纳米生物医学分析技术

检出限时的信号值
Sm Sbl ksbl
噪音的平均值 k=3时，置信度为95%。
对空白n次测定的标准偏差
S m Sbl qm m
S m Sbl Cm m
4、线性范围(linear range) 从定量测定的最低浓度扩展到校正曲线偏离线性的浓度范围。 from the lowest concentration at which quantitative measurements can be made (LOQ)to the concentration at which the calibration curve departs from linearity(LOL).
• 当物质颗粒尺寸小于入射光波长，产生拉 曼散射和瑞利散射。
• 弹性碰撞时 无能量交换，且不改变频率， 仅改变运动方向，称瑞利散射；
• 非弹性碰撞不但改变方向，还有能量交换 和频率改变，称拉曼散射。
• Raman光谱法分辨率高，重现性好，简单快速，具有 以下特点：
1. 适合水体系的研究，尤其对生物样品和无机物的研究 远较红外吸收光谱方便。 2. 一次可同时覆盖50～4000 cm-1 波数的区间。 3. Raman光谱谱峰清晰尖锐，更适合定量研究。尤其是 共振Raman光谱，灵敏度高，检出限可到10-6～10-8 mol· L-1。 4. Raman光谱所需样品量少，g级即可。
0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
l
B. 发射光谱(荧光光谱)
固定激发波长 扫描发射波长 发射光谱的形状与激发波长无关：
IF4800
4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
纳米生物医学分析技术
马志亚 zhiyama@hust.edu.cn
课程安排
• 学时：32学时
• 考试成绩（70%）+平时成绩（30%） • 平时成绩构成：出勤率+课堂报告
• 每个人根据一篇相关文献，在课堂做10-20 分钟的报告（以ppt形式），报告语言中英 文均可
课程内容
• • • • 基础知识 纳米生物医学分析 纳米生物医学成像 纳米医学诊断与治疗
Healthy cells Near-infrared light
Healthy cells
Dead cancer cells
Intact healthy cells
基础知识
1 分析方法的性能指标
• • • • • 精密度 灵敏度 检出限 线性范围 选择性
1、精密度(precision) 用同样的方法所测得数据间相互一致性的程度，它代表了仪器的重现性 (reproducibility)。IUPAC规定，用相对标准偏差(relative standard deviation, RSD)来度 量。 the degree of mutual agreement among data that have been obtained in the same way
• 核酸是一种多聚核苷酸，基本结构单位是 核苷酸。
• 核酸中的戊糖有两类：D-核糖（DNA）和D2-脱氧核糖（RNA）
DNA的双螺旋结构
核酸分子杂交
• DNA的变性（denaturation）：双链DNA在加热 或碱的存在下解离成两条单链DNA的过程。热 变性中DNA解链一半时的温度叫变性温度Tm。 • DNA的复性或退火（annealing）：变性的DNA 在缓慢降低温度恢复原始的双螺旋结构的过程。 • 核酸分子杂交：两条单链DNA分子经退火形成 双链DNA的现象叫核酸分子杂交。核酸分子杂 交不仅可以在两条互补的DNA链间进行，也可 以在互补的DNA和RNA直接进行。
固定lem=620nm(MAX)
1→ 4 1→ 3 1→ 2
固定lex=290nm (MAX)
1→1 1→2
1→4
1→4
0 200 250 300 350 400 450 1→500 1 550 600 650 700 750 800 850 900
lex =290nm (MAX)
l
lem= 620nm(MAX)
举例：鲁米诺化学发光体系
O NH NH NH2 O catalyst H2O2 / OH-
O O- + N 2+ O NH2 O
Blue Light
举例：过氧草酸酯化学发光体系
Ar O C C O Ar H2O2 O O F
2 ArOH +
O -O + . F. C C O O F+
F * + 2 CO2
T1
S1 能 量 吸 收
T2
２. 无辐射跃迁的类型 振动弛豫: Vr 10-12sec 外 转 移:无辐射跃迁 回到基态 内 转 移:S2~S1能级之
发 射 荧 光
外转换
发 射 磷 振动弛豫 光
S0
l1
l2
l 2
Biblioteka Baidul3
间有重叠 系间窜跃: S1~T1能级之 间有重叠 反系间窜跃:由外部获 取能量后 T1 ~ S1
C.发射光谱(磷光光谱)
与发射光谱相同条件下的磷光光谱
IF4800
4400 4000 3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400 0 200 250 300 350 400 450 500 550 600 650 700 750 800 850 900
激发光谱
发射光谱
l
化学/生物发光
某些物质在进行化学反应时，由于吸收了反应时产生
的化学能，而使反应产物分子激发至激发态，受激分子由 激发态回到基态时，便发出一定波长的光。这种吸收化学 能使分子发光的过程称为化学发光。利用化学发光反应而
建立起来的分析方法称为化学发光分析法。化学发光也发 生于生命体系，这种发光称为生物发光。
生物学基础
• 蛋白质
• 核酸
• 免疫分析
蛋白质
• 蛋白质是主要由α-氨基酸组成的一类生物大 分子。 • α-氨基酸
• 多肽（peptide）：氨基酸之间通过各自的 氨基或羧基缩合，以酰胺键（即肽键）形 成的氨基酸聚合物片段。
蛋白质的结构
• 酶：是生物体内产生的具有催化功能的蛋 白质。
Bionano-machine / Nano-Robot
纳米生物分析技术
• 提高检测的灵敏度
• 快速、方便、便携、省钱
• 实现疾病的早期诊断和治疗
从宏观世界到微观世界
基因检测
生物成像
分子影像
药物输送
Nanoshells
癌症治疗
Nanoshells Cancer cells
Cancer cells
测定信号
S mc Sblank
S 斜率
样品浓度 仪器空白信号
c
3、检出限(detection limit) 以适当的置信概率被检出的组分的最小量或最小浓度。 the minimum mass or concentration of analyte that can be detected at a known confidence level.
green light
举例：荧光素酶生物发光体系
N OS
N S
CO2H
[ATPMg]2-/ O2
luciferase N OS N S O+ AMP + CO2 +
Yellow Light
激光拉曼光谱分析法
• 光是电磁辐射，其作用于物质，光子与物 质分子发生碰撞时，产生散射光。 • 当物质颗粒尺寸等于或大于入射光波长， 产生丁达尔散射。
激发光谱和荧光、磷光光谱
荧光和磷光均为光致发光，因此必须选择合适的激发光 波长，可根据它们的激发光谱曲线来确定。绘制激发光谱曲 线时，固定测量波长为荧光（或磷光）最大发射波长，然后 改变激发波长，根据所测得的荧光（磷光）强度与激发光波 长的关系，即可绘制 激发光谱曲线。 如果固定激发光波长为其最大激发波长，然后测定不同 的波长时所发射的荧光或磷光强度，即可绘制荧光或磷光光 谱曲线。 在荧光和磷光的产生过程中，由于存在各种形式的无辐射 跃迁，损失能量，所以它们的最大发射波长都向长波方向移 动，以磷光波长的移动最多，而且它的强度也相对较弱。
二. 分子荧光(磷光)光谱
1. 荧光(磷光)激发光谱与发射光谱
IF4800
A. 激发光谱
4400 4000
固定lem=620nm(MAX)
固定发射波长 扫描激发波长
荧光激发光谱与 紫外-可见吸收光 谱类似
3600 3200 2800 2400 2000 1600 1200 800 400
lex =290nm (MAX)
ε：摩尔吸光系数，单位L· mol－１· cm－１；
或: A＝lg（I0/It)= a b c
c：溶液的浓度，单位g· L－１
a：吸光系数，单位L· g－１· cm－１ a与ε的关系为：
a =ε/M
（M为摩尔质量）
荧光（磷光）光谱法
１. 辐射跃迁的类型
内转换
S2
内转换 振动弛豫 系间跨越
共振荧光：10-12 sec 荧 光：10-8 sec 磷 光：1~10-4 sec 迟滞荧光:102~10-4 sec
Nano-Bio Convergence
Bio-inspired device and system
Bio-Technology
Molecular Imaging
Nano-Technol
Molecular Switch
DNA barcode Biochip / Biosensor
Nanotherapy / Delivery
相对标准偏差
绝对标准偏差
dr s / x
2
n次测量平均值
s
( xi x )
i 1
n
n 1
x
x
i 1
n
i
n
2、灵敏度(sensitivity) 区别具有微小差异浓度分析物能力的度量，IUPAC规定：定量测定浓度范围内校正 曲线的斜率。 a measure of its ability to discriminate between small differences in analyte concentration 灵敏度的两个制约因素： 校正曲线的斜率和仪器的精密度
• 表面增强Raman光谱(SERS)
• 将试样吸附在金、银、铜等金属的粗糙表面或胶粒上可 大大增强其Raman光谱信号，基于这种具有表面选择性 的增强效应而建立的方法为表面增强Raman光谱法。 • 该法可使某些Raman线的增强因子达104～108。 • 将表面增强Raman光谱和共振Raman光谱技术联用时， 其检出限可达10-9～10-12 mol L-1。
2 光谱学方法
• 紫外－可见分子吸收光谱法（UV-Vis） • 荧光光谱 • 拉曼光谱
紫外－可见分子吸收光谱法（UV-Vis）
定性分析
定量分析
朗伯—比耳定律
A＝lg（I0/It)= εb c
式中A：吸光度；描述溶液对光的吸收程度；
b：液层厚度(光程长度)，通常以cm为单位；
c：溶液的摩尔浓度，单位mol· L－１；
5. 由于共振Raman光谱中谱线的增强是选择性的，因此 可用于研究发色基团的局部结构特征。
• 共振Raman光谱 • 当入射激光波长与待测分子的某个电子吸收 峰接近或重合时，Raman跃迁的概率大大增 加，使这一分子的某个或几个特征Raman谱 带强度可达到正常Raman谱带的104~106倍， 这种现象称为共振Raman（Resonance Raman） 效应。基于共振Raman效应建立的Raman光 谱法称共振Raman光谱法。 • 共振Raman光谱有利于低浓度和微量样品的 检测，最低检出浓度约为10-6～10-8 mol L-1。
• 酶具有高度的特异性，酶对于其催化的对 象有高度的选择性，也即底物的专一性。 底物（substrate）就是接受酶的作用引起化 学反应的物质。
蛋白质的电泳分离及鉴定
蛋白质分析的意义
• 基础科学研究
• 健康评价、疾病诊断（生物标志物、蛋白 质组）
核酸
• 核酸的主要功能是贮存、传递和表达生物体的 遗传性状。 • 核酸分为脱氧核糖核酸(DNA)和核糖核酸(RNA) 两大类。
S c
5、选择性(selectivity) 方法不受基体中所含其它类物质干扰的程度。 degree to which the method is free from interference by other species contained in the sample matrix.
特异性(specificity) 在生物医学分析中，常常用特异性替代选择性 来评价。 the ability of assay to distinguish between different types of stimuli