穿膜肽的入胞效应 英文文献翻译

穿膜肽的入胞效应摘要：穿膜肽(CPP)在关于如何将高分子转运到细胞内的理论及医药应用方面有着可观的潜力。

现已归入CPP类别的数百种肽序列，HIV-Tat肽、穿膜体、转运体与八精氨酸代表了已被深入研究的几种变体。

为了探究新机理以便提高穿膜效率，膜易位发生过程现在引起了研究者的广泛兴趣。

有证据表明，许多被详尽研究过的肽能通过直接穿越质膜的方式转运它们自身，相对较小的转运物，甚至还可能转运大分子结构，其中可能包含细胞内吞作用通道或多通道的协助。

这些看法着眼于最近的一些发现，如实验草案和显著影响穿膜能力的例子。

其中转运物与入口的连接能够影响入口与细胞的相互作用。

越来越多的证据表明小分子如荧光探针和疏水复合物如脂类、短肽被设计成为肽治疗手段是可行的。

随着研究信息的获取，我们对于CPP与细胞的相互作用的认识与探索能力不断增强，这将加速其从体外实验转入临床应用的进程。

关键词：穿膜肽（CPP），荧光团，光刺激，质膜，肽治疗目录穿膜肽的入胞效应 (1)1CPP分类与介绍 (3)2充分研究的CPPs (5)3相关参数 (6)3.1固定假象 (6)3.2有效肽浓度 (7)4 CPP的膜效应 (7)4.1膜裂解 (7)4.2膜修复反应与其他下游效应 (8)4.3细胞表面糖与CPP的相互作用 (9)5荧光团与其他检测系统 (9)5.1荧光团 (9)5.2 CPP调解转运中的光刺激 (11)5.3 CPP的置换标记 (11)6 CPPs---肽治疗载体 (12)6.1肽货物效应 (12)7疏水性 (13)7.1短疏水序列 (13)7.2色氨酸 (13)7.3脂化 (13)8半胱氨酸和二硫化物桥 (14)9融合延展 (14)10结论 (14)11致谢 (14)12参考文献 (14)1CPP分类与介绍“时间与环境允许的条件下，不要仅仅凭借表面接纳某种观点或徘徊在事物浅层，尤其是对那些与你的专业领域相关的事物，要钻研它深层的奥秘。

”——Issac Watts 文献引证表明，越来越多的研究人员开始尝试利用CPP的穿膜特性向细胞内运输物质。

CPP是一个常用来描述具有穿膜运输能力的由小于30个残疾构成的肽序列名词，PTD（蛋白传导域）是一个可代替这一名词的术语，它的应用反映了早期研究的变体是由蛋白质衍生而来的。

其中HIV-Tat蛋白就是一个非常重要的例子。

它的大量功能都被其传导域调控着，包括内化入细胞、被细胞内吞作用吞入、内逃逸作用、迁移入核与连接RNA作为转录启动子。

区区一个少于二十个残基构成的短肽作为转导结构域能完成这些功能的调控，还能与已知的多达250个结合伴侣相连。

膜迁移启动序列(MTS)是另一种命名方式，但自从2003年被提出至今，这一术语带来了许多困扰。

究竟哪一种定义与相应命名才是最能表述此种多肽序列的呢？这将是接下来很长一段时间的争论点。

而本文中我们按大多数研究惯例，在无特殊声明的情况下将其称为CPP。

但对于某些特殊的多肽类，如昆虫毒液、蜂毒素及在低pH条件下表现跨膜能力的phlip肽，它们是否能被称为CPP这个问题仍待商榷。

此外，抗菌肽也有与CPP类似的物理特性与相似的作用机理。

因此，使用CPP作为术语来表述仍存在许多缺陷，而且相较于其它符合CPP 定义的抗菌肽与膜活性肽的研究，才被探索20年（到2008年）的CPP起步晚了良久。

其中诸多奥秘仍有待进一步发现。

表1. 本综述中所提及的所有多肽图1. 表1中某些多肽疏水性与正电荷含量的关系添加货物肽能显著影响CPP的特性。

例如在R8(23)上添加一段(klaklak)2序列形成R8-PAD(28)，在增加正电荷含量的同时提高其疏水性，而在Tat(22)上添加一段HA2(26)却在减少正电荷含量的同时提高了疏水性。

相反的是在IKKγ(25)与NFKB(27)中之表现了电荷含量的改变。

添加货物肽引起的肽特性改变可能对整体吸收情况都产生了巨大影响。

表1中描述了几百种能被宽泛称为CPP的多肽序列中的一部分，所有表内涵盖的多肽序列都具备将小至荧光探针、大至微粒的货物运入细胞的能力，介于二者大小之间的还有数以千计的生物活性实体，如多肽、蛋白、核酸等有治疗作用的物质可以被运入细胞，或亚细胞隔间。

运输过程中，CPP可与货物以共价方式结合，通过静电力作用发生转运，也可作为结合物，用于病毒、脂质体的应急运输途径。

值得注意的是，CPP不仅可以在货物最初摄入细胞时发挥应急运输作用，还能进一步促进其内逃逸。

大多情况下被运入细胞的物质的作用靶点位于细胞核系统外，因此运入货物的逃逸能力尤为重要，而CPP恰能发挥其影响物质摄入与促进物质逃逸的双重作用。

这种情况下，CPP 运载的货物可能直接经由CPP介导的转运跨过质膜而非通过细胞内吞作用，便能在核外系统观察到或发挥作用。

最近数量相当可观的综述文献对于CPP运输生物活性货物的应用都作了阐述，越来越多证据表明它们也可作为多领域影像采集工具，尤其在肿瘤学领域。

这意味着其可能发展出新用途，不仅如此，CPP运输物资的对象范畴也有望从哺乳动物类扩展至植物、线虫乃至细菌。

图2. CPP与细胞的相互作用及其进入细胞的过程CPPs的内化作用已被证明是由包括胞饮作用、其它能引起细胞内标注作用的内吞途径在内的多种机理促进完成的。

此作用可能以肽与肌动蛋白的结合引起质膜重排为起始，而此种结合作用可能发生在外来肽与质膜结构间，也可能发生在细胞内部。

进入细胞后，CPP的细胞质标识可能是通过胞内逃逸作用或直接迁移完成的。

影响CPPs摄入的外在因素有血清蛋白与膜多糖。

2充分研究的CPPs在众多已知的CPPs中，只有一部分已被深入而广泛的研究，其中包括HIV-Tat肽、穿膜体、转运体、转运体缩短变体TP10，pVec，MAP与精氨酸残疾的重要单元，如最具成效的R8、R9。

这些变体中基础残基非常常见，最为充分研究的一个变体，R8（即八精氨酸），呈明显阳离子型。

寡精氨酸最适宜细胞摄入的比度介于7-9个残基之间，此范围外比度的增减会降低摄入效率。

精氨酸形成bidendate氢键的能力的重要性已被认识到，而最近对HIV-Tat的研究数据表明使肽与质膜联系最大化的肽环化反应能提高迁移的能力。

绝大多数被深入研究过的CPPs都具有显著的阳离子特性，但在非合成的天然体系中，阳离子残基常被疏水残基分隔开。

此种间隔在某些情况下可使CPPs倾向于在水溶液中形成两亲性螺旋。

疏水性对于穿膜能力有非常重要的影响，事实上确实有一些CPPs有明显疏水性，并十分缺少正电荷。

例如PFDYLI肽与卡波济维母细胞生长因子衍生的长序列。

出去常见的阳离子CPPs外，一种被称为SAP(E)的CPP在最近的研究中被发现也具备在一系列细胞株中转运荧光探针的能力。

虽然部分穿膜肽已经得到了详尽细致的研究，但从其与细胞外围的连接究竟基于糖类还是脂类，到其进入细胞的途径是通过内吞作用还是直接跨质膜，关于穿膜肽细胞动力学的研究在方方面面都存在争议。

而另一缺陷则存在于穿膜肽类进入细胞后的研究中，进入细胞后具体发生了什么，细胞又是如何控制到达细胞质乃至细胞核及其它细胞器后的肽的，这一系列胞内过程都还未得到充分研究。

首先，许多病原体或病原体蛋白可以先以细胞内吞的方式进入细胞，然后利用核内体的低pH等条件改变构型，进而与内溶酶体膜融合进入胞液。

基于这一现象的发现，结合较大货物，如蛋白质的CPP也被广泛的认为符合此机理。

但此机理又难以获得确凿证据，因为在胞内逃逸的真实时间测量方面仍存在巨大技术难点。

不过确有证据表明CPP-蛋白变体可进入胞液与细胞核，这一发现基于在细胞装置环境中导入CPP-货物后迁移数小时的读出数据。

然而新的争议也随之产生，既然CPP肽可穿透胞内体膜，那么其也可以穿越质膜。

但与时间测量相似，在此过程中对于穿出质膜与在胞内释放的肽数量之比测量也存在技术难关，尤其当位于细胞上的肽数量本身就少，而即使已经通过内吞作用进入细胞的肽也可能再逃逸入胞液。

其次，内吞作用本身对于CPPs摄入是否起必须作用，若确为必须，何种机理更为常见，CPPs如何逃出核内体（假设其确能逃逸），都是引起争议且难以决断的问题。

最后，虽然细胞生物学领域仍在持续不断的揭示发现新的内吞作用途径，但每条途径的特定探针的鉴别、减弱某一单独途径的方法都是进展十分缓慢的过程，这一不足目前对鉴定CPP 与其它递送药物的载体作用通路都产生了阻滞。

通常情况下，氨基酸序列、作用机理与CPP穿膜能力之间的关系难以被清晰描述，然而文献表明，似乎实验装置环境中的或CPP序列的微笑改变可能对这些CPP实体的细胞动力学性质产生明显影响，这一发现或多或少带来了一些曙光，下文中将就这些产生深刻影响的方面逐一进行阐述。

3相关参数3.1固定假象不得不说当荧光蛋白的高效率入胞及入胞后的核内高浓度聚集被发现是与将细胞固定引入研究方法相关时，整个CPP研究领域都被或多或少的地整动了。

在此发现之前，学术领域倾重于接受细胞的摄入是一个不消耗能量、不依赖于细胞内吞作用的过程。

而应用固定方法后的结果中，细胞内吞作用体现了重要作用，胞质中的肽也是由内吞或穿出胞质膜的方式初始进入细胞内的。

这些实验中细胞并没有像原来那样在显微镜检或是流式细胞分析前先被固定，而且在通过流式细胞分析仪时细胞经历了肝素冲洗以及胰蛋白酶分散，来确保进入细胞的肽数量测定更为准确。

这一操作对于阳离子型变体更为重要。

虽然细胞膜上某些镶嵌肽段可能对胰蛋白酶存在抗性，如D型肽段存在时细胞膜不能被胰蛋白酶裂解，但此项技术仍已凭借突出优点成为了本领域一项规范技术。

3.2有效肽浓度本实验可在含有血清的，加入1~100μM浓度已合成荧光团的CPP肽段的原细胞培养基中进行。

当CPP阳离子变体被加入实验环境后，其能非特异性地与距离最近的负电荷如血清蛋白中的白蛋白结合，结合后产生的CPP降低了细胞对其摄入效率，因为实质上其减少了有细胞结合活性的游离肽数量。

但对于在受体介导的胞吞作用中被内化或存在于胞饮液相中的蛋白结合的肽段而言，此种结合也是入胞机理的一种。

载体或被运载物二者中任一或二者皆对蛋白酶或核酸酶敏感时，评估其被摄入能力的介质中应剔除血清，以便创造使该转运系统完整地到达细胞表面的机会。

事实上CPPs即存在对酶降解不同程度的敏感性，因此在体外实验中常用无血清技术。

反之某些CPP将以惊人速度降解，例如MAP与穿膜件在接种入细胞培养基30分钟后即仅存在25%完整的未被降解的活性肽，而二者在CHO细胞的对比实验中被降解的更加迅速，前者半衰期为10min，而后者仅为5min。

然而，加入牛血清白蛋白后情况发生了改变，MAP降解减慢，但穿膜体仍在以相同速度被降解。

CPP摄入速度与肽浓度有关外，还与肽和细胞的比例相关。

4 CPP的膜效应4.1膜裂解现存一种被广泛接受的说法指出，在特定的实验条件下一些CPP可以直接穿透细胞的质膜。