一种新丝氨酸蛋白酶-snc19（st14）基因编码蛋白生物特性的的研究

浙江大学博士学位论文
一种新的丝氨酸蛋白酶——《ＮＣｌ９（ＳＴｌ４）基因编码蛋白的生物特性
的研究
中文摘要
厂
＼恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一，近年来随着生活水平的提高，～
社会老龄化的发展，恶性肿瘤的发病率和死亡率都呈明显升高趋势。

转移和复发是肿瘤治疗失败的最主要原因。

肿瘤转移是恶性肿瘤最重要的特征之一，也是一个多阶段的、序贯连续的复杂过程，大致分为几个阶段：ｌ，肿瘤细胞脱离原发瘤；２，肿瘤细胞穿过基底膜，发生组织浸润，并进入血管或淋巴管；３，在血管或淋巴管中转运、黏附和侵入靶组织；４，在靶组织生长、血管增生、形成转移灶。

细胞外基质ＥｃＭ包括基底膜和间隙间质，主要是由胶原。

糖蛋白和蛋白多糖等一些物质组成，具有维持细胞组织形态的作用，是细胞间相互作用的重要场所。

在肿瘤细胞的浸润和转移过程中，肿瘤细胞必须首先要通过ＥｃＭ的降解，才能发生肿瘤细胞的浸润和迁移，并转移到他处。

因此，肿瘤浸润和转移与ＥｃＭ的降解有极其重要关系。

ＥｃＭ的降解与多种蛋白酶有关，其中包括丝氨酸蛋白酶家族中的纤维蛋白溶酶原和纤维蛋白溶酶系统，金属蛋白酶系统中的ＭＭＰ－２和删Ｐ一９，组织蛋白酶Ｂ，组织蛋白酶Ｄ，以及其他一些蛋白水解酶如透明质酸酶，胶原酶等。

ＳＮＣｌ９（ＳＴｌ４）基因是我所应用减数杂交技术筛选出的大肠癌新相关基因之一。

１９９５年被Ｇｅｎｂａｎｋ作为新基因录入，并给予登录检索号ＨＳＵ２０４１８。

１９９８年国际基因命名委员会命名ＳＮＣｌ９为ＳＴｌ４（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ１４）基因。

在人类基因组计划的基因组资料１１号染色体的基因图谱中已将ＳＮＣｌ９／ＳＴｌ４基因收录。

ＳＮＣｌ９基因的基因组ＤＮＡ全长为５０４２０ｂｐ，共有１９个外显子及１８个内含子，荧光原位杂交结果显示，该基因定位于Ｉｌｑ２４—２５区。

ＳＮＣｌ９／ＳＴｌ４基因ｃＤＮＡ全长为３１４２ｂｐ，ＯＲＦ编码８５５个氨基酸，编码蛋白序列内含胰蛋白酶样功能区。

在国外的一些实验室先后通过不同途径发现了与ＳＮＣｌ９基因序列～致的蛋
ｌ
白，并各自命名。

美国的Ｌｉｎ．Ｃ．Ｙ等在人的一种乳腺癌细胞系的培养液中分离
到一种新的丝氨酸蛋白酶，经氨基酸序列分析，Ｇｅｎｂａｎｋ基因序列比对，证实与ＳＮＣｌ９基因相同。

１９９９年，Ｌｉｎ．ｃ．Ｙ等发现这种丝氨酸蛋白酶具有降解细胞外基质的作用，将其称为Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ。

美国的Ｔａｋｅｕｃｈｉ等在人前列腺癌细胞中发现并命名为ｍｅｍｂｒａｎｅ—ｔｙｐｅｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ１（ＭＴ—ＳＰｌ）。

在他们的研究中发现，Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ具有降解细胞外基质的作用，并能激活ｕＰＡ前体及ＨＧＦ／ｓＦ前体。

肝细胞生长因子激动子抑制因子ＨＡＩ一１（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒａｃｔｉｖａｔｏｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒ），１９９７年首先在胃癌细胞系ＭＫＮ４５中发现，为一类新的Ｋｕｎｉｔｚ型丝氨酸蛋白酶抑制因子，可特异性地抑制ＨＧＦＡ，激活ＢＧＦ前体，在肿瘤的形成、肿瘤细胞的浸润和转移、分化及肿瘤血管形成过程中可能有重要调
节作用。

其与Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ在生理条件下在人乳中以复合蛋白的形式存在，并能
、
抑制Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ降解细胞外基质ＥＣＭ功能。

４
／
为进一步研究ＳＮＣｌ９（ＳＴｌ４）蛋白的生物特性，以及其在肿瘤转移中的可能作用，本实验在核酸水平的研究基础上设计：１，将ＳＮＣｌ９（ＳＴｌ４）基因克隆到原核表达质粒，表达纯化ＳＮＣｌ９（ＳＴｌ４）一ＧＳＴ融合蛋白；２，用ＳＮＣｌ９（ＳＴｌ４）一ＧＳＴ融合蛋白免疫小鼠，按杂交瘤技术制备ＳＮＣｌ９（ＳＴｌ４）蛋白单克隆抗体；３，利用生物信息学方法进行ＳＮＣｌ９（ＳＴｌ４）蛋白的结构预测和功能分析；４，在ｍＲＮＡ水平用ＲＴＰＣＲ的方法研究在正常大肠黏膜及相应肿瘤组织中表达；在蛋白水平应用免疫组织化学方法研究正常消化道与相应肿瘤组织表达分布情况，并研究在其他肿瘤中表达的情况，同时研究ＳＮＣｌ９蛋白与其相关蛋白ＨＡｌ—１蛋白在组织表达中的关系：５，用ＰＣＲ—ＤＮＡ序列分析的方法比较正常大肠黏膜及相应肿瘤组织中ＳＮＣｌ９（ＳＴｌ４）基因组ＤＮＡ外显子序列的差异分析ＳＮＣｌ９（ＳＴｌ４）基因突变情况。

１．ＳＮＣｌ９原核表达质粒的构建及融合蛋白的表达；
／
（将部分ＳＮＣｌ９基因ｃＤＮＡＯＲＦ经ＰＣＲ扩增和亚克隆，与６ＳＴ融合蛋白原核表＼
达载体ｐＧＥＸ４Ｔ２重组构建ＳＮＣｌ９ＯＲＦ／ｐＧＥＸ４Ｔ２表达质粒。

将ＳＮＣｌ９ＯＲＦ／
２
ｐＧＥＸ４Ｔ２表达质粒转化Ｅ．ｃｏｌｉＰ２３９２细菌，以ＩＰＴＧ诱导表达ＳＮＣｌ９－ＧＳＴ融合
蛋白。

ＰＣＲ扩增ＳＮＣｌ９基因ｃＤＮＡ的部分ＯＲＦ结果为９００ｂｐ，经ＤＮＡ测序证实。

ＢａｍＨＩ和ＮｏｔＩ酶双酶切证实ＳＮＣｌ９ＯＲＦ正确克隆在ｐＧＥＸ４Ｔ２多克隆位点。

ＳＤＳ—ＰＡＧＥ凝胶电泳证实ＩＰＴＧ诱导表达ＳＮＣｌ９一ＧＳＴ融合蛋白，大小为５８ｋｄａ。

ＳＮＣｌ９一ＧＳＴ融合蛋白主要表达在诱导表达菌沉淀，用制备型的￥３Ｓ—ＰＡＧＥ割胶、
电洗脱回收纯化ＳＮＣｌ９～ＧＳＴ融合蛋白。

以浓度梯度标准ＢＳＡ测定回收融合蛋白
、
浓度，共制备融合蛋白抗原约５．５ｍｇ。

４
／
２．ＳＮＣｌ９单克隆抗体的制备和生物学特性鉴定ｌ
厂
（用ＳＮＣｌ９－ＧＳＴ融合蛋白免疫ＢＡＬＢ／ｃ小鼠，应用杂交瘤技术，经细胞融合和＼
筛选，克隆化培养和特异性性检测，获得抗ＳＮＣｌ９克隆抗体细胞株ＺＩＮＧ９，经三次克隆化，持续培养，分泌抗体稳定。

ＥＬＩＳＡ间接法粗测ｚＭＧ９上清效价为１：５１２—１０２４，腹水中单抗的效价为１：１，３２１，０７２。

Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ鉴定原核部分ＳＮＣｌ９ＯＲＦ－ＧＳＴ融合蛋白条带为５８ｋｄａ左右，与抗ＧＳＴ抗体检测到的条带一致。

全长ＳＮＣｌ９ＯＲＦ－ＧＳＴ融合蛋白的条带大小为１ｌＯｋｄａ左右，与预测大小一致。

正常大肠黏膜及肠癌组织中ＳＮＣｌ９蛋白条带位于９５ｋｄａ左右，与ＳＮＣｌ９蛋白理论
、
预测值一致。

＼Ｉ
，
３．ＳＮＣｌ９蛋白结构预测和功能分析；
／利用人工神经网络方法预测二级结构，Ｋｙｔｅ＆Ｏｏｏｌｉｔｔｌｅ方法及Ｊａｎｉｎ方Ｌ
法进行疏水性分析，ＨｉｄｄｅｎＭａｒｋｏｖＭｏｄｅｌ进行蛋白跨膜区预测，Ｓｗｉｓｓ—Ｄｒｏｔ数据库进行同源性比较，并寻找功能区段。

结果发现ＳＮＣｌ９蛋白中含有丰富无规卷曲区域（６１．５２０４，５２６／８５５），极少的ａ螺旋结构（７．０％，６０／８５５），且主要集中在氨基端，疏水性分析及跨膜区预测显示５６—７７段为跨膜区。

ＳＮＣｌ９蛋白与小鼠丝氨酸蛋白酶ｅｐｉｔｈｉｎ同源性为８６％，是由两段重复的ＣＵＢ区，四个重复的低密度脂蛋白受体区ＬＤＬＲ及丝氨酸蛋白酶特征区组成，在ｃＵＢ区前还存在一个跨膜区和较短的胞内区，符合ＩＩ型跨膜丝氨酸蛋白酶的结构特征，其结构
、
上的特点显示该蛋白与细胞表面发生的蛋白水解有关≯
，
３
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４．ＳＮＣｌ９及其相关蛋白ＢＡＩ－１在一些正常及肿瘤组织中表达分布的研究；
ｊｌ应用ＲＴ－ＰＣＲ方法进行ＳＮＣｌ９在正常大肠黏膜和肿瘤组织的ＲＮＡ水平表达的＼
检测。

应用免疫组织化学方法研究正常与肿瘤组织中ＳＮＣｌ９蛋白的表达分布情况。

同时研究ＳＮＣｌ９蛋白与其相关蛋白ＨＡｌ—１蛋白在组织表达中的关系。

ＲＮＡ水平上，３９例正常大肠黏膜及相应肿瘤组织中均有ＳＮＣｌ９ｍＲＮＡ表达，正常黏膜组的ＳＮＣｌ９ｍＲＮＡ表达水平要高于肿瘤组，结果有显著性差异。

表达水平高低与各个临床指标无明显关系。

在蛋白水平，发现ＳＮＣｌ９蛋白主要分布在消化道表面上皮，而腺体上皮表达较弱，间质细胞为阴性。

在小肠绒毛可观察到从底部到顶部染色逐渐增强的现象。

各种上皮组织和相应的恶性肿瘤组织中的可见到ＳＮＣｌ９蛋白的不同程度的表达，以消化道表面上皮，胆管上皮，子宫内膜上皮，唾液腺导管上皮等管道上皮表达最高｛肝，胰，肺，肾，乳腺等有一定的表达：复层鳞状上皮，消化道腺上皮和脑，淋巴结，软骨，肌肉等间皮组织及问质细胞无表达。

在各种肿瘤组织中ＳＮＣｌ９蛋白表达程度不一，可从阴性到强阳性表达。

在５３例大肠癌和３７例胃癌中，高分化肠癌中ＳＮＣｌ９蛋白表达阳性率为７４．２％（２３／３１），中分化肠癌中ＳＮＣｌ９蛋白表达阳性率为５７．１％（８／１４），低分化肠癌中ＳＮＣｌ９蛋白表达阳性率为１２．５％（１／８）：高分化胃癌中ＳＮＣｌ９蛋白表达阳性率为７７．８％（７／９），中分化胃癌中ＳＮＣｌ９蛋白表达阳性率为５０％（５／１０），低分化胃癌中ＳＮＣｌ９蛋白表达阳性率为２２．２％（４／１８）。

统计分析显示有显著性差异Ｐ＜Ｏ．Ｏｌ。

ＳＮＣｌ９蛋白表达在胃肠肿瘤分期和淋巴结转移情况中无显著性差异。

ＳＮＣ｜９和ＢＡＩ一１的正常与肿瘤组织表达谱基本相同，在正常消化道上皮中，ＨＡＩ—ｌ蛋白表达分布情况与ＳＮＣｌ９蛋白一致。

在一例正常肠腺腺体与轻度不典型增生交界处，正常肠腺腺体ＳＮＣｌ９和ＨＡＩ一１表达阴性，轻度不典型增生处为阳性，两者在表达阴阳性的分界完全一致。

在３４例大肠正常黏膜表面上皮中ＳＮＣｌ９和ＨＡｌ一１的表达相关系数为０．７４４，Ｐ值＜０．Ｏｌ。

在５ｌ例大肠癌和３７例
、
胃癌中相关系数分别为０．６０５和０．３６３。

吣
√
５．￥ＮＣｌ９基因突变情况的研究。

４
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／按ＳＮＣｌ９基因组ＤＮＡ序列，设计１９对ＰＣＲ引物，其ＰＣＲ产物包括所有的１９ｔ
个外显子序列在内。

分别用大肠正常黏膜组织和大肠癌组织提取的基因组ＤＮＡ作为模板，进行ＰＣＲ扩增，得到１９个对应１９个外显子序列的ＰＣＲ产物。

将ＰＣＲ产物电泳分离割胶回收，用ＰＣＲ引物作为测序引物，分别进行ＤＮＡ测序，比较正常黏膜组织和大肠癌组织及人类基因组计划的基因组资料Ｉ１号染色体的基因图谱中ＳＮＣｌ９／ＳＴｌ４基因组序列，研究其外显子突变情况。

除第一对引物测序结果不佳外，２—１９对引物测序结果中，大肠正常黏膜组织和大肠癌组织基因组ＤＮＡ及人类基因组计划的基因组资料１ｌ号染色体的基因图谱中ＳＮＣｌ９／ＳＴｌ４基因组序列之间未发现有差异。

综上所述，我们成功地原核表达了ｓＮｃｌ９基因ｃＤＮＡ的部分ＯＲＦ，并获得纯化的ＳＮＣｌ９－ＧＳＴ融合蛋白；成功制各抗ＳＮＣｌ９单克隆抗体ＺＭＧ９，有较高的特异性和敏感性。

用生物信息学方法发现ＳＮＣｌ９蛋白是一种新的ＩＩ型跨膜丝氨酸蛋白酶，其结构上的特点显示该蛋白与细胞表面发生的蛋白水解有关。

在大肠正常黏膜组织与大肠癌组织中的未发现有ＳＮＣｌ９基因突变。

在表达情况的研究中发现ＳＮＣｌ９蛋白在正常消化道及一些管道上皮中高表达，在消化道腺体上皮中低表达；在间皮组织和复层鳞状上皮及间质细胞中无表达。

ＳＮＣｌ９蛋白主要分布在消化道表面上皮，集中在靠近基底膜的细胞浆内和靠近邻近细胞的两侧细胞膜上：在小肠绒毛可观察到从底部到顶部染色逐渐增强的现象，与消化道表面上皮的松解脱落有关。

ＳＮＣｌ９主要表达在消化道表面成熟上皮，在胃和大肠癌中表达与促分化有关，可以作为一种分化指标。

ＳＮＣｌ９和ｍＩ—ｌ的正常与肿瘤组织表达谱基本相同；正常消化道上皮中分布情况一致；上皮细胞内分布情况一致；在上皮中表达有较高的相关性；在正常腺体与不典型增生过渡之间，两者表达一致。

说明ＨＡｌ一１是ＳＮＣｌ９的伴侣蛋白。

与ｕＰＡ和ＭＭＰ不同，ＳＮＣｌ９和｜ＩＡＩ—１只表达在上皮组织，而在间质细胞中无表达，结合蛋白结构上的特点，两者可能是一种新的细胞膜表面蛋白水解酶系统的成员。

ＳＮＣｌ９和ｔｔＡＩ一１在肿瘤组织中表达相关系数较正常组织下降，显示ＳＮＣｌ９和ＨＡＩ一１之间的平衡的破
５
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坏可能与肿瘤发生发展有关。

但是，由于时间和条件所限，我们未能得到ＳＮＣｌ９活性蛋白，未能对ＳＮＣｌ９蛋白的功能作直接的研究。

ＳＮＣｌ９蛋白与其他ＥＣＭ的降解的蛋白酶如金属蛋白酶系统等关系和相互作用还不清楚，其本身的双链活性形式和单链酶原形式及糖基化的存在及作用和调控也尚不清楚。

在临床上尚未找到有关肿瘤转移的直接证据，还需扩大病例，并与生存率结合，研究ＳＮＣｌ９蛋白与肿瘤转移的关系。

研究丝氨酸蛋白酶ＳＮＣｌ９的功能和调控对了解肿瘤转移的机制，防治肿瘤转移
、
中有重要的临床意义。

、Ｌ
ｉ
结论：
１．原核表达ＳＮＣｌ９基因ｃＤＮＡ的部分ＯＲＦ成功，并获得纯化的ＳＮＣｌ９一ＧＳＴ融合蛋白。

２．成功制备抗ＳＮＣｌ９单克隆抗体ＺＭＧ９，有较高的特异性和敏感性。

３．ＳＮＣｌ９蛋白是一种新的ＩＩ型跨膜丝氨酸蛋白酶，其结构上的特点显示该蛋白与细胞表面发生的蛋白水解有关。

４．在大肠正常黏膜组织与大肠癌组织中的未发现有ＳＮＣｌ９基因突变。

５．ＳＮＣｌ９蛋白与消化道上皮细胞松解脱落有关。

６．ＳＮＣｌ９蛋白与促分化有关，可以作为一种分化指标。

７．ＳＮＣｌ９蛋白与ＨＡＩ一１蛋白存在共表达现象，可能是一种新的细胞膜表面蛋白水解酶系统的成员。

８ＳＮＣｌ９和ＨＡｌ—ｌ之间的平衡的破坏可能与肿瘤发生发展有关。

／
【本文台０新点：
～
Ｉ．结合生物信息学和新丝氨酸蛋白酶ＳＮＣｌ９在消化道上皮的特殊分布，首次提出其与消化道上皮细胞松解脱落有关。

２．首次发现ＳＮＣｌ９蛋白与促分化有关，可以作为一种分化指标。

３．证实ＳＮＣｌ９蛋白与ＨＡＩ～ｌ蛋白存在共表达现象，首次提出两者可能是一种新
、
的细胞膜表面蛋白水解酶系统的成员。

√
／
６
————。

一塑望盔堂堕圭兰堡堡苎
关ｇｔｉｇ，丝氨酸蛋白酶，。

ｓＮｃｌ９（ＳＴｌ４）基因，｝ｉＡＩ一１蛋白７蛋白表达纯化，单克隆抗体制各，Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ，生物信息学？ＩＩ型跨膜丝氨酸蛋白酶ｙ免疫组织化学，蛋白表达，肿瘤转移，分化，上皮脱落，ＥＣＭ降解，细胞膜表面蛋白。

水解酶ｏ
７
ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｎｏｖｅｌｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｂｙＳＮＣｌ９（ＳＴｌ４）ｇｅｎｅｉｎｈｕｍａｎｔｉｓｓｕｅｓ
Ａｂｓｔｒａｃｔ
Ｔｕｍｏｒｉｎｖａｓｉｏｎａｎｄｍｅｔａｓｔａｓｉｓａｒｅｔｈｅｍａｉｎｌｙｃａｕｓｅｏｆｃａｎｃｅｒ．ｒｅｌａｔｅｄｄｅａｔｈ．Ｃａｎｃｅｒｍｅｔａｓｔａｓｉｓｒｅｓｕｌｔｓｆｒｏｍｓｅｖｅｒａｌｉｎｔｅｒｄｅｐｅｎｄｅｎｔｐｒｏｃｅｓｓｅｓ．Ｔｈｅｓｅｉｎｃｌｕｄｅ：１）ｄｅｔａｃｈｍｅｎｔｏｆｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｆｒｏｍｔｈｅｉｒｏｒｉｇｉｎａｌｌｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎａｎｄｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｍｉｇｒａｔｉｏｎ．２）ＩｎｖａｓｉｏｎｏｆＣａｎＣｅｒｃｅｌｌｉｎｔｏｔｈｅｓｕｒｒｏｕｎｄｉｎｇｔｉｓｓｕｅ，ｒｅｑｕｉｒｉｎｇａｄｈｅｓｉｏｎｔｏａｎｄｓｕｂｓｅｑｕｅｎｔｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ（ＢＣＭ）ｃｏｍｐｏｎｅｎｔｓ．３）Ａｃｃｅｓｓｏｆ
ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｔｏｂｌｏｏｄａｎｄｌｙｍｐｈａｔｉｃｖｅｓｓｅｌｓ．４）Ａｄｈｅｓｉｏｎｔｏａｎｄｉｎｖａｓｉｏｎ
ｔｈｒｏｕｌｇｈｔｈｅｅｎｄｏｔｈｅｌｉｕｍ，ａｌｌｏｗｉｎｇｃｏｌｏｎｉｚａｔｉｏｎａｔｄｉｓｔａｎｔｓｉｔｅｓｉｎｔｈｅｏｒｇａｎｉｓｍ．Ｔｈｅｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ（ＥＣＭ），ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅｂａｓｅｍｅｎｔｍｅｍｂｒａｎｅａｎｄｉｎｔｅｒｓｔｉｔｉａｌｓｔｒｏｍａ，ａｒｅｃｏｍｐｏｓｅｄｏｆｃｏｌｌａｇｅｎｓ，ｇｌｙｃｏｐｒｏｔｅｉｎｓ（ｓｕｃｈａｓｆｉｂｒｏｎｅｃｔｉｎ，ｌａｍｉｎｉｎ，ａｎｄｅｎｔａｃｔｉｎ／ｎｉｄｏｇｅｎ），ｐｒｏｔｅｏｇｌｙｃａｎｓ，ａｎｄｇｌｙｃｏｓａｍｉｎｏｇｌｙｃａｎｓ．Ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒｍａｔｒｉｘ（ＥＣＭ）ａｎｄｃｅｌｌｕｌａｒｍｉｇｒａｔｉｏｎａｒｅｔｗｏｐｒｏｍｉｎｅｎｔｓｔｅｐｓｏｆｔｕｍｏｒ
Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．Ｍａｔｒｉｘ。

ｄｅｇｒａｄｉｎｇｐｒｏｔｅａｓｅｓ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇｔｈｅ
ｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ—ｐｌａｓｍｉｎｓｙｓｔｅｍｏｆｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｓ，ＭＭＰ一２ａｎｄＭＭＰ一９ｏｆｔｈｅｍａｔｒｉｘｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅａｓｅ（ＭＭＰ）ｆａｍｉｌｙ，ａｎｄｃａｔｈｅｐｓｉｎｓＢ（ａｃｙｓｔｅｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ）ａｎｄＤ（ａｎａｓｐａｒｔｉｃｐｒｏｔｅａｓｅ），ｈａｖｅｂｅｅｎｉｍｐｌｉｃａｔｅｄｉｎｔｕｍｏｒｃｅｌｌｉｎｖａｓｉｏｎ．ＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＥＣＭＯＣＧＨｒｓｉｎｃｌｏｓｅｐｒｏｘｉｍｉｔｙｔｏｔｈｅｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅ，ａｎｄｔｈａｔｍａｔｒｉｘ—ｄｅｇｒａｄｉｎｇｐｒｏｔｅａｓｅｓｍａｓｔｂｅｌｏｃａｌｉｚｅｄｏｎｔｈｅｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｔｏｐｅｒｆｏｒｍｔｈｅｉｒｆｕｎｃｔｉｏｎｓ．ＳＮＣｌ９／ＳＴｌ４ｇｅｎｅｗａｓｆｉｒｓｔｌｙｃｌｏｎｅｄｂｙｓｕｂｔｒａｃｔｉｖｅｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎｍｅｔｈｏｄｂｅｔｗｅｅｎｎｏｒｍａｌｍｕｃｏｓａｃＤＮＡａｎｄｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｍＲＮＡ．Ｗｅｏｂｔａｉｎｅｄ４６ｐｏｓｉｔｉｖｅｃｌｏｎｅｓｆｒｏｍｎｏｒｍａｌｍｕｃｏｓａｌｃＤＮＡｌｉｂｒａｒｙＴｈｅｓｅｑｕｅｎｃｅｄａｔａｒｅｖｅａｌｅｄｔｈａｔｏｎｅｏｆｔｈｅｓｅｃｌｏｎｅｓ，ｎａｍｅｄＳＮＣ１９，ｅｎｃｏｄｅｓａｎｏｖｅｌｈｕｍａｎｇｅｎｅ．ＡｃｃｅｓｓｉｏｎｎｕｍｂｅｒＨＳＵ２０４２８ｗａｓｇｉｖｅｎｂｙＮＣＢＩ
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ｇｅｎｅｂａｎｋｉｎ１９９５，ａｎｄｗａｓｎａｍｅｄｂｙＧｅｎｅＮｏｍｅｎｃｌａｔｕｒｅＣｏｍｍｉｔｔｅｅａｓ
ＳＴ１４（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙＩ４）ｉｎ１９９８．Ｔｈｅｄａｔａｆｒｏｍｈｕｍａｎ
ｇｅｎｏｍｅｐｒｏｊｅｃｔ（ＨＧＰ）ｓｈｏｗｓｔｈａｔＳＮＣｌ９／ＳＴｌ４ｇｅｎｅｃｏｎｔａｉｎｓ１９ｅｘｏｎｓ
ａｎｄ１８ｉｎｔｒｏｎｓｔｈａｔｓｐａｎ５０４２０ｂｐ．Ｔｈｅｆｕｌｌ—ｌｅｎｇｔｈｅＤＮＡｉｓ３１４２ｂｐ，ａｎｄ
ｅｎｃｏｄｅｓａｎ８５５ａｍｉｎｏｐｒｏｔｅｉｎ，ｗｈｉｃｈｃｏｎｔａｉｎｓａｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｄｏｍａｉｎ．
ＬｉｎＣ．Ｙｅｔａｌｆｏｕｎｄａｐｒｏｔｅａｓｅ，ｗｈｉｃｈｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄｆｒｏｍＴ－４７Ｄｂｒｅａｓｔ
ｃａｎｃｅｒｃｅｌｌｓ，ｈａｓｔｈｅｓａｍｅｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆＳＮＣ１９．Ｈｅｃａｌｌｓｔｈｉｓｐｒｏｔｅａｓｅａｓ
Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅｂｅｃａｕｓｅｉｔｈａｓｍａｔｒｉｘ·ｄｅｇｒａｄｉｎｇｆｕｎｃｔｉｏｎ．Ｔａｋｅｕｃｈｉｅｔａｌａｌｓｏ
ｆｏｕｎｄｔｈｉｓｐｒｏｔｅａｓｅａｔｈｕｍａｎＰＣ－３ｐｒｏｓｔａｔｅｓｃａｎｃｅｒｔｕｍｏｒｓａｔｓａｍｅｔｉｍｅ
ａｎｄｎａｍｅｄｔｈｉｓｐｒｏｔｅａｓｅａｓｍｅｍｂｒａｎｅ－ｔｙｐｅｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ１（ＭＴ－ＳＰＩ）．Ｉｔ
ｃａｎａｃｔｉｖａｔｅｕｒｏｋｉｎａｓｅｐｌａｓｍｉｎｏｇｅｎａｃｔｉｖａｔｏｒ（ｕＰＡ）ａｎｄｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈ
ｆａｃｔｏｒ（ＨＧＦ），ｓｕｇｇｅｓｔｉｎｇｉｔｓａｓｓｏｃｉａｔｉｏｎｗｉｔｈｔｉｓｓｕｅｒｅｍｏｄｅｌｉｎｇ，ｃａｎｃｅｒ
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Ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒａｃｔｉｖａｔｏｒｉｎｈｉｂｉｔｏｒｔｙｐｅ１（ＨＡｌ一１）ｗａｓ
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ａｃｔｉｖａｔｏｒｆｒｏｍｔｈｅｃｏｎｄｉｔｉｏｎｅｄｍｅｄｉｕｍｏｆａｈｕｍａｎｓｔｏｍａｃｈｃａｒｃｉｎｏｍａｃｅｌｌ
ｌｉｎｅＩｔｉｓａＫｕｎｉｔｚ－ｔｙｐｅｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒａｎｄｃａｎｉｎｈｉｂｉｔＭａｔｒｉｐｔａｓｅ
（ＳＮＣ１９）’Ｓｃｌｅａｖａｇｅａｃｔｉｖｉｔｙ．Ａｐｒｏｔｅｉｎｃｏｍｐｌｅｘｆｒｏｍｈｕｍａｎｍｉｌｋｃｏｎｔａｉｎｓ
ＭａｔｒｉｐｔａｓｅａｎｄＨＡｌ－１．
ＴｏｓｔｕｄｙｔｈｅｓｔｒｕｃｔｕｒｅａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｔｈｅｐｒｏｔｅｉｎｅｎｃｏｄｅｄｂｙＳＮＣ１９
（ＳＴｌ４），ｗｅｍａｋｅｔｈｉｓｓｔｕｄｙ：１）ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＮＣｌ９ｇｅｎｅＯＲＦｉｎＥｃｏｌｉ
ａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＧＳＴｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ．２）Ｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅ
ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔＳＮＣ１９ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙｗｅｓｔｅｒｎｂｏｌｔ
３）ＡｎａｌｙｓｉｓｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＳＮＣ１９ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｐｒｅｄｉｃｔｉｔｓｆｕｎｃｔｉｏｎｕｓｉｎｇ
ｂｉｏｉｎｆｏｒｍａｔｉｃｓｍｅｔｈｏｄｓ．４）ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＳＮＣ１９ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｉｔｓ
ｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＨＡｌ－１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｎｏｒｍａｌａｎｄｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅｓ．５）
９
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ＤｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｍｕｔａｔｉｏｎｉｎＳＮＣ１９ｇｅｎｅｂｅｔｗｅｅｎｎｏｒｍａｌｃｏｌｏｒｅｃｔａｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｓ
１１ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＮＣｌ９ｇｅｎｅＯＲＦｉｎＥ．ｃｏｌｉａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＧＳＴｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ：
ＴｏｏｂｔａｉｎｅｎｏｕｇｈａｍｏｕｎｔｏｆＳＮＣｌ９ｐｒｏｔｅｉｎｆｏｒｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｉｅｓ，ＳＮＣｌ９ｇｅｎｅｐａｒｔ—ｌｅｎｇｔｈＯＲＦ，ａｍｐｌｉｆｉｅｄｂｙＰＣＲ，ｗａｓｃｌｏｎｅｄｉｎｔｏｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｖｅｃｔｏｒｐＧＥＸ一４Ｔ－２，ａｎｄｔｈｅｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＥ．ｃｏｌｉ．ＢａｍＨ１ａｎｄＮｏｔＩｒｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎａｎａｌｙｓｉｓａｎｄＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｓｈｏｗｅｄｔｈｅＳＮＣ１９ｐａｒｔ·ｌｅｎｇｔｈＯＲＦ／ｐＧＥＸ－４Ｔ一２ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｐｌａｓｍｉｄｗａｓｃｏｎｓｔｒｕｃｔｅｄｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙｗｉｔｈｃｏｒｒｅｃｔｓｅｑｕｅｎｃｅ．ＳＤＳ—ＰＡＧＥｉｎｄｉｃａｔｅｄｔｈａｔＳＮＣ１９－ＧＳＴｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｅｘｐｒｅｓｓｅｄｉｎＥ．ｃｏｂａｓｅｘｐｅｃｔｅｄａｔ５８ｋｄａ．Ｔｈｅｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ．ｗａｓｐｕｒｉｆｉｅｄｂｙＳＤＳ－ＰＡＧＥｅｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓ．Ａｂｏｕｔ５．５ｍｇＳＮＣ１９－ＧＳＴｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄ
２）ＰｒｅｐａｒａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｍｏｎｏｅｌｏｎａｉａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔＳＮＣｌ９ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｃｏｎｆｉｒｍｅｄｂｙｗｅｓｔｅｒｎｂｏｌｔ
ＴｏｐｒｅｐａｒｅｔｈｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔＳＮＣ１９ｐｒｏｔｅｉｎ，ＢＡＬＢ／ＣｍｉｃｅｗｅｒｅｉｍｍｕｎｉｚｅｄｗｉｔｈｔｈｅｐｕｒｉｆｉｅｄＳＮＣ１９－ＧＳＴｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ．ＯｎｅｃｅｌｌｓｔｒａｉｎＺＭＧ９ｗａｓｓｃｒｅｅｎｅｄｏｕｔｕｓｉｎｇＳＮＣ１９－ＧＳＴｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎ，ＧＳＴｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＥ．ｃｏｉｌｂａｃｔｅｒｉａｌｙｓａｔｅｓａｎｄｗａｓｏｂｔａｉｎｅｄｂｙｈｙｂｒｉｄｏｍａｔｅｃｈｎｉｑｕｅ．Ｗｅｓｔｅｒｎｂｏｌｔｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ５８ｋｄａＳＮＣｌ９ｐａｒｔ—ｌｅｎｇｔｈＯＲＦ—ＧＳＴｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｈｅｔｒａｎｓｆｏｒｍｅｄＥ．ｃｏｌｉｌｙｓａｔｅｓｕｓｉｎｇａｎｔｉ－ＧＳＴｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｔｔｈｅｓａｍｅｔｉｍｅＷｅｓｔｅｒｎｂｏｌｔａｌｓｏｃｏｎｆｉｒｍｅｄｔｈａｔｔｈｅａｎｔｉｂｏｄｙｓｐｅｃｉｆｉｃａｌｌｙｒｅｃｏｇｎｉｚｅｄ１１０ｋｄａＳＮＣ１９ｆｕｌｌ－ｌｅｎｇｔｈＯＲＦ·ＧＳＴｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎｔｈａｔｗａｓｏｆｆｅｒｅｄｂｙＳｈｉＹｉｎｇ．ＴｈｅｔｏｔａｌｐｒｏｔｅｉｎｓｅｘｔｒａｃｔｅｄｆｒｏｍｎｏｒｍａｌｔｉｓｓｕｅｓｏｆｃｏｌｏｎａｎｄｔｈｅｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅｓｏｆｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｗｅｒｅａｌｓｏｄｅｔｅｃｔｅｄＳＮＣ１９
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ｐｒｏｔｅｉｎｂｙＷｅｓｔｅｒｎｂｏｌｔ．
３１ＳｔｒｕｃｔｕｒｅａｎａｌｙｓｉｓａｎｄｆｕｎｃｔｉｏｎｐｒｅｄｉｃｔｉｏｎｏｆＳＮＣｌ９ｐｒｏｔｅｉｎ：
ｎｅｕｒａｌ－ｎｅｔｗｏｒｋｓｍｅｔｈｏｄｐｒｅｄｉｃｔｅｄｔｈｅＳｅｃｏｎｄａｒｙｓｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＳＮＣ１９ｐｒｏｔｅｉｎ；Ｋｙｔｅ＆ＤｏｏｌｉｔｔｌｅＭｅｔｈｏｄａｎｄＪａｎｉｎＭｅｔｈｏｄａｎａｌｙｚｅｄｉｔｓｈｙｄｒｏｐｈｏｂｉｃｆｅａｔｕｒｅ．ＨｉｄｄｅｎＭａｒｋｏｖＭｏｄｅｌｐｒｅｄｉｃｔｅｄｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｓｅｇｍｅｎｔｏｆｔｈｉｓｐｒｏｔｅｉｎ．ＡｍｉｎｏａｃｉｄｓｅｑｕｅｎｃｅｓｗｅｒｅｓｃａｎｎｅｄａｇａｉｎｓｔＰＲＯＳＩＴＥ，ＳＷＩＳＳ－ＰＲＯＴａｎｄＰＤＢｔｏａｎａｌｙｓｉｓｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆＳＮＣ１９ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅｒｅａｒｅｍｏｒｅｃｏｉｌｓ（６１．５２％。

５２６／８５５）ａｎｄｆｅｗｅｒａ—ｈｅｌｉｃｅｓ（７．Ｏ％，６０／８５５）ｗｈｉｃｈａｒｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｅｄａｔＮ－ｔｅｒｍｉｎａｌｍａｉｎｌｙｉｎＳＮＣ１９ｐｒｏｔｅｉｎ．Ｔｈｅｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｓｅｇｍｅｎｔｌｏｃａｌｉｚｅｄｗｉｔｈｉｎ５５－７７ａｍｉｎｏａｃｉｄｓ．ＳＮＣ１９ｐｒｏｔｅｉｎｓｈｏｗｓｅｘｔｒｅｍｅｌｙｈｉｇｈｈｏｍｏｌｏｇｙ（８６％）ｗｉｔｈａｎｏｖｅｌｍｏｕｓｅｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｅｐｉｔｈｉｎ，ａｎｄｈａｓｔｗｏＣＵＢｄｏｍａｉｎｓａｎｄｆｏｕｒＬＤＬＲｄｏｍａｉｎｓａｎｄａｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｄｏｍａｉｎ．ＳＮＣ１９ｐｒｏｔｅｉｎｂｅｌｏｎｇｓｔｏａｎｅｗｃｌａｓｓｏｆｃｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓｅｎｚｙｍｅｓ，ｔｈｅｔｙｐｅＩＩｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｓ（ＴＴＳＰｓ）．ＩｔｓｓｔｒｕｃｔｕｒｅｉｍｐｌｉｅｄｔｈａｔＳＮＣ１９ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓａｃｔｉｖｉｔｉｅｓａｔｅｅｌｌｓｕｒｆａｃｅ
４、ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＳＮＣｌ９ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＨＡｌ·１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｎｏｒｍａｌａｎｄｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅｓ：
ＲＴ—ＰＣＲｍｅｔｈｏｄｗａｓａｐｐｌｉｅｄｔｏａｎａｌｙｚｅｔｈｅＳＮＣ１９ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｂｏｔｈｃａｎｃｅｒｏｕｓａｎｄｎｏｒｍａｌｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｔｉｓｓｕｅｓ．Ｉｎｏｕｒｓｔｕｄｙ，ｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＮＣｌ９ｉｎｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｓｗａｓｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｌｙｌｏｗｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｎｏｒｍａｌｔｉｓｓｕｅ（Ｐ＜Ｏ．０５）．ＮｏｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｒｅｌａｔｉｏｎｓｈｉｐｗａｓｏｂｓｅｒｖｅｄｂｅｔｗｅｅｎｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆＳＮＣ１９ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄＤｕｋｅｓ’ｓｔａｇｉｎｇｏｆｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒ，ａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅｒｅｇｉｏｎａｌｌｙｍｐｈｎｏｄｅｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．ＷｅｆｏｕｎｄｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＮＣ１９ｐｒｏｔｅｉｎｉｎｔｈｅｓｕｒｆａｃｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｌａｙｅｒｏｆｎｏｒｍａｌｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｔｒａｃｔ
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．，＆●；
ｔｉｓｓｕｅｓｂｙｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ＷｅｄｅｔｅｃｔｅｄＳＮＣｌ９ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｅｄ
ｍａｉｎｌｙｉｎｔｈｅｓｕｐｅｒｆｉｃｉａｌｏｆｔｈｅｃｏｌｏｎｅｐｉｔｈｅｌｉａ．Ｗｅａｋｐｏｓｉｔｉｖｅｓｔａｉｎｉｎｇ
ｓｉｇｎａｌｃｏｕｌｄｂｅｄｅｔｅｃｔｅｄｉｎｃｒｙｐｔｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌａｎｄｎｅｇｅｔｉｖｅｓｔａｉｎｉｎｇｉｎ
ｓｔｒｏｍａ［ｃｅｌｌ．Ｉｎｔｈｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｌａｙｅｒｏｆｔｈｅｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｕｐｐｅｒｖｉｌｌｉ，ｗｅ
ｆｏｕｎｄｓｔｒｏｎｇｅｒｐｏｓｉｔｉｖｅｓｔａｉｎｉｎｇｏｆＳＮＣ１９ｐｒｏｔｅｉｎｔｈａｎｔｈｅｏｔｈｅｒｐａｒｔｏｆ
ｖｉｉｉｉ．ＩｎｔｈｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｅｌｌｔｈｅＳＮＣｌ９ｐｒｏｔｅｉｎｗａｓｌｏｃａｌｉｚｅｄｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙｏｎ
ｔｈｅｂａｓｏｌａｔｅｒａｌｓｉｄｅａｎｄｍｅｍｂｒａｎｅｂｏｒｄｅｒ．Ｔｈｅｐｒｏｍｉｎｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆ
ＳＮＣｌ９ｉｎｔｈｅｎｏｒｍａｌｓｕｒｆａｃｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｌａｙｅｒｏｆｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｔｒａｃｔ，
ｗｈｅｒｅｍａｔｕｒｅｃｅｌｌｓａｒｅｌｏｏｓｅｌｙａｔｔａｃｈｅｄｔｏｔｈｅｂａｓｅｍｅｎｔｍｅｍｂｒａｎｅａｎｄ
ｓｈｅｄｉｎｔｏｔｈｅｌｕｍｅｎ，ｉｍｐｌｉｅｄＳＮＣ１９ｍｉｇｈｔｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｃｅｌｌｌｏｏｓｅｎｅｓｓ
ａｎｄｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｕｒｎｏｖｅｒ．Ｏｆ５２ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｔｅｓｔ，３２（６１．５３％）ｗｅｒｅ
ｐｏｓｉｔｉｖｅｆｏｒＳＮＣ１９ａｎｄｈａｖｅｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎｈｉｓｔｏｌｏｇｉｃａｌ
ｇｒａｄｅ：７４．２％（２３／３１）ｉｎｗｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ，５７．１％（８／１４）ｉｎｍｏｄｅｒａｔｅａｎｄ
１２．５％（１／８）ｉｎｐｏｏｒ（Ｐ＜０．０１）．ｉｔｗａｓａｌｓｏｆｏｕｎｄｉｎ３７ｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒ，
３８．９％（１４１３６）ｐｏｓｉｔｉｖｅｉｎｔｏｔａｌ，７７．８％（７／９）ｉｎｗｅｌｌｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄ，５０％
（５／１０）ｉｎｍｏｄｅｒａｔｅａｎｄ１１８％（２／１７）ｉｎｐｏｏｒｒＰ＜０．０１）．Ｔｈｅｒｅａｒｅｎｏ
ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｔｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗａｓｆｏｕｎｄｂｅｔｗｅｅｎｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒ５８．６％（１８／３１）．
ｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒ３８５％（１０／２６）．ｗｉｔｈｌｙｍｐｈｎｏｄｅｍｅｔａｓｔａｓｉｓａｎｄｃｏｌｏｒｅｃｔａｌ
ｃａｎｃｅｒ６６．７％（１４／２１）．ｇａｓｔｒｉｃｃａｎｃｅｒ４４．４％（４／９）ｗｉｔｈｎｏｌｙｍｐｈｎｏｄｅ
ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ．ＳＮＣ１９ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＨＡＩ－１ｐｒｏｔｅｉｎｈａｖｅｔｈｅｓａｍｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ
ｐａｔｔｅｒｎｉｎｍａｎｙｎｏｒｍａｌｔｉｓｓｕｅｓ，ａｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｂｙｔｈｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔ
ｏｆｔｈｅｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄｎｏｔｂｙｓｔｒｏｍａｌｅｌｅｍｅｎｔｓ，ｗａｓｌｏｃａｌｉｚｅｄｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙｏｎｔｈｅ
ｂａｓｏｌａｔｅｒａｌｓｉｄｅａｎｄｍｅｍｂｒａｎｅｂｏｒｄｅｒ．Ｂｕｔｉｎｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅｓ，ｔｈｅ
ｃｏ—ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｓｄｅｃｒｅａｓｅ．ＨＡｌ－１ｍａｙｂｅｔｈｅｐａｒｔｎｅｒｐｒｏｔｅｉｎｏｆＳＮＣｌ９．
５１ＤｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｍｕｔａｔｉｏｎｉｎＳＮＣｌ９ｇｅｎｅｂｅｔｗｅｅｎｎｏｒｍａｌ
ｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｃｏｌｏｒｅｅｔａｌｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｎｅｓ：
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ＷｅｕｓｅＰＣＲ－ＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｉｎｇｔｏｄｅｔｅｃｔｐｏｔｅｎｔｉａｌｍｕｔａｔｉｏｎｉｎＳＮＣ１９ｇｅｎｅｂｅｔｗｅｅｎｎｏｒｍａｌｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｃｏｔｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｓ．Ａｓｒｅｓｕｌｔｓ，ｗｅｆｏｕｎｄｎｏｍｕｔａｔｉｏｎｉｎ２－１９ｅｘｏｎｓＤＮＡｓｅｑｕｅｎｃｅｂｅｔｗｅｅｎ４ｃａｓｅｓｎｏｒｍａｌｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｓ，ａｃｃｏｒｄｗｉｔｈｔｈｅｇｅｎｅｍａｐｏｆ１１ｃｈｒｏｍｏｓｏｍｅｏｆｔｈｅｄａｔａｆｒｏｍｈｕｍａｎｇｅｎｏｍｅｐｒｏｊｅｃｔ（ＨＧＰ）．
ＷｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄＳＮＣ１９ｇｅｎｅＯＲＦｉｎＥ．ｃｏｉｌａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｅｄｏｆｔｈｅＧＳＴｆｕｓｉｏｎｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｐｒｅｐａｒａｔｅｄｔｈｅｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙａｇａｉｎｓｔＳＮＣｌ９ｐｒｏｔｅｉｎｓｕｃｃｅｓｓｆｕｌｌｙ．ＷｅａｌｓｏａｎａｌｙｚｅｄｔｈｅＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＳＮＣ１９ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｐｒｅｄｉｃｔｅｄｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｉｔ．ＵｓｉｎｇＲＴ－ＰＣＲｍｅｔｈｏｄａｎｄ
ｉｍｍｕｎｏｈｉｓｔｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ．ｗｅｓｔｕｄｙｔｈｅｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆＳＮＣ１９ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄｉｔｓｒｅｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎＨＡｌ－１ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｉｎｈｕｍａｎｎｏｒｍａｌａｎｄｔｕｍｏｒｔｉｓｓｕｅｓ．Ｆｉｎａｌｌｙ，ｗｅｄｅｔｅｃｔｅｄｔｈｅｐｏｔｅｎｔｉａｌｍｕｔａｔｉｏｎｉｎＳＮＣｌ９ｇｅｎｅｂｅｔｗｅｅｎｎｏｒｍａｌｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｔｉｓｓｕｅｓａｎｄｃｏｌｏｒｅｃｔａｌｃａｎｃｅｒｔｉｓｓｕｅｓ．Ｉｎｔｈｉｓｗｏｒｋ，ｗｅｆｏｕｎｄ：
１）ＴｈｅｐｒｏｍｉｎｅｎｔｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＮＣｌ９ｉｎｔｈｅｎｏｒｍａｌｓｕｒｆａｃｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｌａｙｅｒｏｆｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｔｒａｃｔ，ａｎｄｔｈｅｆａｃｔｔｈａｔｉｔｗａｓｌｏｃａｌｉｚｅｄｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙ
ｔｈｅｂａｓｏｌａｔｅｒａｌｓｉｄｅａｎｄｍｅｍｂｒａｎｅｂｏｒｄｅｒ，ａｎｄｉｔ’ｓｐｒｏｔｅｉｎＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｎ
ｉｍｐｌｉｅｄＳＮＣｔ９ｍｉｇｈｔｂｅｉｎｖｏｌｖｅｄｉｎｃｅｌｌｌｏｏｓｅｎｅｓｓａｎｄｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｔｕｒｎｏｖｅｒ２）ＴｈｅｈｉｇｈｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＳＮＣ１９ｉｎｗｅｌｌ—ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｅｄｇａｓｔｒｏｉｎｔｅｓｔｊｎａｌｃａｎｃｅｒａｎｄｎｏｒｍａｌｍａｔｕｒｅｃｅｌｌｉｎｄｉｃａｔｅｄＳＮＣｌ９ｍｉｇｈｔｂｅａｍａｒｋｅｒｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ．
３）ＳＮＣｌ９ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＨＡｌ一１ｐｒｏｔｅｉｎｈａｖｅｔｈｅｓａｍｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｐａｔｔｅｒｎｉｎｍａｎｙｎｏｒｍａｌｔｉｓｓｕｅｓ，ａｒｅｅｘｐｒｅｓｓｅｄｂｙｔｈｅｅｐｉｔｈｅｌｉａｌｃｏｍｐｏｎｅｎｔｏｆｔｈｅｔｉｓｓｕｅ，ａｎｄｎｏｔｂｙｓｔｒｏｍａｌｅｌｅｍｅｎｔｓ，ｗａｓｌｏｃａｌｉｚｅｄｅｘｃｌｕｓｉｖｅｌｙｏｎｔｈｅｂａｓｏｌａｔｅｒａｌｓｉｄｅａｎｄｍｅｍｂｒａｎｅｂｏｒｄｅｒ．ＳＮＣｌ９ｐｒｏｔｅｉｎａｎｄＨＡｌ－１ｐｒｏｔｅｉｎ
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ｆ＿
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ｍａｙｂｅｔｗｏｍｅｍｂｅｒｏｆａｎｅｗＣｅｌｌｓｕｒｆａｃｅｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓｐｒｏｔｅａｓｅｓｙｓｔｅｍ．
Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅｉｎ；ＳＮＣｌ９（ＳＴｌ４）ｇｅｎｅ；ＨＡｌ—１ｐｒｏｔｅｉｎ；ｐｒｏｔｅｉｎｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎａｎｄｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ；ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌａｎｔｉｂｏｄｙｐｒｅｐａｒａｔｉｏｎ；ｉｍｍｕｎｏｃｈｅｍｉｃａｌｓｔａｉｎｉｎｇ；ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ；ｐｒｏｔｅｉｎｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ：
ｔｕｍｏｒｍｅｔａｓｔａｓｉｓ；ＤｅｇｒａｄａｔｉｏｎｏｆｔｈｅＥＣＭ；ｄｉｆｆｅｒｅｎｔｉａｔｉｏｎ
ｔｙｐｅＩＩ
ｔｒａｎｓｍｅｍｂｒａｎｅｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅｓＣｅｌｌｓｕｒｆａｃｅ
ｐｒｏｔｅｏｌｙｓｉｓ
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前言
恶性肿瘤是严重危害人类健康的疾病之一，近年来随着生活水平的提高，社会老龄化的发展，恶性肿瘤的发病率和死亡率都呈明显升高趋势。

随着医疗水平的提高，恶性肿瘤的治疗取得了很大的进展，但是，转移和复发是肿瘤治疗失败的最主要原因。

目前认为恶性肿瘤的发生发展是多阶段的过程，从正常细胞、癌前病变、原位癌到恶性肿瘤的侵袭和转移，在此过程中，细胞内发生了许多分子水平的变化，最终导致形态上明显可见的表型改变。

肿瘤转移是恶性肿瘤最重要的特征之一，也是一个多阶段的、序贯连续的复杂过程，大致分为几个阶段：ｌ，肿瘤细胞脱离原发瘤；２，肿瘤细胞穿过基底膜，发生组织浸润，并进入血管或淋巴管；３，在血管或淋巴管中转运、黏附和侵入靶组织；４，在靶组织生长、血管增生、形成转移灶。

每个阶段均受不同的基因调控，或被激活，或被抑制，相互协同或拮抗，最终影响肿瘤细胞的生物学特性“１。

这是肿瘤细胞和宿主双方相互作用的结果，一方是由于肿瘤细胞自身的特性即其具有能顺利通过上述几个阶段能力，另一方是宿主的免疫防御机制对肿瘤细胞的选择。

事实上在同一癌肿组织中具有多种不同性质的肿瘤细胞，只有很小的一部分具有高转移能力的肿瘤细胞才能完成转移过程。

这些具有高转移能力的肿瘤细胞在基因水平和蛋白水平都具有其特殊之处。

这个复杂过程涉及到很多基因和蛋白的调控。

目前所知的转移相关基因和蛋白包括ＥＧＦ、ＶＥＧＦ、ＡＭＦ、ＴＧＦ、ｕＰＡ、ＭＭＰｓ／ＴＩＭＰｓ、Ｓ１ｅＸ、Ｓ１ｅＡ、ＣＤ４４及ｍａｓｐｉｉ＂１、ＯＰＮ等。

研究高转移肿瘤细胞中特有基因和蛋白功能及其作用机制是目前的研究热点之一。

关于大肠癌的发生过程，一般认为是大肠黏膜腺体底部生发中心的干细胞生长失调，处于高增生状态，进而发展成为腺瘤，并由腺瘤进一步演变为癌。

这就是大肠癌发生的腺瘤一癌演变学说。

也有人认为有部分癌是由生发中心的干细胞直接演变为癌而不经过腺瘤阶段。

在大肠癌发生发展和转移过程中，现已明确包括癌基因、抑癌基因、错配修复基因，去甲基化等多种因素以不同的机
】５
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制在不同阶段影响肿瘤的发生与进展。

大肠癌的浸润转移符合肿瘤浸润转移的基本规律，但在大肠癌的远处转移中，肝转移发生率高达５０９６。

肝转移的高发率，除类同其他肝转移的机制外，是否存在肿瘤类别特异性还不清楚。

其生物学过程十分复杂，包括癌细胞所分泌的蛋白对细胞外基质的降解，经静脉回流至肝脏后，可能通过特异的受体和配体使大肠癌细胞较其它消化道肿瘤更易在肝脏发生停留和黏附。

大肠癌在转移上的特殊性决定其可能在转移的基因调控也有其特点，但确切的发生机理至今仍不甚清楚。

细胞外基质ＥＣＭ包括基底膜和间隙间质，主要是由胶原（有１４型），糖蛋白和蛋白多糖等一些物质组成，具有维持细胞组织形态的作用，是细胞间相互作用的重要场所“１。

ＥＣＭ的降解与机体发育过程中细胞的迁移，脱落，炎症过程中免疫细胞的游走，以及一些重要的生理过程有关，是机体内部重要的生理调节方式。

在肿瘤细胞的浸润和转移过程中，肿瘤细胞必须首先要通过ＥＣＭ的降解，才能发生肿瘤细胞的浸润和迁移，并转移到他处。

因此，肿瘤浸润和转移与ＥＣＭ的降解有极其重要关系”１。

研究发现，ＥｃＭ的降解与多种蛋白酶有关，其中包括丝氨酸蛋白酶家族中的纤维蛋白溶酶原和纤维蛋白溶酶系统，金属蛋白酶系统中的姗Ｐ一２和姗Ｐ一９（ｍｅｔａｌｌｏｐｒｏｔｅｉｎａｓｅｓ），组织蛋白酶Ｂ，组织蛋白酶Ｄ，以及其他一些蛋白水解酶如透明质酸酶，胶原酶等。

ＥｃＭ的降解受到多种酶系统如ｕＰＡ一纤维蛋白溶酶系统，金属蛋白酶系统的调控“１。

但是，ＥｃＭ的降解过程和酶的调控过程尚不清楚，有待进一步研究。

ＳＮＣｌ９（ＳＴｌ４）基因是我所应用减数杂交技术筛选出的大肠癌新相关基因之一””。

通过制备正常肠粘膜ｅＤＮＡ减同一个体癌组织的ｍＲＮＡ的减式ｅＤＮＡ探针，从正常大肠ｃＤＮＡ文库中筛选出６８个阳性克隆，经过序列分析，与Ｇｅｎｂａｎｋ所收录的基因序列比对，发现６８个阳性克隆来自４６个不同的基因。

ＳＮＣｌ９基因是其中同源性很低的基因之一，在１９９５年被Ｇｅｎｂａｎｋ作为新基因录入，并给予登录检索号ＨＳＵ２０４１８。

１９９８年国际基因命名委员会命名ＳＮＣｌ９为
ＳＴｌ４（ｓｕｐｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｔｕｍｏｒｉｇｅｎｉｃｉｔｙ１４）基因。

研究表明，ＳＮＣｌ９基因的
】６
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基因组ＤＮＡ全长为５０４２０ｂｐ，共有１９个外显子及１８个内含子，荧光原位杂交结果显示，该基因定位于１ｌｑ２４～２５区。

ＳＮＣｌ９／ＳＴｌ４基因ｃＤＮＡ全长为３１４２ｂｐ，ＯＲＦ编码８５５个氨基酸。

在人类基因组计划的基因组资料１１号染色体的基因图谱中已将ＳＮＣｌ９／ＳＴｌ４基因收录。

根据ＳＮＣｌ９基因编码的氨基酸序列分析发现，ＳＮＣｌ９基因编码蛋白序列内含胰蛋白酶样功能区，与一新的４、鼠丝氢酸蛋白酶ｅｐｉｔｈｉｎ同源性较高．是一种新的人类丝氨酸蛋白酶。

在国外的～些实验室先后通过不同途径发现了与ＳＮＣｌ９基因序列一致的蛋白，并各自命名。

美国的ＬｉｎＣ．Ｙ等在人的一种乳腺癌细胞系的培养液中分离到一种新的丝氨酸蛋白酶，经氨基酸序列分析，Ｇｅｎｂａｎｋ基因序列比对，证实与ＳＮＣｌ９基因相同“１。

１９９９年，他们发现这种丝氨酸蛋白酶具有降解细胞外基质的作用，将其称为Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ。

１。

美国的Ｔａｋｅｕｃｈｉ等在人前列腺癌细胞中发现并命名为
ｍｅｍｂｒａｎｅ—ｔｙｐｅｓｅｒｉｎｅｐｒｏｔｅａｓｅ１（ＭＴ—ＳＰＩ）…１。

在研究中发现，Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ具有降解细胞外基质的作用，并能激活ｕＰＡ前体及ＨＧＦ／ＳＦ前体“”。

肿瘤的浸润和转移离不开细胞外基质的降解和细胞的迁移。

Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ可能是通过激活ｕＰＡ及ＨＧＦ／ｓＦ，以及自身的降解ＥＣＭ的作用来影响肿瘤细胞的生长和转移。

肝细胞生长因子激动子抑制因子ＨＡｌ一Ｉ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ
ａｃｔｉｖａｔｏｒｉｎｈｉｂｉｔｏｔ），１９９７年首先在胃癌细胞系ＭＫＮ４５的无血清培养基中分离、纯化并鉴定，为一类新的Ｋｕｎｉｔｚ型丝氨酸蛋白酶抑制因子，可特异性地抑制ＨＧＦＡ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒａｃｔｉｖａｔｏｒ，ＨＧＦＡ）激活ＩｔＧＦ（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｇｒｏｗｔｈｆａｃｔｏｒ，ＨＧＦ）／散射因子（ｓｃａｔｔｅｒｅｄｆａｃｔｏｒ，ＳＦ）前体““，在肿瘤的形成、肿瘤细胞的浸润和转移、分化及肿瘤血管形成过程中可能有重要调节作用。

其与Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ在生理条件下在人乳中以复合蛋白的形式存在，并能抑制Ｍａｔｒｉｐｔａｓｅ降解细胞外基质ＥｃＭ功能。

为进～步研究ＳＮＣｌ９（ＳＴｌ４）蛋白的功能，以及其在肿瘤转移中的可能作用，本实验在核酸水平的研究基础上设计：ｌ，将ＳＮＣ］９（ＳＴｌ４）基因克隆到原核表达质粒，表达纯化ＳＮＣｌ９（ＳＴｌ４）一ＧＳＴ融合蛋白；２，用ＳＮＣｌ９（ＳＴｌ４）－ＧＳＴ融合蛋白
１７
浙江大学博士学位论文
免疫小鼠，按杂交瘤技术制备ＳＮＣｌ９（８Ｔ１４）蛋白单克隆抗体；３，利用生物信息学方法进行ＳＮＣｌ９（ＳＴｌ４）蛋白的结构预测和功能分析：４，在ｍＲＮＡ水平用ＲＴ－ＰＣＲ的方法研究在正常大肠黏膜及相应肿瘤组织中表达；在蛋白水平应用免疫组织化学方法研究正常消化道与相应肿瘤组织表达分布情况，并研究在其他肿瘤中表达的情况，同时研究ＳＮＣｌ９蛋白与其相关蛋白｝｛ＡＩ—ｌ蛋白在组织表达中的关系；５，用ＰＣＲ—ＤＮＡ序列分析的方法比较正常大肠黏膜及相应肿瘤组织中
ＳＮＣｌ９（ＳＴｌ４）基因组ＤＮＡ外显子序列的差异分析ＳＮＣｌ９（ＳＴｌ４）基因突变情况。

参考文献：
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】８
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１９
第一部分￥ＮＣｌ９原棱表达质粒的构建及融合蛋白的表达
摘要。

目的：原核表达ＳＮＣｌ９基因ｃＤＮＡ的部分ＯＲＦ，获得纯化ＳＮＣｌ９－ＧＳＴ融合蛋白。

方法：将部分ＳＮＣｌ９基因ｃＤＮＡＯＲＦ经ＰＣＲ扩增和亚克隆，与ＧＳＴ融合蛋白原核表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ２重组构建ＳＮＣｌ９ｃＤＮＡ／ｐＧＥＸ４Ｔ２表达质粒。

将ＳＮＣｌ９ｃＤＮＡ／ｐＧＥＸ４Ｔ２袭达质粒转化Ｅ．ｃｏｌｉＰ２３９２细菌，以ＩＰＴＧ诱导表达ＳＮＣｌ９－ＧＳＴ融合蛋白。

用制备型的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ割胶、电洗脱回收纯化ＳＮＣｌ９一ＧＳＴ融合蛋白。

结果：ＰＣＲ扩增ＳＮＣｌ９基因ｃＤＮＡ的部分ＯＲＦ结果为９００ｂｐ，经ＤＮＡ测序证实。

ＢａｍＨＩ和ＮｏｔＩ酶双酶切证实ＳＮＣｌ９ｃＤＮＡＯＲＦ正确克隆在ｐＧＥＸ４Ｔ２多克隆位点。

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ凝胶电泳证实ＩＰＴＧ诱导表达ＳＮＣｌ９－ＧＳＴ融合蛋白，大小为５８ｋｄａ。

ＳＮＣｌ９一ＧＳＴ融合蛋白主要表达在诱导表达菌沉淀，用制备型的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ割胶、电洗脱回收纯化ＳＮＣｌ９－ＧＳＴ融合蛋白。

以浓度梯度标准ＢＳＡ测定回收融合蛋白浓度，共制备融合蛋白抗原约５．５ｍｇ。

结论：ＳＮＣｌ９基因ｃＢＮＡ的部分ＯＲＦ原核表达成功，并获得纯化的ＳＮＣｌ９一ＧＳＴ融合蛋白。

ＳＮＣｌ９基因ｃ／）ＮＡ全长为３１４２ｂｐ，本实验将ＳＮＣｌ９基因ｃＤＮＡ的部分ＯＲＦ克隆到原核表达载体ｐＧＥＸ４Ｔ２中，构建了ＳＮＣｌ９基因基因的原核表达质粒，并转化Ｅ．ｃｏｌｉ菌高效表达，用制备型的ＳＤＳ—ＰＡＧＥ割胶、电洗脱回收￥ＮＣｌ９一ＧＳＴ融合蛋白，以ＳＤＳ—ＰＡＧＥ鉴定回收的融合蛋白；ＳＮＣｌ９基因原核表达系统的建立及ＳＮＣｌ９一ＧＳＴ融合蛋白的成功表达和回收，为制备抗ＳＮＣｌ９蛋白单克隆抗体、建立ＳＮＣｌ９蛋白的检测系统，进一步从蛋白质水平研究ＳＮＣｌ９的表达创造条件。

一、材料和方法：
１，材料：
１．１质粒和菌株ｔ
亚克隆载体ｐＧＥＭ－ＴＥａｓｙ质粒（Ｐｒｏｍｅｇａ公司），ＧＳＴ融合蛋白原核表达载
２０
体ｐＧＥＸ一４Ｔ一２（Ｐｈａｒｍａｃｉａ公司），大肠杆菌菌株Ｐ２３９２（浙江大学肿瘤研究所保存），Ｔｃａ８１１３细胞系（浙江大学肿瘤研究所保存）。

Ｉ．２主要试剂；
１．２．１分子亚克隆所用试剂
ＰＣＲ引物（上海生工生物工程公司），ＰＣＲ扩增试剂盒（Ｐｒｏｍｅｇａ公司），逆转录酶（ＡＭＶ）（Ｐｒｏｍｅｇａ公司），ｏｌｉｇｏ（ｄｔ）（Ｐｒｏｍｅｇａ公司），ＤＮＡ测序引物（上海生工生物工程公司），ＤＮＡ测序试剂盒（ＰＥ公司），Ｔ４ＤＮＡ连接酶（Ｐｒｏｍｅｇａ公司），ＢａｍＨＩ酶（ＧｉｂｃｏＢＲＬ公司），ＮｏｔＩ酶（ＯｉｂｃｏＢＲＬ公司），ＤＮＡ回收试剂盒（Ｐｒｏｍｅｇａ公司），琼脂糖（ａｇａｒｏｓｅ）（上海生工生物工程公司），溴化乙锭（ＥＢ）（Ｓｉｇｍａ公司），＾ＤＮＡ／ＨｉｎｄＤＮＡＭａｒｋｅｒ（Ｐｒｏｍｅｇａ公司），ＤＬ２０００ＤＮＡＭａｒｋｅｒ（大连宝生物工程公司）
１．２．２细菌培养试剂
大肠杆菌菌株Ｐ２３９２（浙江大学肿瘤研究所保存），胰化蛋白胨（ｂａｃｔｏ—ｔｙｐｔｏｎｅ）（英国ＯＸＯＩＤ公司），酵母提取物（ｂａｃｔｏ—ｙｅａｓｔｅｘｔｒａｃｔ）（英国ＯＸＯＩＤ公司），ＩＰＴＧ（异丙基硫代一Ｂ—Ｄ一半乳糖苷）（ＢＢＩ公司）
１．２．３ＳＤＳ－ＰＡＧＥ电泳试剂
ＳＤＳ（十二烷基硫酸钠），甲醇，冰乙酸，甘氨酸，Ｔｒｉｓ（三羟甲基氨基甲烷），７，－－胺四乙酸（ＥＤＴＡ）（均为上海生工生物工程公司），无水乙醇（杭州长征化工厂），磷酸氢二钠，磷酸二氢钾（上海新华化工厂），吐温２０（华美生物工程公司），丙烯酰胺（上海生工生物工程公司进口分装），Ｎ。

＿亚甲双丙烯酰胺（上海生工生物工程公司进口分装），二硫苏糖醇（ＤＴＴ）（上海生工生物工程公司），蛋白分子量标准（上海生工生物工程公司），小牛血清白蛋白（ＢＳＡ）（ＮＥＷＥＮＧＬＡＮＤ公司），其它常用试剂如氯化钠、碳酸氢钠、氢氧化钠等系宁波化学试剂厂等生产的国产试剂，分析纯级。

１．３主要实验设备
２ｌ
超净工作台（苏州净化设备公司），细菌恒温摇床（ＯｒｂｉｔａｌＳｈａｋｅｒ）（ＦｏｒｍａＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ公司），ｗＧＰ一３００细菌培养箱（重庆四达实验仪器厂），微量移液器（Ｇｉｌｉｓｏｎ），ＢｉｏｆｕｇｅｐｉＣＯ台式离心机（Ｈｅｒａｅｕｓ），Ｂｉｏｆｕｇｅ２８Ｓ低温高速离心机（Ｈｅｒａｅｕｓ），恒温水浴箱（ＤＫ一８Ｄ型）（上海医用恒温设备厂），恒温水浴箱（ＲＴＥ一１１１）（ＮＥＳＬＡＢＩｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓＩｎｃ．）ＭＰ２００Ａ电子天平（上海第二天平衡器厂），ＡＥ２６０１／１０００电子天平（Ｍｅｔｌｅｒ），雪花状制冰机（美国ＲｏｓｓＴｅｍｐ），ＴＹ—Ｂ型多用脱色摇床（上海市新波无线电厂），７８ＨＷ－１型恒温磁力搅拌器（杭州仪表厂），ＧｅｎｅＱｕａｎｔＩＩ紫外分光光度计（ＰｈａｒｍａｅｉａＢｉｏｔｅｃｈ），水平、垂直电泳仪和电转移仪（Ｂｉｏ—Ｒａｄ公司），真空冷冻干燥仪ＳａｖａｎｔＭｏｄｕｌｙｏ（ＳＡＶＡＮＴ公司），制冰机（ＲｏｓｓＴｅｍｐ公司），７０＂Ｃ烤箱（Ｈｅｒａｅｕｓ），４５℃烤箱（Ｈｅｒａｅｕｓ），一８０＂Ｃ冰箱（Ｓａｎｙｏ），Ｍｉｌ卜Ｑ５０纯水器（Ｍｉｌｉｐｏｒｅ），４＂Ｃ层析柜（Ｎａｔｕｒｅ公司），凝胶图象分析系统ＫａｉｓｅｒＫＳＩ（ＡｌｐｈａＩｎｎｏｔｅｃｈ公司），ＴＨ２一Ｃ恒温振荡器（江苏太仓实验设备厂），ＰＣＲ仪ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲＳｙｓｔｅｍ９６００（ＰＥ公司），ＤＮＡ测序仪ＡＢＩ３７７ＤＮＡＳｅｑｕｅｎｃｅｒ（ＰＥ公司）。

１．４实验试剂的配制
１．４．１ＬＢ培养基
ＬＢ液体培养基：１０克蛋白胨，５克酵母提取物，ｌＯ克ＮａＣＩ，溶于１０００ｍｌ水中，用ＮａＯＨ调ＰＨ至７０，１５磅２０ｍｉｎ，高温湿热灭菌。

ＬＢ固体培养基：在配制好的ＬＢ液体培养基中，按每升ＬＢ加入１５克琼脂，１５磅２０ｍｉｎ，高温湿热灭菌，冷却后加入终浓度为５０ｕｇ／ｍｌ的氨苄青霉素，铺平皿。

１．４．２感受态细菌制备液
ＴＦＢＩ溶液：３０ｍＭＫＡｃ，ＩＯＯｍＭＫＣＩ，１５％甘油
ＴＦＢＩＩ溶液：７５ｍＭＣａＣｌｚ，ＩＯｍＭＫＣＩ，１５％甘油
１．４．３质粒ＤＮＡ的提取用渡
溶液Ｉ：５０ｍＭＧｌｕｃｏｓｅ：２５９ａｎＴｒｉｓ—ＨＣＩ，ｐＨ８．０：ｌＯＭｍｅｄｔａ，ｐＨ８．０
２２。