酶工程实验(2010)

酶工程实验(2010)

实验一植物体内过氧化物酶活性的测定

一、目的

过氧化物酶普遍存在于植物组织中，其活性与植物的代谢强度及抗寒、抗病能有一定关系，它在代谢中调控IAA水平，并可作为一种活性氧防御物质，消除机体内产生的H2O2的毒害作用。故在科研上常加以测定。

二、原理

在过氧化氢存在下，过氧化物酶能使愈创木酚氧化，生成茶竭色4－邻甲氧基苯酚，在470nm 波长处测定生成物的吸光度（A）值，即可求出该酶活性。

三、材料、仪器设备及试剂

1. 材料：植物叶片

2. 仪器设备：分光光度计；离心机；离心管；研钵；移液管；移液管架；试管；试管架；洗耳球。

3. 试剂及配制：

0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH7）。

反应液（100ml 0.1mol·L－1磷酸缓冲液（pH6）中加入0.5ml 愈创木酚、1ml 30﹪H2O2，充分摇匀）。

四、实验步骤

1. 酶液提取

称取植物叶片1g，剪碎置于已冷冻过的研钵中，加入少量石英砂，分两次加入总量为10ml pH7磷酸缓冲液，研磨成匀浆后，倒入离心管中，在8000 r / min离心15min，上清液即为粗酶提取液，倒入小试管低温下放置备用。

2. 酶活性测定

吸取反应液3ml 于试管中，加入酶提取液0.02ml（视酶活性可增减加入量），迅速摇匀后倒入光径1cm的比色杯中，以未加酶液之反应液为空白对照，在470nm波长处，以时间扫描方式，测定3min内吸光度值变化，取线性变化部分，计算每分钟吸光度变化值（△A470）。

五、酶活性计算

按下式计算酶的相对活性

△A470 ×酶提取液总量（ml）

酶活性（△A470·g－1Fw·min－1）= -------------------

样品鲜重（g）×测定时酶液用量（ml）

实验二尿液淀粉酶活力测定(Winslow氏法)

原理】

临床上通常用Winslow氏法测定尿或血清中淀粉酶活力.该法对

淀粉酶活性单位的规定是:在37℃,30分钟,恰好能将0,1%淀粉

溶液1ml水解(指加入碘液后不再呈蓝色或红色)的酶量定为一个活

力单位.

试剂和器材】

1,0.9%氯化钠

2,0.1%淀粉

3,碘化钾-碘溶液(20克碘化钾和10克碘溶于100毫升水中,使

用前稀释10倍)

4,移液管

5,试管

6,恒温水浴锅

操作】

1,取10支试管,按次序记上号码,各加0,9%氯化钠1毫升.

2,用1毫升移液管加尿液1毫升于第一管,使其与0.9%氯化钠混合

(若尿液中淀粉酶过多,应预先将尿液适当稀释).用移液管吸取,

然后任其流出.反复三次,使全管混匀.

从第一管吸出1毫升到第二管中,混匀.吸出1毫升到第三管......依

次类推.到第九管吸出1毫升弃之.这样即可获得分别含有尿液1/2,

1/4,1/8......1/5 12毫升的不同浓度的尿稀释液,第10管不加尿液作

为对照管.

3,将10支试管置冰水浴中,然后从第10管起依次迅速准确加入0.1%

淀粉液1毫升.迅速摇匀.立即从冰水中取出,置37℃,并记录时

间.注意保持水浴的温度.

4,保温30分钟后,取出各管,迅速浸入冰水浴中冷却.然后向各管

中加稀碘液2滴摇匀.观察各管的颜色.各试管中出现黄到兰的

色序.黄色表明无淀粉存在,浅红色到紫色表明有淀粉的水解中

间产物.兰色表明有淀粉或其初期水解产物存在.

计算】

选择黄色管中尿液稀释倍数最大的一管来计算.假设第5管为

黄色(从第6管起仍有红色或兰色).已知第5管内含尿液为1/32毫

升.即1/32毫升尿液能在37℃,30分钟水解0.1%淀粉1毫升.所以,

1毫升尿液在同样条件下可水解0.1%淀粉32毫升,即每毫升尿液中

所含淀粉酶的活性为32个活力单位.

实验三超氧物歧化酶活性的测定

超氧物歧化酶活性的测定采用硝基四唑蓝还原法测定[21]。

(一)原理

超氧物歧化酶（SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基的酶。本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。在有氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生O2，可将氮蓝四唑还原为蓝色的甲腙，后者在560nm处有最大吸收。而SOD可清除O2，从而抑制了甲腙的形成。于是光还原反应后，反应液蓝色愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。据此可以计算出酶活性大小。

(二)材料、仪器设备及试剂

1. 材料：新鲜苎麻叶片

2. 仪器设备：

(1) 研钵(预冷)；

(2) TGL-16LG台式高速冰冻高速离心机(12 000r/min, 湖南星科科学仪器有限公司)；(3) PUS-2018型半自动生化分析仪(北京普朗

新技术有限公司)；

(4) 移液管（10ml,5ml,0.5ml,0.2ml各数支）；

(5) 日光灯（反应试管处照度为4 000Lx）；

(6) 试管数支；

(7) 洗耳球。

3. 试剂：

(1) 0.2mol/L 磷酸缓冲液（pH7.8）: A.称取磷酸氢二钠7.8005g,溶解后转移到250ml容量瓶中，定容。B.称取磷酸二氢钠7.098g,溶解后转移到100ml容量瓶中，定容。C.将磷酸氢二钠溶液倒入烧杯中，用量筒量取23ml后加入同一烧杯中，用pH试纸调节其pH值至7.8；

(2) 130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称1.9399g Met用磷酸缓冲液定容至100ml；

(3) 750μmol/L 氮蓝四唑（NBT）溶液：称取0.06133g NBT用磷酸缓冲液定容至100ml，避光保存；

(4) 100μmol/L EDTA－Na2溶液：称取0.03721g EDTA－Na2用磷酸缓冲液定容至1 000ml；(5) 20μmol/L 核黄素溶液：称取0.00753g核黄素用蒸馏水定容至1 000ml避光保存。

(三)实验步骤