两种生物反应器高密度培养小球藻研究

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２试验方法 ２．１纯化与培养
将冷藏的藻种接种至新鲜液体培养基，控制温度２５±扰．
光照３ ５００ ｌｘ．湿度８５±２％，每日摇瓶３次。固体平板纯化．琼 脂量７ ｇ／Ｌ，将纯化并扩培的液体藻液分别上罐至气升式发酵 罐、机械搅拌式发酵罐中进行批量培养。分别调整充气量为 ８０ ｌ＿／ｈ、转速为１００ ｒ／ｍｉｎ．控制温度３０℃。
海市文化西路１８０号山ｒｌ－，大学威海分校海洋学院，副教授，Ｅ－ｍａｉｌ：ｚｈａｎｇｘｋ＠ｓｄｕ．ｅｄｕ．ｃｎ
５６科技导万报方２０数０８据。２６（２３）
中溶解的可利用的ＣＯ：（０．０４ ｍｏ］ＪＬ）远不能满足小球藻生长 的需要。因此大规模培养中营养盐的流加是提高产量的有效 途径。
１材料和设备 １．１ 材料
种生物反应器对小球藻进行培养。初步比较了流加培养方式应用在两种生物反应器的效果。通过流加高浓度培养基得到细胞总数
１．９８８×１０７／ｍＬ，最大细胞干重２９．９４４叽。结果表明，在机械搅拌式生物反应器中流加培养基能够获得最大生长量。
关■调小球藻；自养；异养；生物反应器
中圈分类号Ｑ９３＿３３５
文ｔ标识码Ａ
两种生物反应器高密度培养小球藻研究
邢翔，张小葵，杜宗军，赵丽华
山东大学威海分校海洋学院．山东威海２６４２０９
擅耍小球藻在水产、环保、医疗和重要生命活性物质生产等众多领域的研究与应用得到不断深入。如何高效培养出高密度小球藻以
满足各个应用领域的需要是亟待解决的难题。试验探索了利用生物反应器高密度异养培养小球藻的方法。利用气升式、机械搅拌式两
０ １６ ２３ ４０ ４７ ５２ ６４ ７０ ７６ ８２ ８８ ９４ 培养时间，Ｉｌ
图１不同培养方式下的小球藻生长曲线 Ｆｉｇ．１ Ｇｒｏｗｔｈ ｃｕｒｖｅｓ ｏｆ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．
．ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ
细胞总数与细胞干重的生长曲线基本趋势一致。但是细 胞总数的增长同干重的增长不是同步进行的。其原因是，细 胞在分裂前期吸收大量的有机营养物质．复制ＤＮＡ及合成 蛋白质，这个时期细胞的重量会有大幅度地增加．而细胞数 量却没有什么变化。最后细胞进行分裂增殖，细胞数量成倍 增长，而细胞的总重量增加很少。 ３．２ ＤＨ值变化
万方数据
科技导报２００８。２６（２３）５７
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培养时间／ｈ
Ｆｉｇ．２
图２不同培养方式下的小球藻ｐＨ值变化 Ｃｕｒｖｅ ｏｆ ｐＨ ｏｆ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ
表１不同培养方式小球藻的生长特性 Ｔａｂｌｅ １ Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎ ｏｆ ｇｒｏｗｔｈ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓ ｏｆ
小球藻作为一种重要的微藻资源，具有极其丰富的营养 成分和优良的医疗保健作用。其蛋白质含量５０％～６７％，其中 含有人体所必须的２０种氨基酸、多种维生素和微量元素，以 及亚麻酸、亚油酸、胡萝卜素等成分。小球藻含有的二十碳五 烯酸（ＥＰＡ）和二十二碳六烯酸（ＤＨＡ），医学临床已经证明这 两种成分具有多种霞要的生理功能Ｉ”。其次．小球藻中含有的 多糖和蛋白具有显著的抑瘤抗癌、增强免疫及抗病毒感染的 活性［２１。在水产养殖上，单细胞的小球藻可直接作为草食性鱼 类和鱼苗的饵料，或者作为肉食性鱼类仔鱼开Ｅｌ期食用的丰 年虫等动物的饵料。此外．小球藻在其生长时能消耗掉污水 水体中的部分氮、磷，从而达到改善水质的目的，具有很高的 经济价值Ｉ划。
高浓度培养基流加培养．配制５倍于正常浓度的浓缩培 养基１ Ｌ，在培养至７２ ｈ时流加，每６ ｈ流加２５０ ｍＬ，流量为 ８．３３ ｍＬ／ｒａｉｎ。 ２．２取样与测定
每日取样３￣４次，即时测定数目和称重。 细胞数目的测定：血球计数板计数，每实验组计数３次， 取其平均值。 细胞干重的测定：取５ ｍＬ培养液离心沉淀（４ ０００ ｒ／ｍｉｎ， ３０ ｍｉｎ），８００Ｃ烘干至恒重。分析天平称重。 ｐＨ值：机载ｐＨ电极，计算机自动记录。
本试验探索了气升式、机械搅拌式两种异养培养方式， 初探了流加培养在小球藻异养高密度培养上的应用。结果表 明．机械搅拌式异养培养小球藻具有较好的培养结果，在葡 萄糖浓度与刘世名等…Ｉ相同研究条件下，可得到６．２７ｘ１０７ｍＬ 的细胞数目，藻细胞干重可达２３．６４７ ｇ／Ｌ。小球藻的生长速率 与其相近。由于批量培养中小球藻得到充分的碳、氮源的补 料，存在培养初期营养物质浓度高而抑制藻类生长，而培养 后期营养物质缺乏限制藻类生长的缺点。本研究初步探讨了 高浓度培养基流加培养方式，在相同流加条件下。机械搅拌 式最大细胞数目达到１．９８８ｘ１０７／ｍＬ，最大干重２９．９４４ ｇｅＬ。
岣科ｗＯ哺ｃｈｌｏｒｅｌｌａ；ａｕｔｏｔｒｏｐｉｃａ；ｈｅｔｅｒｏｔｒｏｐｈｉｃ；ｂｉｏｒｅａｃｔｏｒ
０ 引言 小球藻（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．）是一类普生性单细胞绿藻，属于绿
藻门（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｔ口），绿藻纲（Ｃｈｌｏｒｏｐｈｙｃｅａｅ），绿藻目（Ｃｈｌｏｒｏ— ｃｏｃｃｆ以ｅｓ），卵囊藻科（Ｏｃｙｓｔａｃｅａｅ），小球藻属（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ）。
Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｗｉｔｈ ｄｉｆｆｅｒｅｎｔ ｍｅｔｈｏｄｓ
４讨论与结论 微藻是具有蘑要经济价值的生物资源。自１９５３年Ｌｅｗｉｎ
等１１０ｌ首先发现了某些种类能利用有机物作为唯一碳源和能源 进行异养生长以来，受到科学界广泛重视。而生物反应器高 密度培养是近年的研究热点。探索利用发酵工程的方法大规 模的生产微藻产品可以为微藻内含物、生长机理的研究提供 基础平台。异养培养小球藻可以克服光自养培养的诸多缺 陷。是提高小球ｕ，ＰＩｌ Ｈａｎｌｉｎ，Ｈｏｎｇ Ａｎ，ｅｔ ａＬ Ａｃｔａ Ｎｕｔｒｉｍｅｎｍ Ｓｉｎｉｃａ，２００４。２６ （２）：１３６－１３９． 【３】缪晓玲，吴庆余：微藻生物质可再生能源的开发利用叨．可再生能源， ２００３（３）：１３－１６． Ｍｉａｏ Ｘｉａｏｌｉｎｇ。Ｗｕ Ｑｉｎｇｙｕ．Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ Ｅｎｅｒｇｙ，２００３（３）：１３－１６． 【４１缪晓玲，吴庆余．藻类异养转化制备生物油燃料技术【Ｊ】．可再生能源， ２００４（４）：４１—¨． Ｍｉａｏ Ｘｉａｏｌｉｎｇ．Ｗｕ Ｑｉｎｇｙｕ．Ｒｅｎｅｗａｂｌｅ Ｅｎｅｒｇｙ，２００４（４）：４ｌ—¨． 【５】沈颂东．氮索对小球藻生长的影响【Ｊ１．水利渔业，２００３。２３（２）：５５－５７．
分别对气升式培养方式及机械搅拌式培养进行培养基 的流加，比较细胞数量及干重．发现小球藻在机械搅拌式发 酵罐中的生长数日最大可达１．９８８ｘ１０７／ｍＬ．较批量培养有极 大提高，ｐＨ值一直保持８．０（表１）。
培养基碳源、氮源等基本耗尽后．小球藻生长停滞。细胞 开始自溶，藻群数量及细胞干重都会呈现下降趋势。此时流 加培养基，会使藻继续分裂增殖。培养结束时，藻液呈浓绿 色，粘稠状，细胞干重达２９．９４４ ｇ／Ｌ。
目前小球藻的培养方式包括密闭无菌培养法、开放半无 菌培养法、开放藻菌混养法等１７１。本文探索一种利用大容量生 物反应器高密度培养小球藻的方法。据相关研究．小球藻通 过光合作用积累ｌ ｍｇ干物质需要ｌ ｔｏｏｌ Ｃ０２（１．８ ｍｇ）Ｅ目，而水
收稿日期１ ２００８－－０９－０３ 作者简介：邢翔．山东省威海市文化西路１８０号山东大学威海分校海洋学院．助理实验师，Ｅ－ｍａｉｌ：ｘｉｎｇｘｉａｎｇ＠ｓｄｕ．ｅｄｕ．ｃｎ；张小葵（通信作者）。山东省成
异养条件下，小球藻细胞内油脂含量可达６０％以上．是 一种新型油脂资源１３５１。在高盐条件下培养，小球藻中的脯氨酸 含量可达１２％，可用于工业制取脯氨酸。小球藻的叶绿素含 量约４％，是天然叶绿素的理想资源１６１。
有研究表明，小球藻在只有无机盐、部分维生索以及光合 作用的条件下就能正常生长，且光合效率高．但是无机营养 盐培育的小球藻，由于营养盐迅速消耗以及各种影响因素的 干扰，在生产中极不稳定研。近年来对小球藻异养的研究越来 越受到关注，当在培养液或培养基中含有葡萄糖等有机碳源 时，小球藻的营养方式可以由自养转变为异养。这种高密度 培养方式可以使小球藻的生长速度大为加快，细胞密度大幅 度提高．不受光限制。
小球藻（Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．）：取自山东大学威海分校微生物综 合实验室菌种库。 １．２培养基
小球藻培养基用舵改良培养基１９１，葡萄糖（１０ ｒ／Ｌ）作为 小球藻异养碳源。 １．３仪器设备
７ Ｌ气升式发酵罐（上海保兴生物设备Ｔ．程公司，７ＱＳ）， ７ Ｌ机械搅拌式发酵罐（镇江东方生物丁程设备技术公司。 ＧＢＪＬ一７Ｃ），分析天平（德国塞多利斯公司，ＡＬＣｌｌ０．４），ｐＨ电 极（瑞士Ｈａｍｉｌｔｏｎ公司）。
３结果与分析 ３．１生长量变化
在黑暗条件下．机械搅拌式培养生长速率明显高于气升 式培养，细胞总数及干重的积累也略高于气升式培养（图１）。 小球藻经过约１６ ｈ的适应调整后，迅速进入对数生长期。整个 生长过程生物量变化明显，最大细胞总数达到６．２７ｘ１０７／ｍＬ，细 胞干重２３．６４７ ｇ，Ｌ。约４５ ｈ进入衰亡期。气升式培养进入稳定 期时藻液颜色呈碧绿色．所得小球藻生长曲线的Ｓ形不明 显．延迟期长，约４０ ｈ后进入对数生长期，最大细胞总数５．３× １０７／ｍＬ，细胞干重１２．３４ ｇ／Ｌ。８２ ｈ后进入稳定期。进入稳定期 时藻液颜色呈黄绿色。
Ａｂ出嘲弛ｅ ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ Ｃｈｌｏｒｅｌｌａ ｓｐ．ｉｎ ｍａｎｙ
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