黄嘌呤氧化酶法优化大鼠血清SOD测定条件的探讨

　第29卷第3期佛山科学技术学院学报(自然科学版)V o l.29N o.3　2011年5月　Jou rnal of Fo shan U n iversity(N atu ral Science Editi on)M ay2011

文章编号:100820171(2011)0320065203

黄嘌呤氧化酶法优化大鼠血清SOD

测定条件的探讨

翁闪凡,张晓林

(佛山科学技术学院检药系,广东佛山528000)

摘要:目的　优化黄嘌呤氧化酶法测定大鼠血清SOD实验条件。方法　采用黄嘌呤氧化酶法,探讨其加样量、方法重复性、显色稳定性、试剂稳定性及样品稳定性等最佳因素。结果　黄嘌呤氧化酶法测定大鼠血清SOD最佳加样量为5Λl,其测定变异系数CV<1%,显色前后20m in吸光度比较(P>0.05);新配试剂与配制3个月试剂做测定,吸光度比较(P<0.01);新鲜标本和4°C放置48h标本进行测定,吸光度比较(P<0.01)。结论　黄嘌呤氧化酶法测定大鼠血清SOD最佳加样量为5Λl,该法重复性好,显色稳定,测定试剂必须新鲜配制,标本必须新鲜制备。

关键词:黄嘌呤氧化酶法;SOD;测定

中图分类号:R446.112 文献标志码:A

自由基作为引起机体组织细胞损伤的重要因素,引起多种疾病发生、发展,日趋受到国内外医学界的认可及重视。超氧化物阴离子是人类机体内重要的自由基,对机体有很大的损伤作用,超氧化物歧化酶(Sup erox ide dis m u tase,SOD)是广泛存在于各类生物体内的酸性金属酶,催化生物体内超氧自由基(O-2)发生歧化反应,是机体内O-2的天然消除剂,对机体细胞起保护作用。近年来对抗氧化的动物实验研究越来越多,因此建立SOD活性的测定方法,并对其进行方法学探讨显得尤为重要。目前,SOD活性测定主要有黄嘌呤氧化酶法、邻苯三酚自氧化法、羟胺发色法、四氮唑蓝(NB T)显色法、化学发光法[1],笔者主要对黄嘌呤氧化酶法测定大鼠血清SOD进行方法学探讨。

SOD测定试剂盒(南京建成生物工程研究所提供,批号:20100107);722分光光度计;微量加样器;吸嘴;试管。

1　实验原理

通过黄嘌呤及黄嘌呤氧化酶反应系统产生的超氧阴离子自由基(O-2),后者氧化羟胺形成亚硝酸盐,在显色剂的作用下呈现紫红色,用可见分光光度计检测其吸光度。当被测样品中含SOD时,则对超氧阴离子自由基(O-2)有专一性抑制作用,使形成的亚硝酸盐减少,比色时测定管的吸光度值低于对照管的吸光度值,通过公式计算可求出被测样品中的SOD活力。

2　实验方法及结果

2.1　加样量

2.1.1　方法

取大鼠新鲜血清20例,将加样量分为3Λl、4Λl、5Λl、6Λl4组,根据说明书中提供的抑制率参考范围

收稿日期:2011203229

基金项目:广东省自然科学基金资助项目(7010421)

作者简介:翁闪凡(19752),女,广东佛山人,佛山科学技术学院讲师。

为48%～55%,确定最佳加样量。

抑制率=(对照管吸光度-测定管吸光度) 对照管吸光度。

2.1.2　结果

结果见表1。

表1　大鼠血清SOD活力测定加样量

组别3Λl4Λl5Λl6Λl 抑制率 %(x±s)18.35±0.9125.51±1.4351.40±1.9660.12±3.45

结果表明,最佳加样量为5Λl。

2.2　重复性

取20例大鼠血清3平行测定,结果吸光度(A)为0.475±0.001,变异系数(CV,%)为0.077±0.087,由此可见,其变异系数(CV)<1%,该法重复性很好,精密度高。

2.3　显色稳定性

2.3.1　方法

取新鲜样本20例,分显色组与显色20m in组来测定其吸光度,做t检验。

2.3.2　结果

结果见表2。结果表明:显色组与显色20m in组其吸光度(A)比较P>0.05,两组无显著性差别,该法显色稳定性较好。

2.4　试剂稳定性

2.4.1　方法

将新鲜试剂和存放3个月的试剂(旧试剂)分成两组,大鼠新鲜血清测定其吸光度(A),做t检验,得出P值。

2.4.2　结果

结果见表3。结果表明:新鲜试剂组与旧试剂组吸光度(A)比较P<0.01,两组有显著性差别,表明该法测定试剂必须新鲜配置。

表2　大鼠血清SOD活力测定显色稳定性

组别吸光度

显色组0.470±0.112

显色20m in组0.484±0.107 P值0.889

表3　大鼠血清SOD活力测定试剂稳定性组别吸光度

新鲜试剂组0.53±0.06

旧试剂组0.61±0.01

P值0.008

2.5　样本稳定性

2.5.1　方法

取大鼠新鲜血清20例,分新鲜血清组和4°C放置48h血清组(大鼠陈旧血清组)两组,测定其吸光度值(A),做t检验,得出P值。

2.5.2　结果

结果见表4。结果表明:大鼠新鲜血清组和大鼠陈旧血清组吸光度(A)比较P<0.01,两组有显著性差别,表明测定标本必须新鲜,否则对测定影响很大。

表4　大鼠血清SOD活力测定样本稳定性

组别吸光度

大鼠新鲜血清组0.50±0.11

大鼠陈旧血清组0.30±0.06

P值0.00

3　讨论

SOD有胞浆的铜锌SOD(Cu,Zn2SOD),线粒体内的锰SOD(M n2SOD),胞外的SOD(EC2SOD)3种[2],作为生物机体抗氧化酶系统中重要的抗氧化酶之一,SOD是生物体内重要的超氧阴离子自由基清除剂,其主要作用是能专一地清除生物氧化中产生的超氧阴离子自由基,有助于减少和阻止脂质的过氧化反应,延缓机体衰老及防止生物大分子损伤。目前研究发现,SOD与呼吸系统、循环系统、消化系66佛山科学技术学院学报(自然科学版) 第29卷