黑曲霉产糖化酶液态发酵条件研究

黑曲霉产糖化酶液态发酵条件研究

孙继祥

【摘要】The effects of additives,feeding time and feeding quantity on Saccharifying enzyme production by Aspergillus niger fermentation were investigated throug single factor test with the activity of Saccharifying enzyme as indicator.Then the effects of fermentation conditions on Saccharifying enzyme production were investigated by orthogonal experiments.The results suggested that the addition of（NH4） 2SO4 could enhance 17 % enzyme activity,the optimum feeding time was 48

h,the best feeding quantity was 6 mL,feeding could prolong fermenting cycle from previous 96 h to 120 h,and the optimum fermentation conditions were 15 % inoculating quantity,50 mL liquid-filling in 250 mL triangle flask,and initial pH value as 4.5.%以糖化酶活力为指标,通过单因素实验,分别考察了添加物、补料时间和补料量对黑曲霉发酵产糖化酶的影响。通过正

交实验,考察了发酵条件对黑曲霉发酵产酶的影响。结果表明,添加0.4%的（NH4）2SO4作为促进剂可使酶活提高17%,最佳补料时间为48 h,补料量6 mL,补料可使发酵周期由原来的96 h延长到120 h;最佳发酵条件为接种量15%,250 mL三角

瓶装液量50 mL,初始pH为4.5。

【期刊名称】《酿酒科技》

【年(卷),期】2011(000)010

【总页数】6页(P42-47)

【关键词】黑曲霉;糖化酶;发酵条件;酶活力

【作者】孙继祥

【作者单位】河南皇沟酒业有限责任公司,河南永城476600

【正文语种】中文

【中图分类】Q93-3;TS261.1

黑曲霉（Aspergillus niger）是一种常见真菌，属于半知菌类曲霉属[1]，它在各

种基质中普遍存在，现已成为工业应用常见的菌种之一[2]。黑曲霉产生的糖化酶

对淀粉的水解能力很强，尤其是对谷物原料更是如此。其在酒精工业[5]、淀粉糖

工业，啤酒酿造、白酒和曲酒的生产，味精、柠檬酸[8]等生产工业过程中皆有重

要运用。

糖化酶在我国酶制剂行业中占有非常重要的地位，其产量占全国酶制剂总产量的60%以上，产销量逐年增长[9]。近几年，随着生物技术发展、石油资源紧缺，发

酵行业发展特别快，糖化酶作为葡萄糖生产的主要酶种，其发展前景特别好。虽然我国糖化酶发酵技术发展很快，但在技术水平和生产上仍存在诸如重复建设、工艺设备落后、研究开发不足、污染大[11]等问题。这些问题已影响到我国酶制品的出口。因此，大幅度提高糖化酶活力，提高酶收得率，降低生产成本已迫在眉睫。

本文结合公司的实际生产情况，对黑曲霉产糖化酶的液态发酵条件作了初步研究，主要包括发酵周期的确定，不同添加物、补料量、补料时间对黑曲霉发酵产酶的影响。

1.1.1 试剂

蔗糖；可溶性淀粉；NaNO3；KCl；K2HPO4；MgSO4·7H2O；FeSO4；

琼脂；玉米淀粉；玉米浆；尿素；DNS；黄豆粉；(NH4)2SO4；酒石酸；葡萄糖；

NaOH；柠檬酸；HCl；硫酸铜。

1.1.2 仪器

SWO-CJ-1F型超净工作台；立式圆形压力蒸汽灭菌锅，(YXQ.SG41.280)；冰箱；精密电子天平；721可见分光光度计；生化培养箱；电热恒温水浴锅。

1.1.3 菌种

黑曲霉，培菌实验室保存。

1.1.4 培养基

筛选培养基(g/L)（查氏培养基）：NaNO32 g，KCl0.5 g，FeSO40.01 g，

K2HPO41 g，蔗糖 30 g，琼脂 16 g。

基础发酵培养基(g/L)：玉米淀粉10 g，玉米浆2 g，黄豆粉2 g，用柠檬酸调pH 值4.5。

补料培养基(g/L)：玉米淀粉10 g，玉米浆2 g，黄豆粉2 g，用柠檬酸调pH值4.5。

1.2.1 pH值的测定

用精密pH试纸和酸度计测定。

1.2.2 糖化酶活力测定

参照二硝基水杨酸法[14]。一个酶活单位定义为在50℃、pH4.35条件下，每1 h 生成1 mg葡萄糖所需的酶量。

1.2.2.1 测定原理

用一定量的糖化酶作用于淀粉，将淀粉水解成葡萄糖，葡萄糖与3,5-二硝基水杨

酸共热后可生成棕色氨基化合物。在一定范围内，该棕色化合物颜色深浅与葡萄糖的量呈正比关系。用分光光度计进行比色测定该物质在540 nm处的吸光度，计

算出生成的葡萄糖含量，然后用生成的葡萄糖含量来计算糖化酶的活力。

1.2.2.2 试剂配制

显示剂 (DNS)：取6.3 g DNS和262 mL 2 mol/L NaOH加入到500 mL内溶182 g酒石酸钾钠的热水中，再加入5 g重蒸酚和5 g亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后，加水定容至1000 mL，贮藏于棕色瓶中，7 d后使用。

葡萄糖标准溶液(1 mg/mL)：准确称取干燥恒重的葡糖糖1 g，加入少量溶解后，再加入8 mL 12 mol/L的浓盐酸,以蒸馏水定容至1000 mL。

0.1 mol/L乙酸缓冲溶液（pH4.5）：取13.6 g三乙酸钠溶于300 mL的蒸馏水中，定容至1000 mL，用冰乙酸调pH至4.5。

2%可溶性淀粉：取2.0 g可溶性淀粉加热溶于100 mL乙酸溶液中。

1.2.2.3 酶液制备

取0.5 mL发酵液置入200 mL容量瓶中，用蒸馏水稀释定容，即得到稀释的粗酶液。

1.2.2.4 测定方法

在5 mL的2%可溶性淀粉溶液中加入5 mL适量稀释的酶液，50℃下保温反应10 min，用滴管吸取1～2滴反应液滴入比色板中，用碘液检查，以保证有淀粉残余，然后立即在沸水浴中煮沸10 min停止反应。取反应液1 mL，加入1 mL DNS，

沸水浴加热5 min，取出再加入蒸馏水8 mL，摇匀，分光光度计540 nm处测定吸光度值。每个样做3个平行实验。

1.2.2.5 标准曲线的绘制

分别吸取 1 mL、2 mL、4 mL、6 mL 和 8 mL 的葡萄糖标准溶液于5支试管中，再分别加入9 mL、8 mL、6 mL、4 mL、2 mL蒸馏水。另取6支试管，前5支

分别加入上述不同梯度葡萄糖溶液1 mL，第6支管加入1 mL蒸馏水。然后再加

入DNS试剂1 mL，沸水浴中加热5 min，立即用水冷却，最后加入蒸馏水8 mL，摇匀，分光光度计540 nm处测定吸光度值。以吸光度值为纵坐标，葡萄糖含量

为横坐标，绘制标准曲线，见图1。