大肠杆菌热击感受态细胞的制备、注意事项和转化
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由互补产生的β －半乳糖苷酶(LacZ)能够作 用于生色底物5－溴－4－氯－3－吲哚－β －D－ 半乳糖苷(X-gal)而产生蓝色的菌落，所以利用这 个特点，在载体的该基因编码序列之间人工放入 一个多克隆位点，当插入一个外源DNA片段时，会 造成LacZ(β －半乳糖苷酶)基因的失活，破坏α -
步骤需在超净工作台和冰上操作；
4 ．吸取1.5ml培养好的菌液至1.5ml离心管
中，在冰上冷却10分钟；
5 ．4℃下3000 g冷冻离心5分钟；
6 ．弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2
溶液，用移液枪轻轻上下吸动混匀，使细
胞重新悬浮，在冰放置20分钟；
7 ． 4℃下3000 g冷冻离心5分钟； 8 ．弃去上清，加入100l预冷0.1M CaCl2溶液， 用移液枪轻轻上下吸动混匀，使细胞重新悬浮； 9 ．细胞悬浮液可立即用于转化实验或添加冷冻保 护剂（15% - 20%甘油）后超低温冷冻贮存 备用（－80℃）。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
• 实验原理
• 实验仪器 • 实验试剂
• 实验步骤 • 注意事项
实验原理
进行基因克隆时，体外连接的重组DNA分
子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、 增殖和表达。 感受态细胞(Competent cells):受体细胞经过一 些特殊方法（如：CaCl2等化学试剂法）的处理后， 细胞膜的通透性发生变化，成为能容许多有外源 DNA的载体分子通过的感受态细胞。
电转化法制备大肠杆菌感受态细胞 实验步骤
1．前夜接种受体菌（DH5或DH10B）， 挑取单菌落于LB培养基中37℃摇床培 养过夜； 2．取2ml过夜培养物转接于200ml LB 培养基中，在37℃摇床上剧烈振荡培养
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化1. 引言大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和工业生产中。
其中，大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程领域中的重要技术，对于基因工程、药物研发等方面具有广泛的应用价值。
2. 大肠杆菌感受态细胞的制备大肠杆菌感受态细胞的制备是通过基因工程手段将目标基因（外源基因）导入大肠杆菌细胞内，使其表达目标蛋白或产生目标产物。
通常情况下，制备大肠杆菌感受态细胞需要进行以下步骤：2.1 培养基的选择在进行大肠杆菌感受态细胞的制备过程中，需要选择适合的培养基。
常用的培养基包括LB培养基、SOB培养基等，这些培养基中含有适量的氨基酸、碳源等，能够满足大肠杆菌细胞的生长需求。
2.2 载体的构建在进行大肠杆菌感受态细胞的制备时，需要将目标基因导入大肠杆菌细胞内。
这一过程中，通常需要将目标基因插入至载体（如质粒）中，构建重组质粒。
2.3 转化大肠杆菌细胞转化是将重组质粒导入大肠杆菌细胞内的过程。
常用的转化方法包括热激转化、电穿孔法等。
通过这些方法，可以将构建好的重组质粒导入大肠杆菌细胞内。
3. 大肠杆菌感受态细胞的转化大肠杆菌感受态细胞的转化是基因工程中的一个重要步骤，该技术可以使外源DNA片段导入并稳定集成到大肠杆菌的染色体内。
3.1 转化方法大肠杆菌感受态细胞的转化有多种方法，如热激转化法、化学转化法和电穿孔法等。
这些方法都是通过改变细菌细胞膜通透性，使外源DNA片段能够进入细胞内。
3.2 转化效率的影响因素影响大肠杆菌感受态细胞转化效率的因素很多，包括DNA片段的长度、外源DNA的纯度、细胞复活时间、转化温度等。
在进行大肠杆菌感受态细胞的转化时，需要考虑这些因素，以提高转化效率。
4. 个人观点和理解大肠杆菌感受态细胞的制备与转化是生物工程中的重要技术，对于基因工程、蛋白表达等方面具有重要意义。
通过对该技术的深入了解和实践，可提高对基因工程的理解与实践能力。
实验5：大肠杆菌感受态细胞的制备和质粒DNA转化报告
感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态 细胞总数
五、注意事项
1、冰上操作； 2、无菌操作； 3、重悬细胞时操作要轻； 4、实验应设有阳性对照，以估计转化效率；
应设立阴性对照，以消除可能的污染及查 明可能的失败原因。
实验四 大肠杆菌感受
态细胞的制备和质粒 DNA转化
实验目的和要求
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态 细胞；
学习用热激法将外源基因导入感受 态细胞。
实验原理 实验材料 实验步骤 预期结果 注意事项
一、实验原理（CaCl2法、热激法）
1、几个概念
转化( Transformation )是将异源 DNA 分子引入另 一细胞品系，使受体细胞获得新的遗传性状的一种 手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研 究的基本实验技术。
(一) 纯化及活化菌种（无抗生素的LB ）
单菌落
l mL培养液
冻存菌在新鲜LB
平板上，划线， 37℃培养16~20 h。
挑一单菌落接种到3 mL LB液体培养基 中，37℃培养过夜
取l mL培养液加到 100 mL LB液体培养 基中，37℃摇床培养 2~3 h ，当其OD600 为0.3～0.5时(细胞数 <108/mL)，立即取出， 冰浴10～15 min。
(二) CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞
l、将菌液转移到两个冰冷离心管中，平衡 后于4℃，5000 r/min离心10 min，弃尽上 清(可用加样器将残余液体尽量去净)。— —收集沉淀
2、各加10 mL 0.1 mol/L冰冷的无菌CaCl2溶 液重悬细胞，于冰上放置15 min．于4℃， 5000 r/min离心10min，弃上清。 —— CaCl2洗涤细胞转化效率的因素
大肠杆菌感受态细胞的制备原理步骤以及重组质粒转化
大肠杆菌感受态细胞的制备原理步骤以及重组质粒转化一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA 分子能进入细胞。
证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E?coli K――12X1 776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
实验大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
。
感受态细胞 质粒DNA
蒸馏水
转化体系 100ul
1ul
空白对照 100ul
1ul
实验步骤
2、轻轻混匀，立即放在冰上30min； 3、42℃水浴90s，然后迅速冰浴1-2min； 4、加入0.8ml LB液体培养基，160r/min，37 ℃培养
40min； 5、稀释后，取培养液100ul，涂布于具有50ug/ml
制备感受态旳细胞一般选择对数生长久，新鲜幼嫩旳 细胞是制备感受态细胞和进行成功转化旳关键。常用旳感 受态制备措施涉及KCl、CaCl2等措施；后者因为操作简便 且符合大多数旳分子克隆要求，因而被广泛采用。
实验原理
CaCl2 法旳基本原理： 细菌处于低温（0℃）和低渗旳CaCl2溶液
中，菌体膨胀，细胞膜旳通透性发生了临时性 旳变化，转化混合物中旳DNA形成抗DNase旳 羟基-钙磷酸复合物黏附于菌体表面，在42℃ 进行短时间旳热激处理，增进DNA旳吸收。
实验原理
2、质粒旳质量和浓度：用于转化旳质粒DNA应主要 是超螺旋态DNA。转化效率与外源DNA旳浓度在一 定范围内成正比，但当加入旳外源DNA旳量过多或 体积过大时，转化效率就会降低。
1ng旳超螺旋态DNA即可使50μl 旳感受态细胞到 达饱和。一般情况下，DNA溶液旳体积不应超出感 受态细胞体积旳5％。
实验原理
CaCl2 法简便易行，用 CaCl2法制备旳 感受态细胞，可使每微克超螺旋质粒 DNA 产生5106-2107个转化菌落。在实际工作 中，每微克有105以上旳转化菌落足以满足 一般旳克隆试验。
制备出旳感受态细胞临时不用时，加入 占总体积15％旳无菌甘油于-70℃，能够保 存六个月。
实验原理
实验大肠杆菌感受态 细胞的制备和转化
大肠杆菌热击感受态细胞的制备（CaCl2）及转化方法
大肠杆菌热击感受态细胞的制备（CaCl2）及转化方法大肠杆菌热击感受态细胞的制备（CaCl2法）及转化方法感受态细胞的制备：方案一：1）从固体培养基中挑取单菌落接种于5 mL 的LB培养基中，37 ℃，200 r/min过夜活化8-10 h；2）活化的菌液按照1%转接到50 mL LB培养基中，37 ℃，200 r/min培养至OD600nm=0.4~0.6；3）4000 r/min，4℃低温收集菌体10min，轻柔弃上清；4）25 mL 0.1 M预冷的CaCl2悬浮细胞，冰浴30 min；5）4000 r/min，4℃低温收集菌体10min，轻柔弃上清；6）1mL 0.1 M预冷的CaCl2悬浮细胞，加1 mL预冷的50%甘油混匀，分装成每管（预冷的EP 管）100 μL，-70 ℃冻存备用；（3-6步骤均在冰上操作）方案二：1）从固体培养基中挑取单菌落接种于5 mL 的LB培养基中，37 ℃，200 r/min过夜活化8-10 h；2）活化的菌液按照1%转接到50 mL LB培养基中，37 ℃，200 r/min培养至OD600nm=0.4~0.6；3）将培养物连至锥形瓶至于冰上冰浴30min;4）4000 r/min，4℃低温收集菌体10min，轻柔弃上清；5）25 mL 0.1 M预冷的CaCl2悬浮细胞，4000 r/min，4℃低温收集菌体10min，轻柔弃上清；6）1mL 0.1 M预冷的CaCl2悬浮细胞，加1 mL预冷的50%甘油混匀，分装成每管（预冷的EP 管）100 μL，-70 ℃冻存备用；（3-6步骤均在冰上操作）热击转化步骤：1）在制备好的感受态细胞100 μL中，加入10 μl连接产物或1μl 质粒（依照质粒浓度而定）混匀，冰上放置30 min；2) 42 ℃温浴90 s（或者45℃温浴45 s）后迅速置入冰上1 min，加入800 μL LB培养基，37 ℃，180 r/min培养45min-1 h；3) 将孵化好的菌液涂布在相应的抗性平板上倒置，37 ℃培养过夜，PCR鉴定阳性转化子。
大肠杆菌感受态细胞得制备原理、步骤以及重组质粒转化
一、目得1、了解感受态细胞生理特性及制备条件,掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2、掌握质粒DNA 转化大肠杆菌得方法,了解转化得条件与利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 得原理。
二、原理(一)大肠杆菌感受态细胞制备得原理所谓感受态,就是指细菌生长过程中得某一阶段得培养物,只有某一生长阶段中得细菌才能作为转化得受体,能接受外源DNA而不将其降解得生理状态。
感受态形成后,细胞生理状态会发生改变,出现各种蛋白质与酶,负责供体DNA 得结合与加工等。
细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来得DNA 分子得受体位点等。
本实验为了把外源DNA(重组质粒)引入大肠杆菌,就必须先制备能吸收外来DNA分子得感受态细胞。
在细菌中,能发生感受态细胞就是占极少数。
而且,细菌得感受态就是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子得本质瞧法不一。
主要有两种假说:1、局部原生质体化假说――细胞表面得细胞壁结构发生变化,即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁,使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有:(1)发芽得芽孢杆菌容易转化;(2)大肠杆菌得原生质体不能被噬菌体感染,却能受噬菌体DNA 转化;(3)适量得溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞得表面形成一种能接受DNA 得酶位点,使DNA分子能进入细胞。
证据就是:(1)蛋白质合成得抑制剂如氯霉素,可以抑制转化作用;(2)细胞分裂过程中,一直有局部原生质化,但感受态只在生长对数期得中早期出现;(3)分离到感受态因子,能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞得转化理论尚未有统一结论,但就是许多实验室一直进行探索,试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株得转化结果,认为:近来,在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理,可提高转化效率几十倍,通常把细胞悬浮在p H6、0 得100mmol/L CaCl2中,在冰浴条件下,放置过夜,转化率转高,但一过24小时,转化率测恢复为原来得水平。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验原理体外连接的重组DNA分子导入合适的宿主细胞中才能大量的进行复制、增殖和表达。
研究发现，用含Ca2+ 的溶液处理大肠杆菌细胞会易于吸收外源DNA。
大肠杆菌吸收外源DNA的过程被称为转化。
细菌处于容易吸收外源DNA的状态称为感受态。
用理化方法可以诱导细胞进入感受态，如电转化法、CaCL2法。
CaCL2法是目前实验室常用的制备感受态细胞的方法，其原理是使细菌处于0°C 、CaCl2低渗溶液中，细胞膨胀成球形，细胞膜的通透性发生改变，外源DNA附着于细胞膜表面，经42°C短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
宿主细胞一般是限制?D修饰系统缺陷的变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株，而质粒载体携带有某一抗生素抗性基因，如抗氨卞青霉素的基因（AP＋）。
若将转化的细胞涂布与于含氨卞青霉素的平板上，则只有那些含有被转化质粒的细胞才能生存并生长增殖。
从而可以筛选出哪个克隆含有质粒。
本实验以E.coli JM109菌株为受体细胞，用CaCl2处理受体菌使其处于感受态，然后与pUC18质粒共保温实现转化。
将经过转化后的全部受体细胞进行适当稀释，在含有氨卞青霉素的平板培养基上培养，只有转化体才能存活，而未有转化的受体细胞则因无抵抗氨卞青霉素的能力而死亡。
转化子经过扩增后，可将转入的质粒DNA分离提取出来，用于电泳分析、限制性内切酶图谱的制作以及DNA测序等实验。
二、仪器及试剂1. 仪器：恒温摇床、电热恒温培养箱、电热恒温水浴锅、超净工作台、分光光度计、高速冷冻离心机、台式离心机。
2. 材料E.coli JM109受体菌、质粒pUC18。
3. 试剂：LB培养液（1L）：胰蛋白胨 10g酵母粉 5gNaCl 10g（高盐）或5g（低盐）氨苄青霉素（Ampicillin） 100mg/ml在三角瓶中将胰蛋白胨 10g，酵母粉 5g以及 NaCl 5g溶于1L的重蒸水中并高压灭菌。
大肠杆菌感受态细胞的制备与转化
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三、试剂
1. LB固体和液体培养基 2. Amp母液 3. 含Amp的LB固体培养基 4. SOC液体培养基 5. 0.1mol/L CaCl2溶液
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【实验步骤】
一、 受体菌的培养 从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α
单菌落,接种于20 ml LB液体培养基中,37℃ 下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。 将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养1-2小时至 OD600 ＝0.5左右。
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二、 感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)
1、将培养液转入离心管中,冰上放置10-30分 钟，然后于4℃下5000 rpm离心10分钟。
2、 弃上清，用预冷的0.1mol/L的CaCl2 溶 液30ml轻轻悬浮细胞，冰上放置10分钟后， 4℃下5000 rpm离心10分钟，弃去上清。
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【思考题】
1、如何正确地设置连接和转化的各种对照？ 其意义何在？
2、如何提高连接和转编辑修改，供参考！ 感谢您的支持，我们努力做得更好！
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实验四、大肠杆菌感受态细胞的制备 与转化
【实验目的】
学习CaCl2法制备大肠杆菌感受态细胞的原 理与技术。
学习大肠杆菌转化的原理与技术。
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【实验原理】
在自然条件下,很多质粒都可通过细菌接合作用转 移到新的宿主内,但在人工构建的质粒载体中,一般 缺乏此种转移所必需的mob基因,因此不能自行完 成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。
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大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项1、感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后必须导入特定的宿主（受体细胞）使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状，这个导入过程及操作统称为重组DNA分子的转化。
在原核生物中，转化是一个较普遍的现象，在细胞间转化是否发生，一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系，另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很大的关系。
所谓的感受态：即指受体或者宿主最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态，是由受体菌的遗传性状所决定的同时也受菌龄、外界环境因子的影响。
cAMP可以使感受态水平提高一万倍，而Ca2+也可大大促进转化的作用。
细胞的感受态一般出现在对数生长期新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行成功转化的关键。
制备出的感受态细胞暂时不用时可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保存有效期62、转化的概念及原理在基因克隆技术中，转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性的一种方法。
它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验，如电击法、CaCl2等化学试剂法处理后，使细胞膜的通透性发生变化，成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞。
进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移，使受体细胞出现新的遗传性状。
大肠杆菌的转化常用化学法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年发现的。
其原理是细菌处于0℃CaCl2的低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促使细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增值，被转化的细菌中重组子中基因得到表达，在选择性培养基平板上可选出所需的转化子。
Ca2+处理的感受态细胞其转化率一般能达到5×106~2×107转化子/ug质粒DNA可以满足一般的基因克隆试验。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化
一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理（一）大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能接受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA（重组质粒）引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间内发生。
目前对感受态细胞能接受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：（1）发芽的芽孢杆菌容易转化；（2）大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；（3）适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：（1）蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；（2）细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；（3）分离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进行探索，试图从实验中获得明确回答。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
大肠杆菌热击感受态细胞的制备、注意事项和转化
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化大肠杆菌感受态细胞制备的原理：大肠杆菌自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难。
在转化实验中，通常先采用人工的方法制备感受态细胞，代表性的方法之一是Ca2+诱导法。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等。
细胞表面正电荷增加，通透性增加，形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。
Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化：①在0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。
②Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶（DNase）的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。
当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。
一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E. coli DH5α单菌落,接种于3-5ml LB液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右,直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100-1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中,37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
（OD600值在0.4到0.6之间）二、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法)1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15-30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液,轻轻悬浮细胞,冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、感受态细胞分装成200μl的小份,贮存于-80℃可保存半年。
大肠杆菌感受态过程中的注意事项：1、细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从-80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
大肠杆菌感受态细胞的制备原理、步骤以及重组质粒转化
一、目的1.了解感受态细胞生理特性及制备条件，掌握大肠杆菌感受态细胞制备方法。
2.掌握质粒DNA 转化大肠杆菌的方法，了解转化的条件和利用半乳糖苷酶基因插入失活选择重组质粒DNA 的原理。
二、原理〔一〕大肠杆菌感受态细胞制备的原理所谓感受态，是指细菌生长过程中的某一阶段的培养物，只有某一生长阶段中的细菌才能作为转化的受体，能承受外源DNA而不将其降解的生理状态。
感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA 的结合和加工等。
细胞外表正电荷增加，通透性增加，形成能承受外来的DNA 分子的受体位点等。
本实验为了把外源DNA〔重组质粒〕引入大肠杆菌，就必须先制备能吸收外来DNA分子的感受态细胞。
在细菌中，能发生感受态细胞是占极少数。
而且，细菌的感受态是在短暂时间发生。
目前对感受态细胞能承受外来DNA 分子的本质看法不一。
主要有两种假说：1、局部原生质体化假说――细胞外表的细胞壁构造发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。
证据有：〔1〕发芽的芽孢杆菌容易转化；〔2〕大肠杆菌的原生质体不能被噬菌体感染，却能受噬菌体DNA 转化；〔3〕适量的溶菌酶能提高转化率。
2、酶受体假说――感受态细胞的外表形成一种能承受DNA 的酶位点，使DNA分子能进入细胞。
证据是：〔1〕蛋白质合成的抑制剂如氯霉素，可以抑制转化作用；〔2〕细胞分裂过程中，一直有局部原生质化，但感受态只在生长对数期的中早期出现；〔3〕别离到感受态因子，能使非感受态细胞转变为感受细胞。
目前对感受态细胞的转化理论尚未有统一结论，但是许多实验室一直进展探索，试图从实验中获得明确答复。
有人根据pBR322 质粒DNA对E・coli K――12X1776菌株的转化结果，认为：近来，在许多研究室都发现CaCl2对受体菌处理，可提高转化效率几十倍，通常把细胞悬浮在pH6.0 的100mmol/L CaCl2中，在冰浴条件下，放置过夜，转化率转高，但一过24小时，转化率测恢复为原来的水平。
大肠杆菌感受态细胞的制备及转化
实验一大肠杆菌感受态细胞的制备及转化一、实验目的通过本实验，掌握大肠杆菌感受态细胞的制备及转化的方法和技术。
二、实验原理细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。
转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。
其原理是细菌处于0℃，CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。
转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。
将细胞放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型（如Ampr 等）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含有氨苄青霉素的选择性培养基上。
三、实验仪器、材料与试剂（一）、实验仪器超净工作台；低温离心机；恒温摇床；恒温箱；-70℃冰箱；恒温水浴器（二）、实验材料氯化钙（CaCl2）；胰蛋白胨；酵母提取物；氯化钠（NaCl）；氨苄青霉素；大肠杆菌DH5α；pUC19质粒；50mL离心管；吸头、试管、培养皿、锥形瓶等。
（三）、试剂1、0.1mol/L CaCl2溶液2、LB液体培养基3、氨苄青霉素（Amp），用无菌水配制成100mg/mL溶液，置-20℃冰箱保存。
四、实验步骤1、从E. coli DH5α平板上挑取1个单菌落于2 ml LB试管中，37℃，振荡，O/N；2、取500 μl菌液转到含50 ml LB三角瓶中，37℃振荡，2.5 hrs；3、将菌液转到50 ml离心管中，10 min on ice；4、离心，4 krpm，10 min，4℃，→回收细胞；5、用冰冷的10 ml的0.1 M CaCl2悬浮沉淀，30 min on ice→离心，4 krpm，10 min，4℃，→回收细胞；6、用冰冷的2 ml的0.1 M CaCl2悬浮细胞，即为感受态细胞；7、取200 μl感受态细胞，加2 μl pUC19 DNA（50 ng）混匀，30 min on ice；另设两对照：受体菌，200 μl感受态细胞+ 2 μl无菌水；质粒，200 μl 0.1 M CaCl2溶液+ 2 μl质粒DNA溶液；8、置于42℃，90 s，→2 min on ice→各加800 μl LB，37℃轻轻摇动，1 hr；9、取100 μl上述转化的感受态细胞，涂皿（含100 μg/ml Amp）→倒置平皿，37℃，O/N，出现菌落。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验报告引言：大肠杆菌（Escherichia coli）是一种常见的细菌，广泛应用于生物学研究和基因工程领域。
在这个实验报告中，我们将讨论大肠杆菌感受态细胞的制备和转化实验。
实验目的：本实验的目的是制备大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
通过这个实验，我们可以研究细菌的基因表达和遗传变异。
实验材料和方法：1. 大肠杆菌培养基：含有适当营养物质的LB培养基。
2. 大肠杆菌感受态细胞：选择性培养基（如含有抗生素的培养基）筛选得到的细菌株。
3. 目标DNA：从其他生物体中提取的DNA片段。
4. 热激转化装置：用于将DNA转化到感受态细胞中的装置。
5. 热激转化条件：将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，然后在热激转化装置中进行热冲击。
实验步骤：1. 制备感受态细胞：从大肠杆菌培养基中挑取一小部分细菌，接种到含有适当抗生素的选择性培养基中。
在37摄氏度下孵育过夜。
2. 提取目标DNA：从其他生物体中提取目标DNA片段，可以使用商业提取试剂盒或自制提取试剂进行操作。
3. 转化实验：将感受态细胞取出，进行适当的处理，如洗涤和离心。
将感受态细胞与目标DNA和CaCl2在冰上混合，并在热激转化装置中进行热冲击。
然后将细菌培养在含有抗生素的选择性培养基上。
4. 孵育和筛选：将转化后的细菌培养在含有抗生素的选择性培养基中，以筛选出成功转化的细菌。
在孵育过程中，可以使用PCR或其他方法进行确认。
结果和讨论：通过本实验，我们成功制备了大肠杆菌的感受态细胞，并将目标DNA转化到细胞内。
在筛选过程中，我们观察到在含有抗生素的培养基上生长出了抗性菌落，表明转化成功。
通过进一步的分析，如PCR检测，我们可以确认转化的目标DNA是否存在于细菌中。
这个实验的结果对于后续的基因表达研究和遗传工程应用具有重要意义。
大肠杆菌是常用的宿主细胞，可以用于大量表达外源蛋白和合成重组蛋白。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项
年夜肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项之答禄夫天创作时间：二O二一年七月二十九日1、感受态细胞的概念重组DNA分子体外构建完成后必需导入特定的宿主（受体细胞）使之无性繁殖并高效表达外源基因或直接改变其遗传性状,这个导入过程及把持统称为重组DNA分子的转化.在原核生物中,转化是一个较普遍的现象,在细胞间转化是否发生,一方面取决于供体菌与受体菌两者在进化过程中的亲缘关系,另一方面还与受体菌是否处于一种感受状态有着很年夜的关系. 所谓的感受态：即指受体或者宿主最易接受外源DNA片段并实现其转化的一种生理状态,是由受体菌的遗传性状所决定的同时也受菌龄、外界环境因子的影响.cAMP可以使感受态水平提高一万倍,而Ca2+也可年夜年夜增进转化的作用.细胞的感受态一般呈现在对数生长期新鲜幼嫩的细胞是制备感受态细胞和进行胜利转化的关键.制备出的感受态细胞暂时不用时可加入占总体积15%的无菌甘油或-70℃保管有效期6个月.2、转化的概念及原理在基因克隆技术中,转化特指将质粒DNA或以其为载体构建的重组DNA导入细菌体内使之获得新的遗传特性的一种方法.它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术之一.受体细胞经过一些特殊方法,如电击法、CaCl2等化学试剂法处置后,使细胞膜的通透性发生变动,成为能容许外源DNA分子通过的感受态细胞.进入细胞的DNA分子通过复制、表达实现遗传信息的转移,使受体细胞呈现新的遗传性状.年夜肠杆菌的转化经常使用化学法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年发现的.其原理是细菌处于0℃CaCl2的低渗溶液中,菌细胞膨胀成球形,转化混合物中的DNA 形成抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞概况,经42℃短时间热冲击处置,促使细胞吸收DNA复合物,在丰富培养基上生长数小时后,球状细胞复原并分裂增值,被转化的细菌中重组子中基因获得表达,在选择性培养基平板上可选出所需的转化子.Ca2+处置的感受态细胞其转化率一般能到达5×106~2×107转化子/ug质粒DNA可以满足一般的基因克隆试验.如在Ca2+的基础上联合其它的二价金属离子如Mn2+、Co2+、DMSO或还原剂等物质处置细菌,则可使转化率提高100~1000倍.化学法简单、快速、稳定、重复性好,菌株适用范围广,感受态细菌可以在-70℃保管,因此被广泛用于外源基因的转化.除化学法转化细菌外,还有电击转化法,电击法不需要预先诱导细菌的感受态,依靠长久的电击,促使DNA进入细菌,转化率最高能到达109~1010转化子/ug闭环DNA.因把持简便愈来愈为人们所接受.3、感受态细胞制备及转化中的影响因素⑴、细胞的生长状态和密度最好从-70℃或-20℃甘油保管的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液.不要用已经过屡次转接及贮存在4℃的培养菌液.细胞生长密度以每毫升培养液中的细胞数在5×107个左右为佳.即应用对数期或对数生长前期的细菌,可通过测定培养液的OD600控制.对TG1菌株OD600为0.5时,细胞密度在5×107个/ml左右.应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的分歧而分歧.密渡过高或缺乏均会使转化率下降.另外受体细胞一般应是限制-修饰系统缺陷的突变株,即不含限制性内切酶和甲基化酶的突变株.而且受体细胞还应与所转化的载体性质相匹配.⑵、质粒DNA的质量和浓度用于转化的质粒DNA应主要是超螺旋态的转化率与外源DNA的浓度在一定范围内成正比但当加入的外源DNA的量过多或体积过年夜时则会使转化率下降.一般地,DNA溶液的体积不应超越感受态细胞体积的5%1ng的cccDNA即可使50ul的感受态细胞到达饱和.对以质粒为载体的重组分子而言,分子量年夜的转化效率低,实验证明年夜于30kb的重组质粒将很难进行转化.另外重组DNA分子的构型与转化效率也密切相关,环状重组质粒的转化率较分子量相同的线性重组质粒高10~100倍,因此重组DNA年夜都构成环状双螺旋分子.⑶、试剂的质量所用的CaCl2等试剂均需是最高纯度的,并用最纯洁的水配制,最好分装保管于4℃.⑷、防止杂菌和杂DNA的污染整个把持过程均应在无菌条件下进行,所用器皿,如离心管、移液枪头等最好是新的,并经高压灭菌处置.所有的试剂都要灭菌,且注意防止被其它试剂、DNA酶或杂DNA所污染否则均会影响转化效率或杂DNA的转入.⑸、整个把持均需在冰上进行不能离开冰浴否则细胞转化率将会降低.时间：二O二一年七月二十九日。
大肠杆菌感受态细胞的制备和转化原理及注意事项
大肠杆菌体验态细胞的造备战变化本理及注意事项之阳早格格创做1、体验态细胞的观念沉组DNA分子体中建立完毕后必须导进特定的宿主（受体细胞）使之无性繁殖并下效表白中源基果大概曲交改变其遗传性状，那个导进历程及支配统称为沉组DNA分子的变化.正在本核死物中，变化是一个较一致的局里，正在细胞间变化是可爆收，一圆里与决于供体菌与受体菌二者正在进化历程中的亲缘关系，另一圆里还与受体菌是可处于一种体验状态有着很大的关系. 所谓的体验态：即指受体大概者宿主最易交受中源DNA片段并真止其变化的一种死理状态，是由受体菌的遗传性状所决断的共时也受菌龄、中界环境果子的效用.cAMP不妨使体验态火仄普及一万倍，而Ca2+也可大大促进变化的效用.细胞的体验态普遍出当前对付数死少久新陈幼老的细胞是造备体验态细胞战举止乐成变化的关键.造备出的体验态细胞姑且没有必时可加进占总体积15%的无菌苦油大概-70℃保存灵验期6个月.2、变化的观念及本理正在基果克隆技能中，变化特指将量粒DNA大概以其为载体建立的沉组DNA导进细菌体内使之赢得新的遗传个性的一种要收.它是微死物遗传、分子遗传、基果工程等钻研范畴的基础真验技能之一.受体细胞通过一些特殊要收，如电打法、CaCl2等化教试剂法处理后，使细胞膜的通透性爆收变更，成为能容许中源DNA分子通过的体验态细胞.加进细胞的DNA分子通过复造、表白真止遗传疑息的变化，使受体细胞出现新的遗传性状.大肠杆菌的变化时常使用化教法CaCl2法该法最先是由Cohen于1972年创造的.其本理是细菌处于0℃CaCl2的矮渗溶液中，菌细胞伸展成球形，变化混同物中的DNA产死抗DNase的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲打处理，督促细胞吸支DNA 复合物，正在歉富培植基上死少数小时后，球状细胞复本并团结删值，被变化的细菌中沉组子中基果得到表白，正在采用性培植基仄板上可选出所需的变化子.Ca2+处理的体验态细胞其变化率普遍能达到5×106~2×107变化子/ug量粒DNA 不妨谦脚普遍的基果克隆考查.如正在Ca2+的前提上共同其余的二价金属离子如Mn2+、Co2+、DMSO大概还本剂等物量处理细菌，则可使变化率普及100~1000倍.化教法简朴、赶快、宁静、沉复性好，菌株适用范畴广，体验态细菌不妨正在-70℃保存，果此被广大用于中源基果的变化.除化教法变化细菌中，另有电打变化法，电打法没有需要预先诱导细菌的体验态，依赖短促的电打，督促DNA加进细菌，变化率最下能达到109~1010变化子/ug关环DNA.果支配烦琐愈去愈为人们所交受.3、体验态细胞造备及变化中的效用果素⑴、细胞的死少状态战稀度最佳从-70℃大概-20℃苦油保存的菌种中曲交转交用于造备体验态细胞的菌液.没有要用已通过多次转交及贮存留4℃的培植菌液.细胞死少稀度以每毫降培植液中的细胞数正在5×107个安排为好.即应用对付数期大概对付数死少前期的细菌,可通过测定培植液的OD600统造.对付TG1菌株OD600为0.5时,细胞稀度正在5×107个/ml安排.应注意OD600值与细胞数之间的关系随菌株的分歧而分歧.稀度过下大概缺累均会使变化率下落.别的受体细胞普遍应是节造-建饰系统缺陷的突变株，即没有含节造性内切酶战甲基化酶的突变株.而且受体细胞还应与所变化的载体本量相匹配.⑵、量粒DNA的品量战浓度用于变化的量粒DNA应主假如超螺旋态的变化率与中源DNA的浓度正在一定范畴内成正比但是当加进的中源DNA 的量过多大概体积过大时则会使变化率下落.普遍天，DNA 溶液的体积没有该超出体验态细胞体积的5%1ng的cccDNA 即可使50ul的体验态细胞达到鼓战.对付于以量粒为载体的沉组分子而止，分子量大的变化效用矮，真验说明大于30kb 的沉组量粒将很易举止变化.别的沉组DNA分子的构型与变化效用也稀切相关，环状沉组量粒的变化率较分子量相共的线性沉组量粒下10~100倍，果此沉组DNA多数形成环状单螺旋分子.⑶、试剂的品量所用的CaCl2等试剂均需是最下杂度的，并用最杂洁的火配造，最佳分拆保存于4℃.⑷、预防杂菌战杂DNA的传染所有支配历程均应正在无菌条件下举止，所用器皿，如离心管、移液枪头等最佳是新的，并经下压灭菌处理.所有的试剂皆要灭菌，且注意预防被其余试剂、DNA酶大概杂DNA所传染可则均会效用变化效用大概杂DNA的转进.⑸、所有支配均需正在冰上举止没有克没有及离启冰浴可则细胞变化率将会落矮.。
大肠杆菌转化实验(热击法)——【感受态细胞的制备及其转化技术】
大肠杆菌转化实验（热击法）大肠杆菌转化可以：（1）将重组DNA分子导入大肠杆菌受体细胞进行复制，增殖和表达，以获得目的基因；（2）验证大肠杆菌感受态细胞效果；（3）用于分子生物学其他研究。
1原理：质粒DNA粘附在细菌细胞表面，经过42°C短时间的热击处理，促进吸收DNA.然后在非选择培养基中培养一代，待质粒上所带的抗菌素基因表达，就可以在含抗菌素的培养基中生长。
2器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。
3材料和试剂：质粒DNA，重组DNA，培养基（不加抗菌素），LB培养基（加抗菌素），无菌ddH2O，IPTG，X-gal。
4实验准备：无菌ddH2O，1.5ml离心管装入铝制饭盒（灭菌）、移液器吸头装入相应的吸头盒（灭菌），20%IPTG（M/V），2% X-gal（M/V，用N,N-二甲基甲酰胺配）。
5操作步骤：（1）事先将恒温水浴的温度调到42℃。
（2）从-70℃超低温冰柜中取出一管（100μl）感受态菌，立即用手指加温融化后插入冰上，冰浴5~10min。
（3）加入5μl连接好的质粒混合液（DNA含量不超过100ng），轻轻震荡后放置冰上20min。
（4）轻轻摇匀后插入42℃水浴中1~2min进行热休克，然后迅速放回冰中，静置3~5min。
1（5）在超净工作台中向上述各管中分别加入500μl LB培养基（不含抗菌素）轻轻混匀，然后固定到摇床的弹簧架上37℃震荡1h.（6）在超净工作台中取上述转化混合液100~300μl，分别滴到含合适抗菌素的固体LB 平板培养皿中，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀（注意：玻璃涂布棒上的酒精熄灭后稍等片刻，待其冷却后再涂）。
（7）如果载体和宿主菌适合蓝白斑筛选的话，滴完菌液后再在平板上滴加40μl 2% X-gal，8μl 20% IPTG，用酒精灯烧过的玻璃涂布棒涂布均匀。
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大肠杆菌感受态细胞的制备和转化
大肠杆菌感受态细胞制备的原理：
大肠杆菌自然条件下很难进行转化，其主要原因是转化因子的吸收较为困难。
在转化实验中,通常先采用人工的方法制备感受态细胞，代表性的方法之一是Ca2+诱导法.感受态形成后，细胞生理状态会发生改变，出现各种蛋白质和酶，负责供体DNA的结合和加工等.细胞表面正电荷增加,通透性增加,形成能接受外来的DNA分子的受体位点等。
Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化：
①在0℃的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀,同时CaCl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来,诱导大肠杆菌形成感受态。
②Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶（DNase）的羟基—磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。
当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。
一、受体菌的培养从LB平板上挑取新活化的E。
coli DH5α单菌落，接种于3—5ml LB
液体培养基中,37℃下振荡培养12小时左右，直至对数生长后期。
将该菌悬液以1:100—1:50的比例接种于100ml LB液体培养基中，37℃振荡培养2-3小时至OD600 ＝0.5左右。
（OD600值在0.4到0.6之间）二、感受态细胞的制备 ( CaCl2 法）1、将培养液转入离心管中,冰上放置10分钟,然后于4℃下3000g离心10分钟。
2、弃去上清,用预冷的0.05mol/L 的CaCl2 溶液10ml轻轻悬浮细胞,冰上放置15—30分钟后,4℃下3000g离心10分钟。
3、弃去上清,加入4ml预冷含15%甘油的0.05mol/L的CaCl2 溶液，轻轻悬浮细胞，冰上放置几分钟,即成感受态细胞悬液。
4、感受态细胞分装成200μl的小份，贮存于—80℃可保存半年。
大肠杆菌感受态过程中的注意事项：
1、细菌的生长状态：不要用经过多次转接或储于4℃的培养菌，最好从—80℃甘油保存的菌种中直接转接用于制备感受态细胞的菌液。
细胞生长密度以刚进入对数生长期时为宜，可通过监测培养液的OD600 来控制.DH5α菌株的OD600为0。
5时，细胞密度在5×107 个/mL左右，这时比较合适。
密度过高或不足均会影响转化效率.
2、所有操作均应在无菌条件和冰上进行；实验操作时要格外小心,悬浮细胞时要轻柔，以免造成菌体破裂,影响转化。
3、经CaCl2处理的细胞，在低温条件下，一定的时间内转化率随时间的推移而增加，24小时达到最高，之后转化率再下降（这是由于总的活菌数随时间延长而减少造成的）;
4、化合物及无机离子的影响:在Ca2+的基础上联合其他二价金属离子（如Mn2+或Co2+）、DMSO或还原剂等物质处理细菌，可使转化效率大大提高（100—1000倍）;
5、所使用的器皿必须干净。
少量的去污剂或其它化学物质的存在可能大大降低细菌的转化效率;
6、所用器具的洁净程度。
这一点非常重要，是所有与感受态有关的方法与文章上必讲的，毋庸置疑。
7、培养基的装量。
培养基的装量是很重要的，这关系到菌体生长过程中的能量代谢问题，是有氧还是无氧生长.厌氧生长出来的菌体是做不出效率高的感受态的。
建议装量不要高于此值：培养基体积/三角瓶容量=100ml/500ml，50ml/250ml.
8、培养基的pH值.这里讲的pH值并非单指配制或灭菌后的pH值，而且还包括整个摇瓶结束后的pH值。
一般来说，接种前的pH值在6.8—7。
2。
等菌摇好后，可以测一下pH值，不要低于6.0，最好在6.5以上.这表示菌体的代谢为有氧代谢,生长状态良好，按要求做,肯定效率不低。
9、培养后的OD值.其实这是一个非常重要的参数，只是当OD值大到一定的程度后,菌体要保持对数生长已经不太可能,因此很多指导方法上强调OD不得大于0.6、0。
8等等。
同时，OD值大时菌体总量大，感受态绝对数量要大一点。
因此需要在OD值的两方面影响中找一个平衡点。
10、培养基中的各种离子。
经验证明，当培养基中存在一定量的Mg2+离子时，该方法制得的感受态要相对较高。
在制备普通感受态时，使用20mM MgCl2做为培养基的添加物,在感受态收获之前20—30分钟加入,会收到很好的效果。
11、培养温度.文献及经验告诉我们，较低的温度培养有利于感受态的形成，这样可以获得较高的感受态，但太低又不实用，因而产生了Inoue的高效感受态制备方法,它实际是利用了所有有利于感受态的文献而得出的一个非常理想方法.
12、此外文献报道,在保存感受态时,DMSO要比甘油的效果要好，它会使感受态的效率增加。
13、液氮速冻也会使感受态的效率提高，因此推荐用液氮速冻感受态，然后保存于超低温冰箱内。
三、转化1、从-80℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使其解冻,解冻后立即置冰上。
2、加入质粒DNA溶液（含量不超过50ng，体积不超过10μl）,轻轻摇匀,冰上放置30分钟后。
3、42℃水浴中热击90秒或37℃水浴5分钟,热击后迅速置于冰上冷却3—5分钟。
4、向管中加入1ml LB液体培养基(无抗性LB),混匀后37℃振荡培养1小时，使细菌恢复正常生长状态,并表达质粒编码的抗生素抗性基因。
5、将上述菌液摇匀后取100μl 涂布于含抗性（Kana或者Amp）的筛选平板上,正面向上放置半小时，待菌液完全被培养基吸收后倒置培养皿,37℃培养16-24小时。
同时做两个对照:
对照组1: 以同体积的无菌双蒸水代替DNA溶液，其它操作与上面相同。
此组正常情况下在含抗生素的LB平板上应没有菌落出现。
对照组2：以同体积的无菌双蒸水代替DNA 溶液，但涂板时只取5μl 菌液涂布于不含抗生素的LB平板上，此组正常情况下应产生大量菌落。
四、计算转化率统计每个培养皿中的菌落数。
转化后在含抗生素的平板上长出的菌落即为转化子，根据此皿中的菌落数可计算出转化子总数和转化频率，公式如下:转
化子总数＝菌落数×稀释倍数×转化反应原液总体积／涂板菌液体积转化频率（转化子数／每mg质粒DNA）＝转化子总数／质粒DNA加入量（mg）
感受态细胞总数＝对照组２菌落数×稀释倍数×菌液总体积／涂板菌液体积感受态细胞转化效率＝转化子总数／感受态细胞总数［注意］本实验方法也适用于其它E.coli受体菌株的不同的质粒DNA的转化。
但它们的转化效率并不一定一样。
有的转化效率高，需将转化液进行多梯度稀释涂板才能得到单菌落平板,而有的转化效率低,涂板时必须将菌液浓缩(如离心）,才能较准确的计算转化率。