19579617_抑郁障碍与5-羟色胺转运体SLC6A4基因多态性的相关性分析

㊃论 著㊃
[收稿日期]2018-12-24;[修回日期]2019-02-22
[基金项目]内蒙古自治区科技计划项目(201602100
)[作者简介]张川江(1978-)
,男,重庆开县人,内蒙古自治区精神卫生中心副主任医师,医学学士,从事精神疾病诊治研究㊂
*通信作者㊂E -m a i l :c l x 001@s o h u .c o m
抑郁障碍与5-羟色胺转运体S L C 6A 4基因多态性的
相关性分析
张川江,杨培锋,刘荣馨,贺金花,陈丽霞*
(内蒙古自治区精神卫生中心抑郁症治疗中心心身科,内蒙古呼和浩特010010
) [摘要] 目的针对抑郁障碍与5-羟色胺转运体S L C 6A 4基因多态性进行生物信息学及分子流行病学层面的相关性分析㊂方法运用生物信息学及分子流行病学的研究方法,先借助相关数据库判定出单核苷酸多态性(s i n g l en u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m ,S N P )位点,运用聚合酶链式反应(p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n ,P C R )扩增㊁W e s t e r n b l o t 进一步验证结论,并在此基础上进行抑郁障碍与5-羟色胺转运体S L C 6A 4基因多态性的差异分析㊂结果生物信息学方法分析得到2个符合研究要求的S N P 位点(r s 25531及5-H T T L P R );P C R 扩增产物测序后共发现7种
基因型(分别为S A S A 468b p ,S A S G 468b p ㊁100b p ,S A L A 468b p ,S A L G 468b p ,L A L A 468b p ,L A L G 468b p ,L G L G
468b p ),r s 25531及5-H T T L P R 两倍点等位基因单倍型发现,2个位点共构成4种单倍型(S -A ㊁S -G ㊁L -A ㊁L -G );r s 25531及5-H T T L P R 基因多态性在不同抑郁等级人群当中的分布差异㊁两倍点等位基因单倍型在不同抑郁等级组之间的差异均无统计学意义(P >0.05)㊂结论r s 25531及5-H T T L P R 基因多态性与抑郁障碍不具有统计学层面相关性,但具有生物学层面的相关性,其机制有待进一步验证㊂
[关键词] 抑郁;基因检测;5-羟色胺转运体 d o i :10.3969/j
.i s s n .1007-3205.2019.09.022 [中图分类号] R 749.42 [文献标志码] B [文章编号] 1007-3205(2019)09-1079-04
抑郁症是一种人群中具有较高流行性的精神疾
病,患者通常表现为诱因不充分的情绪低落,且低落
状态具有一定的持续性[
1
]㊂抑郁症的诱发因素广泛而复杂,而且诱发抑郁症的矛盾大多属于内源性,即通常外界环境改变的刺激很难对抑郁症患者形成非
常明显的疗效[
2]
㊂基因多态性是生物群体中存在两种或多种不连续的变异型或基因型或等位基因的现象,亦称遗传多态性,其本质是基因水平的变异,一般发生在基因序列中不编码蛋白的区域和没有重要
调节功能的区域[3]
㊂对于个体而言,基因多态性碱
基顺序终生不变,并按孟德尔规律世代相传㊂疾病基因多态性与临床表型多样性的联系已受到重视,如肿瘤等多基因病的临床表型往往多样化,基因型与表型之间的联系对探索疾病的发生机制㊁预测疾
病的转归等均具有重要意义[4]
㊂据研究报道,5-
羟色胺转运体S L C 6A 4基因与多种精神类病理性情
感变化存在相关且不存在明显的人群聚集性[
5
]㊂说明研究结论的外推性已经得到流行病学层面的验
证,但其具体作用机制有待进一步探讨㊂单核苷酸多态性(s i n g l e n u c l e o t i d e p o l y m o r p h i s m ,S N P )是指基因组D N A 中某一特定核苷酸位置发生了转换㊁
颠倒㊁缺失和插入等变化而引起的序列多态性,同时单核苷酸多态性具有数量大㊁分布广㊁稳定性强㊁易于分型等优点,5-羟色胺转运体S L C 6A 4基因多态性在精神卫生类疾病的诊断及治疗㊁致病基因的发现㊁族群的演化研究等方面起到了重要作用[
6-7]
㊂因此,本研究拟针对抑郁障碍与5-羟色胺转运体S L C 6A 4基因多态性进行生物信息学及分子流行病
学层面的相关性分析㊂1 资料与方法
1.1 一般资料 收集2017年5月 2018年1月在内蒙古自治区精神卫生中心接受治疗的抑郁症患者203例,男性79例,女性124例,年龄32~54岁,
平均(42.08ʃ8.17)岁㊂本研究采用随机原则进行研究对象的选取,在告知受试对象研究目的并取得其同意签字后方进行研究㊂本研究中所有健康人群(无抑郁)共228例,男性109例,女性119例,
年龄30~56岁,平均(43.09ʃ8.02)
岁㊂2组性别㊁年龄差异均无统计学意义(P >0.05
),具有可比性㊂1.2 抑郁症判定标准和剔除标准 抑郁症的判定标准采用专门的‘抑郁自评量表“[8
],该量表包含20
㊃
9701㊃第40卷第9期
2019年9月
河
北
医
科
大
学
学
报
J O U R N A L O F H E B E I M E D I C A L U N I V E R S I T Y
V o l .40 N o .9
S e p
t . 2019
个条目,按照中国常模结果,该量表标准分的分界值为53分,其中53~62分判定为轻度抑郁,63~72分判定为中度抑郁,72分以上判定为重度抑郁㊂如下情况的受试者需剔除:①存在交流障碍;②有吸毒史;③1年内接受过同类型研究㊂最终纳入有效研究对象203例㊂
本研究经医院医学伦理委员会批准㊂
1.3研究方法
1.3.1查询利用N C B I中的G e n e获得已有文献报道的抑郁情感障碍人群S L C6A4基因所有的S N P位点;再利用人类基因组数据库E N S E M B L E,获得大众人群S L C6A4基因所有的S N P位点㊂S L C6A4统计学分析:对所得的人群和大众人群的S L C6A4所有S N P位点进行归类统计和特征分析㊂
1.3.2S L C6A4同源基因的序列比对与进化树分析
①同源基因获取:利用N C B I中的H o m o l o G e n e 数据库可查询得到㊂②同源基因的序列比对:将获取的物种序列文件导入B i o E d i t软件,利用其附带的C l u s t a W多重序列比对工具,进行同源基因比对㊂③进化树分析:利用之前B i o E d i t比对好的序列,运用M E G A软件,选择最大似然法则,构建系统发生树,进化分析结果可显示出人类S L C6A4基因与其他物种的同源关系强度㊂
1.3.3S N P与抑郁情感障碍相关潜在位点分析
①筛选S N P位点:第一步,根据突变发生类型,初筛人群中S L C6A4基因所有的S N P位点,得到发生非同义突变的S N P位点;第二步,根据突变对蛋白质结构功能的影响,筛选大众人群中S L C6A4基因所有的S N P位点,得到对蛋白质结构功能造成破坏的S N P位点;第三步,结合2次筛选结果,得到对蛋白质结构功能造成破坏的S N P位点㊂②找寻保守氨基酸:在同源基因序列比对的结果中,比较从斑马鱼(数据库中记录的最低等生物)到人类的S L C6A4蛋白序列,确定氨基酸种类保持不变的序列位置,从而到保守氨基酸(保守氨基酸,是指在物种进化过程中,该蛋白序列某位置上的氨基酸种类保持不变,即保守性为100%)㊂③对比分析:结合得到的保守氨基酸序列,在筛选出的S N P位点中找寻相应的突变点,最终获得关键的S N P位点㊂
1.3.4分子流行病学验证方法聚合酶链式反应(p o l y m e r a s e c h a i n r e a c t i o n,P C R)扩增:取患者空腹静脉血10m L,3000r/m i n离心取上清,等量分装为4份于-20ħ低温环境下保存以供不同检测所需㊂用20μLT E缓冲液溶解后采用P C R法检测标本中m R N A的存在㊂P C R反应具体条件:根据N C B I中G e n b a n k库的相关基因序列生物信息学数据设计引物,由上海其明生物有限公司合成㊂上游引物序列为:5'-G T T C A G G T A G C G A T G A G C T A-G C A A C-3';下游引物序列为:5'-C T G C A T G C A-G T G A G C A G A G A G C G T C-3';引物长度592b p;反应温度:95ħ,60s/55ħ,30s/75ħ,60s,持续40个循环后于75ħ条件下延伸10m i n㊂试剂盒中所提供探针均为S L C6A4基因突变探针与内参基因探针2种荧光探针的混合物,每个反应中检测通道设置按说明书进行㊂
W e s t e r nb l o t验证:扩增产物采用W e s t e r n b l o t法进行蛋白产物的定性和定量分析㊂具体步骤:①将电泳后的凝胶从玻璃板上剥脱下来,置于煮胶盒,加入25%乙醇至乙醇浸过凝胶面为止,将煮胶盒放入微波炉,高温煮沸2.5m i n,重复该步骤3次;②加入考马斯亮蓝染色液(至染色液浸过凝胶面为止)浸泡凝胶,放室温摇床缓慢振荡,均匀染色30 m i n至凝胶上的条带清晰可见;③用双蒸水漂洗已染色的凝胶后,加入5%的醋酸与25%乙醇混合液,脱色摇床缓慢摇动1h左右至染色液基本洗脱为止;④脱色完毕后,将凝胶用双蒸水冲洗,置于凝胶图像扫描分析仪上观察结果,经图像软件处理后拍照保存㊂
1.4统计学方法应用S P S S19.0统计软件分析数据㊂计数资料比较采用χ2检验;采用H a r d y-W e i n b e r g平衡检验结果判定样本的群体代表性㊂P<0.05为差异有统计学意义㊂
2结果
2.1基因型分析按照生物信息学方法分析得到2个符合研究要求的S N P位点,分别为r s25531及5-H T T L P R,P C R扩增产物测序后共发现7种基因型,分别为S A S A468b p,S A S G468b p㊁100b p,S A L A468b p, S A L G468b p,L A L A468b p,L A L G468b p,L G L G468b p,见表1㊂
r s25531及5-H T T L P R的W e s t e r nb l o t结果见图1㊂
㊃0801㊃河北医科大学学报第40卷第9期
表1 r s 25531及5-H T T L P R 两倍点单倍型分布
(例数)
组别例数S A S A S A S G S A L A
S A L G L A L A L A L G L G L G 无抑郁 2282081321121轻度抑郁6452131511中度抑郁6757201412重度抑郁
72
63
1
2
5
1
χ
2值
17.563P 值
0.485图1 r s 25531及5-H T T L P R 的W e s t e r nb l o t 结果
1.D N A M a r k e r ;
2.S A S A ;
3.S A S G ;
4.S A L A ;
5.S A L G ;
6.L A L A ;
7.L A L G ;8.L G L G
2.2 r s 25531及5-H T T L P R 两倍点单倍型分布
分析r s 25531及5-H T T L P R 两倍点等位基因单倍
型发现,2个位点共构成4种单倍型(S -A ㊁S -G ㊁L -A ㊁L -G )
,两倍点等位基因单倍型在不同抑郁等级组之间的差异均无统计学意义(P >0.05
),见表2㊂2.3 各组在r s 25531及5-H T T L P R 位点的基因型
和等位基因分布 r s 25531和5-H T T L P R 位点上基因型和等位基因在不同抑郁等级人群当中的分布
差异均无统计学意义(P >0.05
),见表3㊂表2 r s 25531及5-H T T L P R 两倍点单倍型分布情况
组别
例数S -A
S -G L -A L -G 无抑郁 2284221276轻度抑郁641091144中度抑郁6711729
6重度抑郁
72
129
123
χ
2值14.458P 值
0.107
表3 各组r s 25531及5-H T T L P R 位点上基因型和等位基因分布
组别例数s 25531基因型
G A G G A A
s 25531等位基因G
A
5-H T T L P R 基因型
S L L L S S
5-H T T L P R 等位基因
S
L
无抑郁 2286202024641051920441343轻度抑郁64175615113175611313中度抑郁67275816118185811717重度抑郁
72
4
8
60
20
1243
9
60
12321χ21值=2.765 χ22值=1.396 χ23
值=6.525χ21值=3.073 χ22值=2.020 χ23
值=3.440P 1值=0.838 P 2值=0.707 P 3值=0.089
P 1值=0.800 P 2值=0.568 P 3值=0.329
注:χ21值与P 1值代表A A /G A /G G (S S /L S /L L )基因型比较结果;χ22值与P 2值代表G A+G G (S L +L L )基因型比较结果;χ23
值与P 3值代表等位基因比较结果
3 讨 论
大量的证据表明抑郁症具有基因流行病学病因基础,基因组连锁分析和全基因组关联研究均支持易于发生的基因致病因素理论;近年来有很多针对抑郁症的基因关联性研究,其中包括对5-羟色胺再摄取抑制相关机制的研究和分析[
9-10]
㊂本研究联合生物信息学及分子流行病学方法分析S L C 6A 4
与抑郁障碍的关系,结果显示r s 25531及5-H T T L P R 基因多态性在不同抑郁等级人群当中的分布差异均无统计学意义㊂与相关研究报道的结果
有一定相似性[
11-14]
㊂从对生物的遗传性状的影响上来看,S N P 又分为2种:一种为同义S N P ,它所导致的编码序列改变并不影响其所翻译的蛋白质的氨
基酸序列,突变碱基与未突变碱基的含义相同,在本研究中分析r s 25531及5-H T T L P R 两倍点等位基因单倍型的过程中,两倍点等位基因单倍型在不同抑郁等级组之间的差异无统计学意义,说明不同分型的两倍点等位基因单倍型患者的r s 25531及5-
H T T L P R 的蛋白表达产物并无本质上的不同;
另一种为非同义S N P 占50%左右,指碱基序列的改变可使翻译的蛋白质序列发生改变,从而影响了蛋白质的功能,这种改变常是导致生物性状改变的直接
原因[15]
㊂表明r s 25531及5-H T T L P R 发生同义突
变的可能性相对较大㊂
本研究结果还显示S L C 6A 4中突变率较高的2
个位点r s 25531及5-H T T L P R 基因多态性在不同
抑郁障碍人群间差异无统计学意义㊂由于诸多研究
㊃
1801㊃河北医科大学学报 第40卷 第9期
报道S L C6A4在多种精神疾病的发生发展中具有重要意义[3,11-14],故其S N P在人群中的突变体可能有潜在疾病的高风险,但就疾病发生机制而言,S N P 与抑郁障碍的发生尚未确定直接的因果关系㊂有学者发现位于人类5-羟色胺受体D2上的同义突变C957T可以改变m R N A的构象[9],从而降低m R N A的稳定性和翻译效率,导致5-羟色胺介导的5-羟色胺受体D2的表达减少,且该现象与精神分裂症和酒精中毒的发病有关,故同义突变也可能通过转录㊁转录后水平,翻译及翻译后修饰等多环节中某些步骤影响蛋白质的功能而导致疾病的发生㊂但从本研究得到的结论来看,虽然r s25531及5-H T T L P R均在S L C6A4中发生特异性表达,但其与表达的定性和定量结果与抑郁症发生与否尚无直接的因果关联[15-16]㊂
此外,本研究分析r s25531及5-H T T L P R两倍点等位基因单倍型显示,2个位点共构成4种单倍型(S-A㊁S-G㊁L-A㊁L-G),两倍点等位基因单倍型在不同抑郁等级组之间的差异无统计学意义㊂但就本研究得到的结论来看,虽然r s25531及5-H T T L P R 经P C R扩增测序后发现了7种基因型,且均表达特异蛋白,但两倍点等位基因单倍型在不同抑郁等级组之间的差异无统计学意义㊂说明这7种基因型并不能作为筛检抑郁情感障碍的直接依据,这种作用机制需要进一步结合遗传理论及孟德尔随机化研究进行验证㊂
综上所述,r s25531及5-H T T L P R基因多态性的发现虽然对于抑郁情感障碍的筛检具有一定意义,但其因果关系及判定价值仍需进一步验证㊂[参考文献]
[1]王宁,刘烟,陈冉,等.团体绘画治疗对青少年抑郁症患者自尊
水平及认知功能的影响[J].河北医科大学学报,2018,39
(10):1220-1224.
[2]梁敏.嗅觉通路与抑郁症关系的研究进展[J].河北医科大学
学报,2018,39(3):368-372.
[3]关小妮,张克让,崔勇,等.5-羟色胺转运体基因L P R及5-羟
色胺1A受体C(-1019)G基因多态性的联合作用与重性抑郁
症的关联研究[J].四川精神卫生,2017,30(3):248-252.
[4]闵文蛟,周波,马敏,等.5-羟色胺转运蛋白基因多态性与抑郁
症临床表型的关联性[J].中华行为医学与脑科学杂志,2016,
25(9):797-802.
[5]王雪梅,赵青,陈文,等.中国汉族人群强迫症的外周S L C6A4
基因表达[J].上海精神医学,2017,29(3):146-152. [6]乔冬冬.中国汉族人群H T R3B基因多态性与抑郁障碍及其
认知功能的相关性研究[D].济南:山东大学,2015. [7]刘伟伟,潘旭东,马爱军,等.S L C6A4基因多态性与中国北方
人群帕金森病合并抑郁的相关性[J].脑与神经疾病杂志,
2016,24(12):739-743.
[8]杨丽,侯洁,刘新春,等.情绪反应性量表中文版的信效度检验
[J].中国临床心理学杂志,2018,26(2):264-267.
[9] M e n d o n c a M S,M a n g i a v a c c h i P M,D e S o u s a P F,e t a l.
E p i g e n e t i c v a r i a t i o n a t t h e S L C6A4g e n e p r o m o t e r i nm o t h e r-
c h i l
d p a i r s w i t h m a j o r d
e p r e s s i v e d i s o r d e r[J].J A
f f e c t
D i s o r d,2019,245:716-723.
[10] L a m D,A n c e l i n M L,R i t c h i e K,e ta l.G e n o t y p e-d e p e n d e n t
a s s o c i a t i o n s
b e t w e e ns e r o t o n i nt r a n s p o r t e r g e n e(S L C6A4)
D N A m e t h y l a t i o n a n d l a t e-l i f e d e p r e s s i o n[J].B M C
P s y c h i a t r y,2018,18(1):282.
[11] B e v e r s d o r fD Q,C a r p e n t e rA L,A l e x a n d e r J K,e t a l.I n f l u e n c e
o f s e r o t o n i nt r a n s p o r t e rS L C6A4g e n o t y p eo nt h ee f f e c to f
p s y c h o s o c i a l s t r e s s o nc o g n i t i v e p e r f o r m a n c e:a ne x p l o r a t o r y
p i l o t s t u d y[J].C o g nB e h a vN e u r o l,2018,31(2):79-85.
[12]刘尧.S L C6A4和C OM T v a l l58m e t基因多态性与癔球症临床
特征及其抗抑郁疗效的关联研究[D].广州:广州医科大学,
2017.
[13] K o w a l s k a M,K a p e l u s i a k-P i e l o k M,G r z e l a k T,e ta l.T h e
N e w*G29A a n d G1222A o f H C R T R1,5-H T T L P R o f
S L C6A4p o l y m o r p h i s m s a n d h y p o c r e t i n-1,s e r o t o n i n
c o n c e n t r a t i o n s i nm i g r a i n e p a t i e n t s[J].F r o n tM o lN e u r o s c i,
2018,11:191.
[14] A m a d o r MH B,M c D o n a l d M D.M o l e c u l a r a n d f u n c t i o n a l
c h a r a c t e r i z a t i o no ft h e G u l ft o a
d f i s h s
e r o t o n i n t r a n s p o r t e r
S L C6A4[J].JE x p B i o l,2018,221(P t7).p i i:j e b170928. [15]蒋刈,戴朴,韩东一.单核苷酸多态性在人类基因组学发展中
的应用[J].中华耳科学杂志,2017,15(2):239-244. [16]陈璐,马靖松,杨艳杰,等.T P H2G1463A基因多态性与女性
抑郁及自杀行为的关联研究[J].中国妇幼保健,2013,28
(15):2451-2454.
(本文编辑:许卓文)
㊃2801㊃张川江等抑郁障碍与5-羟色胺转运体S L C6A4基因多态性的相关性分析。