呼吸道联检操作规程 -SOP

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________________医院检验科_____室（SOP）文件

撰写人：

审核人：

批准人：

批准日期：2007年7月31日

启用日期：2007年8月 1 日

二零零七年七月一日制

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批准页

根据《临床检验操作规程》(2006年,第三版)，化学放光仪（Anthos lucy）, 洗板机（Anthos fluido）使用说明书；免疫检验有关试剂盒、质控品的使用操作说明书；《消毒技术规范》以及医院内部有关管理制度、生物安全制度的规定和要求，临床免疫检验操作规程文件NO.2版经实际运行，现予以批准通过，于 2007年 8月 1日起生效并开始实施。免疫室和检验科有关工作人员必须认真学习，严格遵照执行。（NO.2版依据检验技术和我科工作发展及管理工作的需求进行的补充完善和改进另行通知）。任何个人不得更改，实际工作中如发现不妥之处，请按程序以文字形式向审核人汇报；在未经批准人同意/批准新文件之前，仍执行此文。

_____________医院检验科

2007年7月31日

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呼吸道九联检操作规程

1.项目中文名称：九项呼吸道感染病原体IgM抗体检测（间接免疫荧光法）

项目英文名称：PNEUMOSLIDE IgM

2.实验原理与方法：

2.1 原理：间接免疫荧光法（IFA）是基于待测样本中的抗体与吸附在载玻片上的抗原发生的反应。样本中存在的特异性抗体和抗原反应，未与抗原结合的免疫球蛋白在洗涤步骤中除去。在下一步骤中，抗原-抗体复合物与荧光素标记的抗人球蛋白反应。用免疫荧光显微镜观察结果。

2.2 方法：间接免疫荧光法

3.设备性能参数：

4.标本的要求：

需由专业人员无菌静脉穿刺采集血液。使用消毒或无菌技术能保持样本的完整性。血清样本采集后如不在8小时内检测应2~8 ºC冷藏，如7天内不检测，则应冷冻（-20ºC）保存。不要反复冻融以防止免疫球蛋白滴度降低，特别是IgM。不要使用高血脂或污染的血清。若样本中含有微粒要离心使之澄清。

4.仪器：荧光显微镜

5.试剂厂家及名称：西班牙VIRCELL公司

6.操作步骤：

1. 使用前，将所有试剂平衡至室温。载玻片平衡至室温后再打开。

2. 样本的稀释：按1:1比例稀释血清样本，即25µL血清加入25µL PBS2中。阴阳性对照34不需要稀释。

3. 用抗人IgG吸附剂7处理稀释后的血清：将30µL稀释后的血清加入150µL吸附剂中，彻底混匀。阴阳性对照3和4不需吸附剂处理。处理后的血清要离心10-15分钟除去沉淀，以防干扰检测。

4. 在载玻片1的每孔中加15µL吸附剂处理过的血清（一份样本对应一个载玻片）。在一个载玻片的每孔中加入15µL不稀释的阳性对照3，在另一个载玻片的每孔中加入15µL不稀释的阴性对照4。

5. 将载玻片放入湿盒中，37℃温育90分钟。

6. 用PBS 2的缓慢水流冲洗载玻片1（避免直接冲入孔内）后，浸泡在PBS中并放置在水平摇床上轻轻摇动10分钟。再用蒸馏水缓慢水流冲洗（避免直接冲入孔内）。

7. 载玻片1自然晾干。

8. 每孔加入15µL抗人IgM FITC结合物溶液5M（不需稀释）。

9. 将载玻片放入湿盒，37℃温育30分钟。

10. 重复6和7的洗涤步骤。

11. 加几小滴封闭介质6，小心盖上盖玻片。

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12. 尽快用荧光显微镜在400倍放大率下观察结果。如果不能立即观察，可将其避光放置于2-8ºC 不超过24小时。

* 简明操作程序（将风干改成晾干）

7. 有效性判断

每一次试验都应设立阳性和阴性对照，以确认试验和试剂盒的有效性。观察到的荧光模式应为：

阳性对照：腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性质控的1-15%细胞出现苹果绿细胞核、胞浆或胞膜荧光（在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同时观察到着色的合胞）；军团菌、衣原体或立克次体中所有的细菌呈现出苹果绿荧光；支原体对阳性质控在细胞外围呈现苹果绿色荧光。

阴性对照：军团菌、肺炎衣原体和立克次体无荧光，支原体、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的细胞呈现红色。

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8.样本结果判断

阳性结果：可以观察到腺病毒、流感病毒、呼吸道合胞病毒或副流感病毒对阳性血清的1-15%细胞的细胞核、胞浆或胞膜出现苹果绿色荧光（在副流感病毒和呼吸道合胞病毒中能同时观察到着色的合胞）；军团菌、衣原体或立克次体中所有的细菌呈现出苹果绿色荧光；支原体对阳性血清在细胞外围呈现苹果绿色荧光。

阴性结果：可观察到军团菌、肺炎衣原体和立克次体无荧光，支原体、腺病毒、甲型和乙型流感病毒、呼吸道合胞病毒和副流感病毒的细胞呈现红色。

9.检验结果的解释

1.每一批产品在放行前都要经过更加严格的内部质量控制（Q.C.）的检验。质控品可溯源到经

过内部确认的参考血清盘。

2. 如果所有细胞或第10孔出现荧光表明存在抗核或抗细胞抗体，不能判为阳性，应用其他方法

进行检测。当质控孔中无荧光时一定要查明病因。

3. 由于非军团菌感染的病人中经常出现交叉抗体，军团菌阳性结果需结合临床症状综合评价。

建议做较高稀释度的检测来提高阳性预测值。

4. 与说明书中所列结果不同不能判为阳性。

5. 在初次感染和再次感染的过程中，IgG和IgM抗体有不同的表现方式：初次感染时，几乎在

所有的情况下IgM和IgG均出现（IgM早于IgG出现）；而再次感染时可能不出现IgM，因此IgG的检测是唯一有用的诊断方法。在许多疾病中病人的一生都可能存在高滴度的IgG，而IgM 一般情况下仅在感染后2—3个月存在于血清中，因此是近期感染的一个有效标志物。

6. 九种病原体IgM抗体阴性及阳性结果的荧光染色图谱：

阳性结果图谱：

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