL）。
（3）取等量淀粉溶液，分别加入等量的酶溶液，观察并记录反应时间。
（4）重复实验，计算不同底物浓度下酶的活性。
五、实验结果与分析1. 温度对酶活性的影响实验结果显示，酶活性随温度升高而增加，但在一定范围内（如20℃-60℃）达到最大值后，随温度继续升高而降低。
这表明酶活性受温度的影响，且存在最适温度。
2. pH值对酶活性的影响实验结果显示，酶活性随pH值的变化而变化。
在一定的pH值范围内（如5-7），酶活性较高，而在酸性或碱性条件下，酶活性降低。
这表明酶活性受pH值的影响，且存在最适pH值。
3. 底物浓度对酶活性的影响实验结果显示，酶活性随底物浓度的增加而增加，但在一定范围内（如0.2g/mL-0.8g/mL）达到最大值后，随底物浓度继续增加而降低。
酶工程实验指导
生物工程实验指导（酶工程部分）海南师范大学生命科学学院2010-10实验一 木瓜蛋白酶的分离纯化及酶活检测一、概述以半胱氨酸内肽酶为主（包括木瓜蛋白酶，简称PAP、木瓜蛋白酶Ω， 简称CAR、木瓜凝乳蛋白酶，简称CHP和木瓜凝乳蛋白酶M，简称GEP）的木瓜蛋白酶是从植物番木瓜中分离纯化而得的一种混合酶。
这种酶广泛存在于番木瓜的根、茎、叶和果实内，其中以为成熟的果实乳汁中含量最高，约占乳汁干中的40%。
其最大的用途是在食品工业方面，防除啤酒冷藏混浊，嫩化肉类，生产调味品，烘烤面包，乳酪制品及谷类和速溶食品的蛋白质强化生产。
在动物饲料加工方面，用于鱼蛋白浓缩物和油籽饼处理，能提高氮的可溶性指数和蛋白质的可分散指数。
少量在皮革工业作软化剂、纺织工业作丝织品脱胶清洁剂和废胶卷回收报等。
在医药方面，主要用于治胃炎、消化不良以及用于肉赘摘除、伤痕处理、脱毛、清洁皮肤和新近的裂腭整形外科及制木瓜凝乳蛋白酶注射剂治疗脊骨盘脱出症等。
木瓜蛋白酶是一种巯基蛋白酶，其专一性较差，能分解比胰脏蛋白酶更多的蛋白质。
木瓜蛋白酶是单条链，有211个氨基酸残基组，相对分子量23000。
木瓜凝乳蛋白酶，相对分子量36000，约占可溶性蛋白质的45%。
溶菌酶，相对分子量2500，约占可溶性蛋白质的20%。
木瓜蛋白酶为白色、淡褐色无定型粉末或颗粒。
略溶于水、甘油，不溶于乙醚、乙醇和氯仿。
水溶液无色至淡黄色，有时呈乳白色。
最适pH为5.0～8.0，微吸湿，有硫化氰臭。
最适温度65℃，易变性失活。
木瓜蛋白酶等电点pH＝9.6。
半胱氨酸、硫化物、亚硫酸盐和EDTA是木瓜蛋白酶激活剂，巯基试剂和过氧化氢是木瓜蛋白酶的抑制剂。
二、实验目的1、学习和掌握木瓜蛋白酶分离纯化的原理、方法和工艺过程，包括盐析、酶活力保护、结晶与重结晶。
2、掌握木瓜蛋白酶活力的测定方法和原理。
三、能力培养目标1、蛋白质分离纯化的工艺流程，特别是盐析操作技术的熟练掌握；2、酶活力检测方法的掌握。
《酶工程》课程实验教学大纲
《酶工程》课程实验教学大纲一、实验课程基本情况二、实验课程简介《酶工程》是制药工程的主要内容之一，是现代酶学和生物工程学相互结合而发展起来的一门新的技术学科。
它将酶学、微生物学的基本原理与化工、发酵等工程技术有机结合起来，并随着酶学研究的迅速发展，特别是酶的广泛应用而在国民生产生活中日益发挥着越来越重要的作用。
酶工程实验课是制药工程等本科实验教学的一个重要组成部分，通过实验教学可以加强学生对酶工程基本知识和基本理论的理解，掌握现代酶学与相关技术的有关的基本的实验原理与技能。
在实验过程中要求学生自己动手，分析思考并完成实验报告。
酶工程实验性质有基础性、综合性、设计（创新）性三层次。
三、实验教学目的和基本要求本实验课程主要根据酶工程的三大块内容即酶的生产、酶的改性与酶的应用来设计安排实验，通过这些实验内容，使学生深入理解酶工程课程的基本知识；巩固和加深所学的基本理论；掌握酶工程中基本的操作技能。
同时，通过实验培养学生独立观察、思考和分析问题、解决问题和提出问题的能力，养成实事求是、严肃认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；并在实验中进一步提高学生的科学素养。
四、实验内容与学时分配课堂教学与实验教学结合。
课堂教学合班上课，实验课分小班进行，每4人一组。
实验设计尽量从实际生产中提出问题，增加学生对实际动手操作的兴趣，安排每个人动手。
通过实际操作巩固掌握教材相关理论知识。
六、考核方法实验成绩占课程总成绩的20%。
主要考察学生每次实验的表现：动手操作能力，观察能力，解决问题的能力等。
其次检查实验报告的书写情况是否认真准确。
七、实验内容安排【实验一】淀粉酶动力学分析（4学时）一、实验目的：了解并掌握米氏常数的意义和测定方法。
二、实验要求：掌握米氏常数的意义和测定方法，掌握酶反应的动力学分析方法。
三、实验步骤：1、酶反应：取13支干燥的18×180 mm试管，按下表编号，实验组做两份平行实验，加入pH5.0的淀粉溶液和α-淀粉酶溶液，50℃反应10分钟2、酶反应速度测定：酶反应液稀释一定倍数（约5倍，取1 mL反应液，加4 mL蒸馏水，混匀），取1 mL稀释液加DNS试剂，于沸水浴中加热2 min进行显色，取出后在盛有冷水的500 mL烧杯中冷却（注意换冷水），各加入蒸馏水9.0 mL，摇匀，以空白管为调零点，在540 nm波长测定吸光度值，从标准曲线查出葡萄糖的含量，算出酶反应速度（mol/（L·min））。
酶工程实验大纲
湖北大学酶工程实验（0818800193）实验教学大纲（第2版）生命科学学院生化教研室2014年7月前言课程名称：酶工程实验实验学时：16学时适用专业：生物工程课程性质：必修一、实验课程简介酶工程是生物工程的主要内容之一，是现代酶学和生物工程学相互结合而发展起来的一门新的技术学科。
它将酶学、微生物学的基本原理与化工、发酵等工程技术有机结合起来，并随着酶学研究的迅速发展，特别是酶的广泛应用而在国民生产生活中日益发挥着越来越重要的作用。
酶工程实验课是生物工程等本科实验教学的一个重要组成部分，通过实验教学可以加强学生对酶工程基本知识和基本理论的理解，掌握现代酶学与相关技术的有关的基本的实验原理与技能。
在实验过程中要求学生自己动手，分析思考并完成实验报告。
酶工程实验性质有基础性、综合性、设计（创新）性三层次。
二、课程目的本实验课程主要根据酶工程的三大块内容即酶的生产、酶的改性与酶的应用来设计安排实验，通过这些实验内容，使学生深入理解酶工程课程的基本知识；巩固和加深所学的基本理论；掌握酶工程中基本的操作技能。
同时，通过实验培养学生独立观察、思考和分析问题、解决问题和提出问题的能力，养成实事求是、严肃认真的科学态度，以及敢于创新的开拓精神；并在实验中进一步提高学生的科学素养。
三、考核方式及成绩评定标准考核内容包括实验过程中的操作情况，实验记录及结果的准确性，实验报告的书写及结果分析，思考题的回答情况，仪器设备的使用情况及遵守实验室规章制度的情况等，根据这些方面进行成绩评判和记录，综合给出实验总成绩。
四、实验指导书及主要参考书1．魏群：生物工程技术实验指导，高等教育出版社，2002年8月。
2．禹邦超：酶工程（附实验），华中师范大学出版社，2007年8月五、实验项目实验项目一览表（可选）实验类型：演示性、验证性、综合性、设计性、其它实验一双酶法制备淀粉糖（3课时）一、实验原理目前国内外淀粉糖的生产大都采用双酶法。
酶工程实验指导2010-1
酶工程实验指导伍红秦天莺生命科学与技术学院2010-07实验一碱性磷酸酶的分离纯化一、实验目的掌握酶分离纯化的一般步骤及相关原理，熟悉碱性磷酸酶的分离纯化的方法步骤。
二、实验原理本实验采用有机溶剂沉淀法从肝匀桨中分离纯化碱性磷酸酶(简称AKP)。
先用低浓度醋酸钠(低渗破模作用)制备肝匀浆。
醋酸镁则有保护和稳定AKP 的作用。
匀浆中加入正丁醇可使部分杂蛋白变性，释出膜中酶，过滤后，以去除杂蛋白。
含有AKP 的滤液用冷丙酮和冷乙酸进行重复分离纯化。
根据AKP 在33％的丙酮或30％的乙醇中溶解，而在50％的丙酮或60％的乙酸中不溶解的性质，用冷丙酮和冷乙醇重复分离提取，可从含有AKP 的滤液中获得较为纯净的碱性磷酸酶。
三、仪器、原料与试剂仪器：移液管、量筒、玻璃勺浆器(管)、剪刀、离心机、新华定性滤纸。
原料：新鲜兔肝试剂：1.0.5mol/L 醋酸镁溶液：107.25g 醋酸镁溶于蒸馏水中，定容至1000 m1。
2.0.1mol/L 醋酸钠溶液：8.2g 醋酸钠溶于蒸馏水中，定容至1000 m1。
3.0.0lmol/L 醋酸镁-0.01mol/L 醋酸钠溶液：准确吸取20ml0.5mol/L 醋酸镁溶液及100ml0.14mol/L 醋酸钠溶液，混匀后定容至1000 m1。
4.Tris-HCl pH8.8缓冲液：称取三羟甲基氨基甲烷12.1g，用蒸馏水溶解后定容至1000mL，即为0.1mol/LTrls 溶液。
取100m10.1mol/LTrls 溶液，加蒸馏水约780mL，再加0.1mol/L 醋酸镁溶液100m1，混匀后用1％冰醋酸调pH 为8.8，用蒸馏水定容至l000m1。
5. 正丁醇、丙酮、95％乙醇均为分析纯试剂。
四、实验操作分离纯化碱性磷酸酶的操作流程如下（以下操作均在0-4℃进行）将分离提取的硷性磷酸分装成2ml瓶，冰冻干燥保存或液体保存也可，但值。
均置于-60℃低温冰箱保存。
应用时稀释5—7倍测其Km实验二碱性磷酸酶的动力学鉴定——Km测定一、原理当温度、pH及酶浓度恒定的条件下，酶促反应的初速度随作用物浓度[S]增大而增大，但增大到一定限度时，作用物浓度再增加，则反应速度不再增加。
关于酶工程实验报告
一、实验目的1. 理解酶工程的基本原理和实验方法。
2. 学习酶的制备、纯化和活性测定等实验技术。
3. 掌握酶的催化特性和应用。
二、实验原理酶工程是指利用酶的催化特性，通过基因工程、蛋白质工程等手段，改造或制备具有特定功能的酶，以满足工业、医药、环保等领域的需求。
本实验通过制备、纯化和活性测定等方法，研究酶的催化特性和应用。
三、实验材料与仪器1. 实验材料：酶源（如淀粉酶、蛋白酶等）、底物（如淀粉、蛋白质等）、缓冲液、指示剂等。
2. 实验仪器：离心机、电泳仪、紫外分光光度计、酶标仪等。
四、实验步骤1. 酶的制备（1）酶源培养：将酶源接种于培养基中，在适宜条件下培养，使其大量繁殖。
（2）酶提取：将培养好的酶源进行离心分离，收集上清液。
（3）酶浓缩：采用透析、超滤等方法，去除酶液中的杂质，提高酶的浓度。
2. 酶的纯化（1）离子交换层析：根据酶的等电点，选择合适的离子交换树脂，进行酶的吸附和洗脱。
（2）凝胶过滤层析：根据酶的分子量，选择合适的凝胶过滤柱，对酶进行分离和纯化。
3. 酶的活性测定（1）酶活力单位：采用紫外分光光度法测定酶的活性。
（2）酶催化反应速率：测定酶催化底物反应的速率，计算酶的活力。
4. 酶的催化特性研究（1）温度对酶活性的影响：在不同温度下测定酶的活性，研究温度对酶活性的影响。
（2）pH对酶活性的影响：在不同pH值下测定酶的活性，研究pH对酶活性的影响。
五、实验结果与分析1. 酶的制备通过酶源培养、酶提取和酶浓缩等步骤，成功制备了酶液，酶浓度达到实验要求。
2. 酶的纯化通过离子交换层析和凝胶过滤层析，成功纯化了酶，纯度达到95%以上。
3. 酶的活性测定酶活力单位为：X U/mL；酶催化反应速率为：Y mol/min。
4. 酶的催化特性研究（1）温度对酶活性的影响：在30℃时，酶活性最高，随着温度升高，酶活性逐渐降低。
（2）pH对酶活性的影响：在pH 7.0时，酶活性最高，随着pH值的变化，酶活性逐渐降低。
- 1、下载文档前请自行甄别文档内容的完整性，平台不提供额外的编辑、内容补充、找答案等附加服务。
- 2、"仅部分预览"的文档,不可在线预览部分如存在完整性等问题,可反馈申请退款(可完整预览的文档不适用该条件!)。
- 3、如文档侵犯您的权益，请联系客服反馈,我们会尽快为您处理(人工客服工作时间：9:00-18:30)。
酶工程实验(2010)实验一植物体内过氧化物酶活性的测定一、目的过氧化物酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系，它在代谢中调控IAA水平，并可作为一种活性氧防御物质，消除机体内产生的H2O2的毒害作用。
故在科研上常加以测定。
二、原理在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶竭色4－邻甲氧基苯酚，在470nm 波长处测定生成物的吸光度（A）值，即可求出该酶活性。
三、材料、仪器设备及试剂1. 材料：植物叶片2. 仪器设备：分光光度计；离心机；离心管；研钵；移液管；移液管架；试管；试管架；洗耳球。
3. 试剂及配制：0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH7）。
反应液（100ml 0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH6）中加入0.5ml 愈创木酚、1ml 30﹪H2O2，充分摇匀）。
四、实验步骤1. 酶液提取称取植物叶片1g，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为10ml pH7磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在8000 r / min离心15min，上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。
2. 酶活性测定吸取反应液3ml 于试管中，加入酶提取液0.02ml（视酶活性可增减加入量），迅速摇匀后倒入光径1cm的比色杯中，以未加酶液之反应液为空白对照，在470nm波长处，以时间扫描方式，测定3min内吸光度值变化，取线性变化部分，计算每分钟吸光度变化值（△A470）。
五、酶活性计算按下式计算酶的相对活性△A470 ×酶提取液总量（ml）酶活性（△A470·g－1Fw·min－1）= -------------------样品鲜重（g）×测定时酶液用量（ml）实验二尿液淀粉酶活力测定(Winslow氏法)原理】临床上通常用Winslow氏法测定尿或血清中淀粉酶活力.该法对淀粉酶活性单位的规定是:在37℃,30分钟,恰好能将0,1%淀粉溶液1ml水解(指加入碘液后不再呈蓝色或红色)的酶量定为一个活力单位.试剂和器材】1,0.9%氯化钠2,0.1%淀粉3,碘化钾-碘溶液(20克碘化钾和10克碘溶于100毫升水中,使用前稀释10倍)4,移液管5,试管6,恒温水浴锅操作】1,取10支试管,按次序记上号码,各加0,9%氯化钠1毫升.2,用1毫升移液管加尿液1毫升于第一管,使其与0.9%氯化钠混合(若尿液中淀粉酶过多,应预先将尿液适当稀释).用移液管吸取,然后任其流出.反复三次,使全管混匀.从第一管吸出1毫升到第二管中,混匀.吸出1毫升到第三管......依次类推.到第九管吸出1毫升弃之.这样即可获得分别含有尿液1/2,1/4,1/8......1/5 12毫升的不同浓度的尿稀释液,第10管不加尿液作为对照管.3,将10支试管置冰水浴中,然后从第10管起依次迅速准确加入0.1%淀粉液1毫升.迅速摇匀.立即从冰水中取出,置37℃,并记录时间.注意保持水浴的温度.4,保温30分钟后,取出各管,迅速浸入冰水浴中冷却.然后向各管中加稀碘液2滴摇匀.观察各管的颜色.各试管中出现黄到兰的色序.黄色表明无淀粉存在,浅红色到紫色表明有淀粉的水解中间产物.兰色表明有淀粉或其初期水解产物存在.计算】选择黄色管中尿液稀释倍数最大的一管来计算.假设第5管为黄色(从第6管起仍有红色或兰色).已知第5管内含尿液为1/32毫升.即1/32毫升尿液能在37℃,30分钟水解0.1%淀粉1毫升.所以,1毫升尿液在同样条件下可水解0.1%淀粉32毫升,即每毫升尿液中所含淀粉酶的活性为32个活力单位.实验三超氧物歧化酶活性的测定超氧物歧化酶活性的测定采用硝基四唑蓝还原法测定[21]。
(一)原理超氧物歧化酶（SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。
本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。
而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。
于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。
据此可以计算出酶活性大小。
(二)材料、仪器设备及试剂1. 材料：新鲜苎麻叶片2. 仪器设备：(1) 研钵(预冷)；(2) TGL-16LG台式高速冰冻高速离心机(12 000r/min, 湖南星科科学仪器有限公司)；(3) PUS-2018型半自动生化分析仪(北京普朗新技术有限公司)；(4) 移液管（10ml,5ml,0.5ml,0.2ml各数支）；(5) 日光灯（反应试管处照度为4 000Lx）；(6) 试管数支；(7) 洗耳球。
3. 试剂：(1) 0.2mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）: A.称取磷酸氢二钠7.8005g,溶解后转移到250ml容量瓶中，定容。
B.称取磷酸二氢钠7.098g,溶解后转移到100ml容量瓶中，定容。
C.将磷酸氢二钠溶液倒入烧杯中，用量筒量取23ml后加入同一烧杯中，用pH试纸调节其pH值至7.8；(2) 130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100ml；(3) 750μmol/L 氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；(4) 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721g EDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1 000ml；(5) 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.00753g核黄素用蒸馏水定容至1 000ml避光保存。
(三)实验步骤1. 酶液提取取取被不同浓度NaCl溶液处理过的苎麻叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中。
加1ml预冷的磷酸缓冲液在冰浴上研磨成浆，加缓冲液使终体积为5ml。
取1.5ml于10 000r/min 下离心12min，上清液即为SOD粗提液。
2. 显色反应取试管（要求透明度好）4支，1支为对照管，另3支为测定管，按下列加入各溶液：试剂（酶）用量（ml）终浓度（比色时）0.2mol/L 磷酸缓冲液1.5ml, 130mmol/L Met溶液0.3ml, 750μmol/L NBT溶液0.3ml,100μmol/L EDTA－Na2液0.3ml，20μmol/L 核黄素0.3ml,蒸馏水0.25ml和0.05ml酶提取液，对照管以缓冲液代替酶液;总体积为3.0ml。
各管于4 000Lx日光下反应20min（要求各管受光情况一致，温度高时间缩短，低时延长）。
列表如表1:表1.试剂用量表试剂（酶）用量(ml)终浓度（比色时）0.2mol/L磷酸缓冲液1.5130mmol/L Met溶液0.313mmol750μmol/L NBT溶液0.375μmol100μmol/L EDTA-Na2液0.310μmol20μmol/L核黄素0.32.0μmol酶液0.05空白加缓冲液代替酶液蒸馏水0.25总体积3.03. SOD活性测定与计算至反应结束后，以未加酶液处理的对照管做空白，分别在560nm测定其它各管的吸光度值。
(四)结果计算已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50％为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。
SOD总活性＝(ACK－AE)×V/(ACK×0.5×W ×Vt) 公式(1)式中SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；ACK照光对照管的吸光度,AE样品管的吸光度；V 样品液总体积（ml）；V t测定时样品用量（ml）；W样鲜重（g）。
实验四过氧化氢酶活性的测定过氧化氢酶活力的测定在本次实验中采用高锰酸钾溶液滴定法[21]。
(一)原理过氧化氢酶（CAT）属于血红蛋白酶，含有铁，它能催化过氧化氢分解为水和分子氧，在此过程中起传递电子的作用，过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。
CAT酶活性的大小可用一定时间内分解的H2O2 量来表示.在反应系统中加入一定量（反应过量）的过氧化氢溶液，经酶促反应后，用标准高锰酸钾溶液（在酸性条件下）滴定多余的过氧化氢。
即可求出消耗的H2O2的量：5H2O2 +2KMnO4+4H2SO4→5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4(二)材料、仪器设备及试剂1. 材料：新鲜苎麻叶片2. 仪器设备(1) 研钵；(2) 三角瓶；(3) 酸式滴定管；(4) HH-4数显恒温水浴(30℃)(国华电器有限公司)；(5) 容量瓶(250ml)；(6) 试管数支；(7) AL204电子天平(梅特勒-托得多仪器(上海)有限公司)。
2. 试剂(1) 10%H2SO4（自配）；(2) 0.2 mol/L pH7.8磷酸缓冲液(自配)；(3) 0.1mol/L 高锰酸钾标准液称：取KMnO4 3.160g，用新煮沸冷却蒸馏水配制成1 000ml，再用0.1mol/L 草酸溶液标定；(4) 0.1mol/L H2O2：取30% H2O2溶液5.68ml，稀释至1 000ml，用标准0.1mol/LKMnO4溶液（在酸性条件下）进行标定；(5) 0.1mol/L 草酸：称取优级纯H2C2O4·2H2O12.607g，用蒸馏水溶解后，定容至1 000ml。
(三)实验步骤1. 酶液提取取叶片2.5g(去叶脉)加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量，研磨成匀浆，转移至25ml容量瓶中，用该缓冲液冲洗研钵，并将冲洗液转至容量瓶中，用同一缓冲液定容，10 000r/min离心12min，上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
2. 显色反应取50ml三角瓶4个（两个测定，两个对照），测定加入酶液2.5ml，对照为煮死酶液2.5ml；再加入2.5ml 0.1mol/L H2O2，同时计算时间，于30℃恒温水浴中反应10min，立即加入10%H2SO4 2.5ml。
然后用0.1mol/L KMnO4滴定，至出现粉红色（30秒内不消失）为终点。
(四)结果酶活性用每g鲜重样品10min内分解H2O2的mg数表示：过氧化氢酶活性（H2O2mg/g/min）＝（A －B）×VT/(W×VS×1.7) 公式(2) 式中：A对照KMnO4滴定ml数；B酶反应后KMnO4滴定ml数；VT提取酶液总量（ml）；VS 反应时所用酶液量（ml）；W样品鲜重（g）。